注射器型微生物培養裝置的制作方法

專利名稱：注射器型微生物培養裝置的制作方法
注射器型微生物培養裝置技術領域涉及用于簡便且迅速檢測樣本中的食物中毒病原菌的裝置。
背景技術：
食品的生產、流通及銷售過程中混入食品的食物中毒病原菌屢次在食 品中繁殖而引起重度食物中毒。通常，從事食品生產、流通及銷售的食品從業者通過導入HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point:危害要因分析和嚴格管理點)系統，確認不存在食物中毒病原菌之后，才進行食 品的安全供給。然而，隨著流通部件的發展等因素，未等檢查結果出來而 食品已然到達消費者手中，這是導致食物中毒多發的原因之一 。同樣，對于臨床試驗中所用的材料而言，為了對傳染病的早期診斷、 傳染病的治療方法及其預防對策手段迅速作出決定，也需要迅速檢測出傳 染病病原菌。通常，如非專利文獻1的"微生物篇"中所記載，含食物中毒病原菌 等特定細菌的微生物至少經過特定細菌的前富集(前増菌)、及選擇富集 培養而檢測出。為了對特定細菌進行確認，需要進一步進行特定細菌的分 離培養、及確認培養，需要將被懷疑為目標菌的菌落隔離，對于所得到的 菌落，需要通過生化學、血清學上的試驗等確定菌種。例如，在檢測沙門氏屬菌時，被檢樣本試樣首先在緩沖蛋白胨水(BPW ) 中進行前培養。然后，采用沙門氏屬菌用Rappapore-Vassiliadis培養基(RV 培養基)等進行選擇富集培養。進一步，采用mlcb瓊脂培養基等進行分 離鑒別培養，得到認為是沙門氏屬菌的菌落。對于所得到的菌落，需要采用tsi培養基、sim培養基、賴氨酸脫羧培養基(U 、:/y脫炭酸培地)等進行確認培養。進一步，對于進行了確認培養的菌落而言，在采用VP半流 動培養基、西蒙茲氏檸檬酸鹽培養基(、>千>乂。夕工:/酸塩培地)等對 菌種進行鑒定之后，還需要采用市售的血清進行血清型號的甑別。為了進 行含這些繁復的系列操作的檢測，需要5日以上的天數。這并不限于沙門氏屬菌，對于屬于其他屬的微生物也是同樣。為了檢測這樣的特定微生物，已報告有很多種簡單方法。這些方法包含對隨著微生物的繁殖而產生的培養基的阻抗變化、培養液的pH的變化、耗氧量或者產生碳酸氣體量等進行測定，基于這些測定值，由事先確定的 這些的測定值和微生物細胞數之間存在的相關關系，求得微生物數的方法。 另外，還有利用與目標微生物特異性結合的單克隆抗體的方法、利用免疫色i普法的方法等。專利文獻1中記載了利用選擇培養基和目標細菌的運動性填充半流動 選擇培養基的容器及利用該容器的沙門氏菌的檢測方法。專利文獻2記載了利用新生霉素和三苯曱烷類染料的沙門氏菌的檢測 方法。[專利文獻1]JP特開2001-136998號公報 [專利文獻2] JP特公平7-73513號公報l非專利文獻l] 食品衛生檢查指南(2004年6月30日發行)，厚生省生活局監修發明內容在檢查上迷的特定細菌的現有技術的方法中，需要進行對被疑含特定 細菌的樣本中的特定菌進行選擇性富集的選擇富集培養，以及對特定細菌 進行分離的分離培養，需要隨后進行從富集培養基向分離培養基的轉移操 作。例如，在特定細菌屬于沙門氏屬細菌時，首先，需要將對被疑含沙門 氏細菌的樣本進行接種之后形成的前富集培養液O.lmL接種在RV培養基 10mL中，在42。C下培養20 24小時，然后，需要以l個鉑耳量在分離平 板培養基中進行劃線涂抹，進一步在35。C下培養20 24小時。此時，需要 對對應于樣本檢體數的特定細菌鑒別用的多種培養基進行調制，在確定的 溫度和時間內從液體培養基轉移到平板培養基中。本發明目的在于解決上述現有的用于檢查特定細菌的方法的課題。