堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的取得方法

專利名稱：：堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的取得方法
技術領域：
：本發明涉及從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者以產生堿性氨基酸的微生物的生物菌體為催化劑的酶反應液中取得堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的方法。
背景技術：
：堿性氨基酸發酵液和酶反應液通常包M自于發酵培養基或酶反應基質液中使用的氮源的硫酸銨的硫酸根離子。以往，為了從這種含有硫酸根離子的發酵液或酶反應液中取得純度高的堿性氨基酸鹽酸鹽結晶，是使含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或酶反應液流經氨型陽離子交換樹脂，吸附堿性氨基酸，硫酸根離子和與堿性氨基酸交換的氨離子同時以硫酸銨溶液的形式被排除到體系外。然后，洗滌吸附有堿性氨基酸的離子交換樹脂，用氨水洗提堿性氨基酸，以洗提液中堿性氨基酸自身的形式(游離態)濃縮。而且，采用鹽酸中和使游離態堿性氨基酸晶析，得到堿性氨基酸鹽酸鹽結晶。但是，該取得方法存在以下問題。即，(l)為了將貫流液的硫酸銨溶液作為副產物活用，必需進行濃縮，因此，需要大量的蒸汽，和(2)洗滌樹脂時產生大量的廢水。此外，取得堿性氨基酸的其它方法包括例如向賴氨酸發酵液中添加氫氧化鉀溶液，使之晶析以取得賴氨酸基(游離態)的方法(專利文獻1)和對賴氨酸發酵液進行活性炭過濾除去發酵微生物菌體后，向濾液中添加氬氧化釣溶液，使硫酸釣析出除去，然后，濃縮除去氨以取得賴氨酸基的方法(專利文獻2)。而且，向賴氨酸基中添加鹽酸，以賴氨酸鹽酸鹽結晶的形式取得賴氨酸基。但是，在上述方法中，使用金屬氬氧化物和鹽酸，但金屬氬氧化物昂貴，與其作為金屬的價值相比，作為副產物產生的該金屬硫酸鹽的價格非常低，結果成為一種副原料成本高的流程。此外，當加入金屬氫氧化物，濃縮成規定的賴氨酸濃度時，由于在高pH區域進行加熱濃縮，所以？I起賴氨酸的分解反應。另外，在該方法中，金屬硫酸鹽結晶和該氨基酸溶液的混懸液因該氨基酸處在堿(游離態)形式，所以粘度高，兩者的分離困難。結果，大量的該氨基酸附著在金屬硫酸鹽上被排出，因而該氨基酸的產品回收率降低。而在本發明的方法中，該氨基酸以鹽酸鹽的形式存在，所以粘度低，金屬硫酸鹽結晶和該氨基酸溶液在混懸液中的固液結晶分離容易，該氨基酸的產品回收率也高。而且還存在下述問題等金屬氬氧化物通常是50%以下的水溶液，添加它將降低體系內氨基酸濃度，蒸汽成本上升；也不是沒有考慮向體差九添加金屋1A化物100%的粉末，但是，搡作上危險，存在困難；同時，包括加入金屬氫氧化物的工序和添加鹽酸的工序，操作煩雜。以往，不使堿性氨基酸發酵液中存在的堿性氨基酸硫酸鹽和金屬氯化物作用的理由是因為認為堿性氨基酸硫酸鹽(的硫酸根)和金屬氯化物不發生陰離子交換反應。即，溶液狀態的堿性氨基酸硫酸鹽和固相狀態的金屬氯化物是固液體系，所以不會認為發生氯彼此之間的平衡反應。這種固液體系的情況，一般認為就算是把金屬氯化物以固體形式添加，其也依舊以固體形式存在，而溶解的堿性氨基酸硫酸鹽依舊溶解著。專利文獻1:歐洲專利第0534865號公報專利文獻2:俄國專利第183581號公報順便提一下，在本發明中，堿性氨基酸只要是根據發酵法或者以微生物細胞為催化劑的酶法能生成的，則無特殊限制。氨基酸例如可舉出精氨酸、組氨酸和賴氨酸等。氨基酸的形態無特殊限制，但優選L-體。本發明中的所謂微生物是具有生產目的氨基酸能力的微生物，或者是具有催化由基質生成目的氨基酸的反應的能力的微生物。前者用鑒于于發酵法，后者用于酶法。微生物可以是細菌、酵母、絲狀菌等中的任一種，但優選細菌。此外，細菌可以是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中的任一種。并且，微生物可一種單獨使用，也可以多種連用。L-賴氨酸的生產菌及其育種方法具體可舉出W095/23864號、WO96/17930號、WO2005/010175號、特開昭56-18596號、美國專利第4346170號、特開2000-189180號等例示的公知的生產菌和其育種方法。此外，L-精氨酸的生產菌及其育種方法具體可舉出美國專利申請公開2002/058315Al、俄國專利第2001112869號、EP1170358A1、4EP1170361A1等例示的公知的生產菌和其育種方法。再者，L-組氨酸的生產菌及其育種方法可舉出俄國專利第2003677號、俄國專利第2119536號、美國專利第4,388,405號、美國專利第6,344,347號、美國專利第6,258,554號、俄國專利第2003677號和第2119536號、特開昭56-005099號、EP1016710A等例示的公知的生產菌和其育種方法。L-鳥氨酸的生產菌及其育種方法也是同樣。