在本發明的1個實施方式中，提供一種培養容器，其在微生物檢查中， 可以將富集培養基和分離培養基填充于同一個容器之中，并且在使用前能夠避免兩培養基的接觸。在本發明的1個實施方式中，提供一種培養容器，其通過在微生物檢 查中將富集培養基和分離培養基填充于同 一個容器之中，從而能夠省略從 富集培養基到分離培養基的轉移操作，且使富集培養和分離培養并行進行， 采用這種方式，不但能夠避免復雜的作業，而且還能夠縮短檢測時間。本發明更具體的涉及如下方面。方面(1): 一種用于檢測樣本中的目標微生物的裝置，其具有樣本采 集部件、含培養該微生物的培養基的容器及將所述樣本和所述培養基混合 的部件，所述培養基含有繁殖目標微生物的第1培養基、及含對目標微生物或其產物作出反應的成分的第2培養基，所述第1培養基和所述第2培養基隔離地容置于所述容器中。方面(2):如上述方面(1)所述的裝置，其中，所述容器由透明材 料制作，上述反應能夠通過從外部目視而觀察到。方面(3):如上述方面(1)所述的裝置，其中，所述樣本釆集部件 含設于所述容器底部的開口部，及與所述開口部連通的吸引部件。方面(4):如上述方面(3)所述的裝置，其中，所述接觸部為安裝 于所述開口部的薄片或者針狀部與所述吸SI部件的組合件。方面(5):如上述方面(3)所述的裝置，其中，所述容器為圓筒形 注射器，所述吸引部件為緊密收容于所述注射器之中的柱塞(7°， ^ ^一)。方面(6):如上述方面(4)所述的裝置，進一步包括用于密封所述 薄片或者針狀部的部件。方面(7):如上述方面(1)所述的裝置，其中，所述目標微生物為 屬于沙門氏屬(5^/"7顯e〃a )、埃希氏菌屬(Eyc/^Wc/n'a )、弧菌屬()、 彎曲桿菌屬(Camp_y/okz"er )、李斯特菌屬(Z^&n》)、蠟樣芽孢桿菌屬 )、耶爾森氏菌屬(7e /m'a)或者霍亂菌屬(c/w/era)的食物中毒病原菌。方面(8): —種用于檢測樣本中的目標微生物的方法，該方法包含 采集樣本的步驟；將得到的樣本裝入權利要求1所述的裝置中的步驟；使 所述樣本、所述第1培養基及所述第2培養基接觸的步驟；將所述裝置配 置在目標微生物繁殖條件下的步驟；及確認所述微生物有無所述反應的步驟。發明效果本發明的特征之 一 在于，具有按照能夠同時進行富集培養及鑒別培養 的方式構成的裝置。根據該結構，可以僅通過將被疑含目標微生物的被檢 試樣、或者對被檢試樣進行了前培養的培養基吸引到上述裝置中，在一次 培養中進行目標微生物的富集及鑒別，而不必要求現有技術那樣的、從液 體培養基(富集培養)到平板培養基(鑒別培養)的轉移操作。這樣，可 以一步式地進行現有一全測法所必需的目標微生物的前培養、選擇培養、菌 分離步驟，所以，可以簡便且迅速檢測，并分離目標微生物。本發明因為采用可以同時進行富集培養及鑒別培養的結構，所以降低 了特定目標微生物檢查中的準備和操作的復雜度，因此，可以在短時間內 檢測目標特定細菌，而且，降低了檢查中所使用的培養基的量及檢查結束 之后的廢棄物量。因此，提供了一種經濟而考慮了環境因素的檢查方法及 能夠適用于該方法的培養容器。


圖1表示本發明的用于檢測樣本中的目標的裝置的概要圖。 圖2表示本發明的用于檢測樣本中的目標的裝置的照片。圖3表示本發明的用于檢測樣本中的目標的代替裝置的照片。 圖4表示采用本發明方法的目標微生物的檢測結果的照片。 圖5表示采用本發明方法的目標微生物的檢測方法的概要圖。 圖6表示采用現有技術方法的目標微生物的檢測方法的概要圖。 符號說明1柱塞桿(7° ， 7夕Y 口 '7卜、、)3 柱塞(/ ， > 、- X ) 4 止擋 部件(久卜'7八一)5 薄片(f" y) 7 帽體(^弋7:/) 9 容 器主體 11第l培養基 12 第2培養基具爿本實施方式本發明涉及用于檢測樣本中的目標微生物的裝置，該裝置具有樣本采 集部件、含培養所述微生物的培養基的容器及將所述樣本和所述培養基混 合的部件，所述培養基含有繁殖目標微生物的第1培養基、及含可對目標 微生物或其產物作出反應的成分的第2培養基，所述第l培養基和所述第2 培養基隔離地容置于所述容器中。上述容器可以由任意材料制成，可以采用任意形狀和尺寸。上述容器 可以呈例如下述的任意形狀該形狀可填充含瓊脂的加熱的培養基，且將 該培養基冷卻后固化形成的培養基能夠不從容器的端部漏出。優選的，接 觸上述樣本的容器的端部(構成樣本采集部的一部分)，呈細長狀，這樣 能夠容易進行樣本的采集。上述容器具有用于收容上述培養基的主體部分 及培養基注入口。該主體部分截面，例如可以呈圓形、橢圓形、多邊形等， 優選主體部分由透明材料制成，以使肉眼能夠觀察到目標微生物的存在。 作為上述容器，優選可以采用注射器。這樣的注射器在本技術領域中是公 知的，在市場上有銷售，可以從普通的制造廠商得到。作為上述第l培養基，可以采用能夠繁殖目標微生物的任意的培養基，Rappapore-Vassiliadis培養基(RV培養基)的選擇富集培養基由亞泰克特(7 r夕卜)株式會社、榮研化學抹式會社、日水制藥抹式會社等在市場銷售， 除此之外還公知有連四硫酸鹽培養基(TT培養基)等。作為上述第2培養基，其為能夠依靠菌落形狀、菌落的顏色及性狀、 代謝物等辨別出繁殖后的目標微生物的培養基，當目標微生物為沙門氏屬 菌種時，則可以是市售的MLCB瓊脂培養基、MLCB瓊脂培養基、TSI培 養基、SIM培養基、賴氨酸脫羧培養基、VP半流動培養基、西蒙茲氏檸檬 酸鹽培養基等。這些培養基可以從上述制造廠商獲得。上述第1培養基典型地為液體培養基，而且，上述第2培養基典型地 按照常規通常可以含0.1 3.0%的瓊脂，按照常規，可以用作經加熱溶解、 注入上述裝置之后而固化的固態培養基。下面示出典型的培養基的組成。緩沖蛋白胨水(BPW) : 20.0g(lL)中、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、 磷酸氫二鈉3.5g、磷酸二氫鉀1.5g、 pH7.2士0.2。Rappapore-Vassiliadis培養基(RV培養基):43.0g ( 1L )中、大豆蛋 白胨4.5g、氯化鎂(無水)16.9g、氯化鈉7.2g、磷酸二氬鉀1.4g、孔雀石 鄉錄0.036g、 pi-15.2士0.2。MLCB瓊脂培養基49.0g(lL)中、酵母提取物5.0g、蛋白胨10.0g、 心提取物(乂、一卜工* ,)粉末2.0g、氯化鈉4.0g、甘露醇3.0g、 L-賴氨酸 鹽酸鹽5.0g、硫代硫酸鈉4.0g、檸檬酸鐵銨1.0g、煌綠0.0125g、龍膽紫O.Olg、瓊脂15.0g、 pH6.8士0.2。本發明的裝置典型地可以如下制作。首先，通常，對于上述第2培養基，加熱并溶解含瓊脂的培養基成分，然后邊進行很好的混合，邊在滅菌后的上述容器中從該培養基注入口進行填充，使高度為10 20mm、冷卻并固化。接著，對固化后的上述第2培養 基和空氣進行吸引，在容器底部形成空隙。然后，填充上述第1培養基， 使得高度為10~20mm。該操作例如在采用注射器樣容器時，可以以從注射 器的端部吸引第1培養基的方式進行。在第2培養基和第1培養基之間， 因為存在空隙，故而在使用前它們不會接觸。在注射器中吸引規定量的第1 培養基之后，采用經滅菌的帽體等將末端封閉，以防止培養基從注射器的 端部流出。