發明內容發明要解決的課題鑒于上述
背景技術：
，本發明的目的在于發現一種產品收率和品質與以往技術中的大致相同并且更簡便的、從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者以產生堿性氨基酸的微生物的生物菌體為催化劑的酶反應液(以下在本說明書中，如果不特別說明，則關于發酵液的說明只要沒必要在技術上作其它解釋，則認為其也兼作關于酶反應液的說明。)中分離取得堿性氨基酸鹽酸鹽的方法。解決課題的手段本發明人等為達到上述目的進行了反復深入的研究，結果發現，采用向含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液中添加金屬氯化物，使該硫酸根離子以該金屬的硫酸鹽結晶的形式析出，將其分離，然后冷卻，使堿性氨基酸以其鹽酸鹽結晶的形式析出的方法，能取得收率和品質高的堿性氨基酸鹽酸鹽結晶，基于這一見解完成了本發明。即，本發明包括以下方式。從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者以產生堿性氨基酸的微生物的生物菌體為催化劑進行了酶反應的含有硫酸根離子的酶反應液中取得堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的方法，其特征在于，(l)向含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者酶反應液中，添加選自鈣、鉀、鎂和鋇中的金屬的氯化物，使該硫酸根離子以該金屬的硫酸鹽結晶的形式析出，(2)從該堿性氨基酸發酵液中除去該金屬的硫酸鹽結晶，(3)將除去了該金屬的硫酸鹽結晶的堿性氨基酸發酵液維持在該金屬的硫酸鹽的飽和溶解度以下的同時進行冷卻，使堿性氨基酸以其鹽酸鹽結晶的形式析出，(4)分離并采集該堿性氨基酸結晶。[2][l]所述的方法，其特征在于，將該堿性氨基酸發酵液或者酶反應液中含有的菌體在所述工序(1)之前或所述工序(2)之后除去。[1]或[2]所述的方法，其特征在于，該堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或組氨酸。[1]~[3]任一項所述的方法，其特征在于，碌u酸^f艮離子相對于該含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或酶反應液中的堿性氨基酸的當量比為50~150%。[1]~[4]任一項所述的方法，其特征在于，該金屬的氯化物的添加量以相對于該碌u酸才艮離子的當量比計為80~120%。發明的效果根據本發明，可從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液中以非常簡便的方法取得收率和品質良好的堿性氨基酸鹽酸鹽。具體實施例方式下面，具體說明本發明。根據本發明的方法，在從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液中取得堿性氨基酸鹽酸鹽結晶時，首先，進行向含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液中，添加選自釣、鉀、鎂和鋇中的金屬的氯化物，使該硫酸根離子以該金屬的硫酸鹽結晶的形式析出的工序。此時，本發明中使用的含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液如下。即，當然必須含有硫酸根離子，但其濃度范圍是在該堿性氨基酸發酵液中，硫酸根離子相對于堿性氨基酸的當量比率為50~150%的范圍，優選為90~110%的范圍。這是因為該當量比率比150%多時，存在供反應的氯化物離子量不必要地增加的缺點，而該當量比率比50%低時，由于超過pH8.5，所以存在該堿性氨基酸發生分解的缺點。此處，所謂堿性氨基酸只要是精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸或其衍生物即可，且它們可以是L體或D體的光學活性體，還可以是外消旋體。