(實施方式l)圖1表示本發明典型的裝置的概略圖。該裝置具有市售的Luer鎖定式 注射器(^了一口、乂夕、乂'J 樣形狀和結構，具有前端呈錐狀的圓筒形的主體9、可滑動地插入該主體9內部的柱塞桿1、與錐狀端部扣合(係 合)的帽體7。在錐狀端部安裝有薄片(或者針)5，帽體7也可以按照覆 蓋該薄片(或針)5的方式構成。在柱塞桿的遠端，具有柱塞3，提供與上 述圓筒形主體9的內壁之間的液封式接觸，并據此防止收容于上述圓筒本 體中的內置物漏出。在帽體7的底部，可以敷設硅橡膠層等，以防止上述 主體的內置物從錐狀端部或薄片的端部漏出。柱塞桿1上也可以安裝將其 周緣圍住的止擋(或者0型環)部件4，該止擋部件的下表面通過以緊密 接合的方式與圓筒型主體的上部周緣相匹配，以防止裝置輸出時柱塞桿的 誤操作。在上述圓筒型的主體9的內部，含已填充的第1培養基11和已固化的 第2培養基22。該第1培養基11和第2培養基22被空隙分隔開。作為該 第1培養基和第2培養基，根據目標微生物，可以采用適合于其繁殖及分 離的上述記載的任意的培養基。優選地，上述圓筒型主體由透明材料制成，據此可以觀察本體內部的 狀態。該圓筒本體例如，由玻璃、聚乙烯、環狀聚烯烴等任意的材料構成。上述柱塞呈淡色，可以很容易觀察到本體內部的黑色等著色。 (實施方式2 )圖5表示采用本發明的裝置檢測目標微生物的檢測法的概況。首先，將樣本(檢體)25g添加于225mL的緩沖蛋白胨水(BPW)中， 并通過用Stomacher (7卜7、乂力一)拍打式勻漿機處理而粉碎。將得到的 樣本混合物在35°C下培養約22小時(前富集培養)。將得到的前富集培 養液的一部分吸引至1.0mL 2.0mL容量的注射器中，該注射器中分別填充 了 0.2ml第1培養基和0.2ml第2培養基，其中，將RV培養基作為第1培 養基，將MLCB培養基作為第2培養基。此時，已吸引的前富集培養液和 第1培養基及第2培養基通過接觸而混合。將該注射器豎立于試管架上，在35。C下培養約22小時(前富集培養和 分離培養)。被疑是沙門氏菌的目標微生物的存在例如，通過沙門氏菌產 生的H2S引起的黑色的著色而被確認。如果能夠確認被疑是沙門氏菌的目標微生物的存在，則將從該注射器 中所采集的培養基的一部分劃線式涂布于另行制備的MLCB平板培養基 上，將目標微生物分離。 (比較例)略圖。根據其它的典型的現有技術方法(參照非專利文獻1第2章4沙門氏 菌中的從肉食制品、普通食品中分離沙門氏屬菌)，將25g樣本(檢體) 添加于225m！的緩沖蛋白胨水(BPW)等中，用Stomacher拍打式勻漿機處 理而粉碎。將得到的樣本混合物在35°C下培養約18小時(前富集培養)。 將得到的1 .Oml的前富集培養液在15ml的RV培養基或TT培養基等中進行 接種，在43。C下培養約18小時(富集培養)。然后，將得到的培養液劃線式涂布于MLCB培養基、煌綠培養基、XLD 瓊脂培養基、DHL瓊脂培養基(可從MERCK (林)、日水制藥(抹)等 得到)之上、在35。C下培養約24小時(分離培養)。然后，挑取被疑為 沙門氏菌的平板上的菌落，在TSI培養基和LIM培養基中進行接種，在約 35。C下培養約22小時。在得到的培養液中，例如添加沙門氏菌診斷用血清， 以判斷其O型菌體抗原的類型。這樣，根據現有技術方法，從檢體采集開始到分離培養結束時需要花 費大約60小時，分離培養結束，得到被疑為沙門氏菌的菌落，此外，在進一步確認沙門氏菌之前，還不能明確其存在與否。而且，至少需要前富集 培養、富集培養及分離培養這3個培養進程。因此，其間，需要至少進行2次傳代培養的操作。對于圖6所示的方法也同樣，根據該方法，從檢體采 集到分離培養結束共需要花費大約66小時。其他的現有技術方法的缺點還包括必須要設定約35°C及約42°C這2 個培養溫度條件；從液體培養和平板培養這兩方均產生廢棄物(從前者產 生試管培養基約10ml及試管等廢棄物、而從后者產生平板培養基約20ml及塑料盤等)等。與此相對地，根據本發明的裝置，則可以得到如下的優點。i)盡管從檢體采集到分離培養結束(僅在被疑是陽性時)同樣需要大約66小時(3天時間)，但如果是不存在被疑是沙門氏菌的菌種的話，即 在富集培養和分離培養中沒有觀察到陽性的時候，檢查可以縮短1天,大約44小時結束。不僅如此，當沒有確認為陽性時，僅在從前富集培養轉為 富集和分離培養時進行傳代培養操作即可，與現有技術方法相比較，省去l 次操作，而以1次搡作即可結束。總之，合并進行富集培養和分離培養， 在檢查開始第2天，即可一次鑒別目標微生物的有無，從而選出進入后續 檢測的檢體，縮短了檢測時間并減少了檢體數；ii)孵化條件僅有約35°C 這一個，實現了培養設備的簡略化；iii)所使用的容器尺寸小，節省了空間 及減少了所需的培養基；iv)由于容器的小型化(容量約lml)而僅含少量的 液體培養基(液體培養基和瓊脂培養基充其量分別約0.2ml)，作為廢棄物， 僅拋棄封入少量培養基的容器。上述的優點并非僅針對于沙門氏菌，可以在各種食物中毒菌的檢測試 驗中發揮作用，所述食物中毒菌的檢查法中需要進行富集培養。實施例下面根據實施例對本發明進行說明。下面的實施例為對本發明進行的 例舉的實例，并非旨在限制本發明。 (實施例1 )采用從TERUMO (林)(東京)購得的TERUMO注射器(lml容量結 核菌素用SS-01T)及TERUMO注射針(25Gxl英寸)，制作了本發明的裝置。將Rappapore-Vassiliadis培養基(RV培養基)(MERCK (抹)公司制) 以通常的1.5倍濃度(62.7g/l)在純化水中加熱溶解，添加甘油使其濃度為 0.5% (w/v),進行很好地混合，用作富集培養基。然后，將MLCB瓊脂培 養基(日水制藥(抹)公司制)以通常量(49g/I)在純化水中加熱溶解， 添加甘油使其濃度為0.5% (w/v),進行很好地混合，用作分離培養基。各 培養基在高壓滅菌器中于115。C下滅菌了 15分鐘。首先，在無菌條件下通過拉拔注射器的柱塞桿而吸引約0.2ml的滅菌后 的上述分離培養基。然后，在無菌條件下將0.2ml的無菌空氣吸引至注射器 中。此時，此前吸引的分離培養基向筒體的上方移動，在注射器底部形成 含空氣的空隙。此時，移動后的分離培養基通過冷卻而固化。然后，在無 菌條件下將0.2ml的滅菌之后的富集培養基吸引至注射器中，將帽體安裝在 注射針上(產品l)。圖3示出產品1的照片。 (實施例2)代替TERUMO注射器(1ml容量結核菌素用SS-01T)及TERUMO 注射針(25Gxl英寸)，采用從(抹)7吖夕口亍7夕公司(Vista Dental Company制)市售購得的帶帽體的Luer式鎖定注射器(1.2ml容量目錄 編號為316002 )制作了本發明的裝置(產品2)，除此之外，其余的和實 施例1相同。圖2示出產品的照片。如圖2所示，在該Luer鎖定式注射器 中，具有覆蓋注射器主體的末端的帽體，以代替注射針。沙門氏菌的檢測試驗下面示出使用9抹菌抹及本發明裝置(上述產品2 )實施本發明的方法。 月為炎沙、門氏菌(■ Sa/mowe〃a ￡> &n'"<^y) IF03313 E^另寒沙、門氏菌(5*a/mc rte〃a 7)^)/2/wMn'ww ) IF012529 腸炎沙門氏菌(Sfl/w力"e〃a五Wen'"cfo ) RIMD1933001 M 炎沙門氏菌(&/mo"e〃a ) RIMD1933006M;炎沙門氏菌(Sa/wo"e〃a ) GID0131綠膿假單胞菌(aerag/wwa ) NBRC13275 大腸桿菌(^'c/ze"'c^ co//) IFO15034 陰溝腸桿菌(E"fero6acter c/oacae ) IF013535 弗羅因德氏枸櫞酸桿菌(0okzcz^/re而^') NBRC12681 首先，通過推壓上迷制作的產品2的柱塞桿，將圓筒主體內的空氣排出，使富集培養基和分離培養基接觸。然后，將從上述供體菌的斜面上采 集的各菌體懸浮在滅菌水中(0066()值=約0.1 )。拉動對應數目的產品2的注射器的柱塞桿，吸引0.05ml的得到的各懸濁液，進行接菌。保持接菌后 的筒體垂直，在35。C的恒溫箱中進行培養。圖4示出培養24小時后的接 種了各供體菌的筒體的圖。各筒體下面的參考號碼表示對上述供體菌進行了接菌的筒體。B為圖2 示出的本發明的裝置。B表示空白(blank)的意思。如圖4所示，含1 5及 1+9的沙門氏菌的筒體中，分離培養基(MLCB瓊脂培養基)由于產生的硫 化氫而變黑(如圖2中圓圈圈住的部分所示)，而不含沙門氏菌的裝置中 則觀察不到這樣的變化。工業實用性提供一種簡便且迅速檢測食物中毒、病原菌等的特定微生物的裝置。
權利要求
1.一種用于檢測樣本中的目標微生物的裝置，其具有樣本采集部件、含培養該微生物的培養基的容器及將所述樣本和所述培養基混合的部件，所述培養基包含繁殖目標微生物的第1培養基、及含能夠對目標微生物或其產物作出反應的成分的第2培養基，所述第1培養基和所述第2培養基隔離地容置于所述容器中。
2. 如權利要求1所述的裝置，其中，所述容器由透明材料制作，能夠通 過從外部目視而觀察到所述反應。
3. 如權利要求1所述的裝置，其中，所述樣本采集部件含設于所述容器 底部的開口部，及與所述開口部連通的吸引部件。
4. 如權利要求3所述的裝置，其中，所述接觸部件為安裝于所述開口部 的薄片或者針狀部與所述吸引部件的組合件。
5. 如權利要求3所述的裝置，其中，所述容器為圓筒形注射器，所述吸 引部件為緊密收容于所述注射器之中的柱塞。
6. 如權利要求4所述的裝置，進一步包括用于密封所述薄片或者針狀部 的部件。
7. 如權利要求1所述的裝置，其中，所述目標微生物為屬于沙門氏屬 (Sa/wo"e〃a)、埃希氏菌屬(￡5c/^n'c/ '")、弧菌屬(F/ZWo)、彎曲桿菌屬(a m/"/o6w/er )、李斯特菌屬(丄Wen'a )、蠟樣芽孑包桿菌屬(Sa"'〃w )、耶爾森氏菌屬(&n'/m'a)或者霍亂菌屬(C7zo/era )的食物中毒病原菌。
8. —種用于檢測樣本中目標微生物的方法，該方法包含 采集樣本的步驟；將得到的樣本裝入權利要求1所述的裝置中的步驟； 使所述樣本、所述第1培養基及所述第2培養基接觸的步驟； 將所述裝置配置在目標微生物繁殖條件下的步驟；及 確認所述微生物有無所述反應的步驟。
全文摘要
本發明涉及注射器型微生物培養裝置。提供一種簡便且迅速檢測食物中毒、病原菌等的特定微生物的裝置。用于檢測樣本中的目標微生物的裝置，具有樣本采集部件、含培養該微生物的培養基的容器以及將上述樣本和上述培養基混合的部件，上述培養基含有繁殖目標微生物的第1培養基、及含能夠對目標微生物或其產物作出反應的成分的第2培養基，上述第1培養基和上述第2培養基隔離地容置于上述容器中。
文檔編號C12Q1/04GK101402989SQ20071030761
公開日2009年4月8日 申請日期2007年12月4日 優先權日2006年12月4日
發明者水口悟, 舟橋均 申請人:株式會社安泰科拓