本發明使用的堿性氨基酸發酵液或堿性氨基酸酶反應液其中所含的該堿性氨基酸的主要反離子只要是硫酸根離子即可。此外，還可以是發酵液中包含發酵生成的堿性氨基酸結晶的晶析發酵液，但此時，是在除去該結晶之后或者使其溶解之后，再供本發明的方法使用。添加金屬氯化物使該金屬的硫酸鹽結晶析出時的條件如下。本發明使用的金屬氯化物可從氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂和氯化鋇(包括它們的水合物)中適當選擇，但優選是氯化鈣和氯化鉀。兩者之中更優選氯化鉀。其理由是因為副產品可直接活用作為肥料。金屬氯化物的添加量與硫酸根離子量相關，相對于硫酸根離子按當量比計為80~120%,優選為90~100%。堿性氨基酸發酵液中含有的菌體預先除不除去均可。但是，從提高金屬硫酸鹽結晶的分離性的觀點考慮，最好預先將菌體除去。此外，在添加金屬氯化物之際，可以將該堿性氨基酸發酵液濃縮，也可以不濃縮維持原狀。濃縮的情況，從操作性的觀點考慮，優選金屬氯化物的添加時間為在濃縮之前添加。其理由是在使溶解度低的金屬硫酸鹽結晶析出的情況，過飽和如果大，則漿液濃度將極端增高，導致分離困難。更優選的方法是在濃縮前添加，分離析出的金屬硫酸鹽結晶之后，將該分離母液濃縮。添加氯化鉀的情況，添加時間在濃縮前后均可。^f旦是，添加氯化鈣的情況是在濃縮前添加氯化鈣，除去硫酸鈣之后濃縮，然后再次析出并分離硫酸釣，需要2次析出分離操作，很煩雜。在添加金屬氯化物之際，該堿性氨基酸發酵液的pH和溫度優選pH3~8.5和溫度20~90°C。具體而言，添加氯化鈣的情況優選pH3~8.5和溫度20~90°C。添加氯化鈣以外的金屬氯化物的情況優選pH3~8.5和溫度5090。C。其理由是pH超過8.5時，將促進堿性氨基酸的分解反應，導致回收率下降，而如果比3低，則堿性氨基酸溶解度上升，回收率下降，此外還因為要保持溶解度低，則添加堿，結果導致成本上升。將金屬氯化物按上述規定量使用時，通常落入該范圍，但必要時，適當采用酸或堿調整pH值。另外，添加氯化鈣以外的金屬氯化物的情況，溫度比5(TC低時，為防止堿性氨基酸的析出，不能提高濃度倍率，在其后的工序中難以得到高晶析率，而溫度如果超過卯。C，則該氨基酸發生分解。作為在使金屬硫酸鹽結晶晶析之際的其它的注意事項，在金屬氯化物結晶存在的固液陰離子交換反應體系的情況下，選取充分的反應時間是必要的。其為在金屬氯化物添加后通產2小時以上，優選IO小時以上。完全溶解體系的情況，由于僅是使金屬硫酸鹽濃縮晶析，所以僅需要通常的濃縮時間。其次，進行從該堿性氨基酸發酵液除去該金屬的硫酸鹽結晶的工序。除去方法包括各種離心分離機，無特殊限制，但從母液的溫度保持容易的觀點出發，優選SDC(超級傾析器型分離機)。接下來進行將除去了該金屬的硫酸鹽結晶的堿性氨基酸發酵液維持在該金屬硫酸鹽的飽和溶解度以下的同時冷卻，使堿性氨基酸鹽酸鹽析出的工序。應予說明，此處冷卻晶析是主要的，但也可根據需要在其前后加入濃縮操作。通過冷卻晶析使堿性氨基酸結晶析出時，維持堿性氨基酸發酵液中的該金屬硫酸鹽濃度在飽和溶解度以下是重要的。為此，要預先掌握該金屬石危酸鹽在堿性氨基酸飽和溶液中的飽和溶解度。例如，pH5.5且溫度20。C時，精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和組氨酸任何一種的情況下，硫酸鉀時都是10g/dl，而硫酸鈣時都是0.05g/dl。本領域技術人員可通過預備試驗容易地確定所給情況的操作條件。本發明在達到所述溶解度之前停止濃縮晶析或冷卻晶析。接下來進行分離晶析的堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的工序。分離方法和上述從該堿性氨基酸發酵液中除去該金屬硫酸鹽結晶的情況相同。但分離方法和上述從該堿性氨基酸溶液中分離該金屬硫酸鹽結晶的情況不同，與注意溫度保持相比，更應該注意提高脫水率，除去附著母液，以提高堿性氨基酸的產品純度，所以適合使用籃式離心分離機等分離性優異的離心分離裝置。由此得到的堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的收率和品質與以往方法相比毫不遜色。具體而言，例如精氨酸的情況，使用氯化鉀的采用本發明方法的氨基酸的精制方法，雖然在未進行循環的一級的一次通過中，回收率還不足50%,但是最終，通過將發酵液中的雜質經濃縮的所述氨基酸母液部分地抽出到體系外，將殘留物再次混合回收到下一循環的發酵除菌液中，維持收率，在該條件下進行精制，可確保收率90%、純度99%。氯化鈣的情況下，也能確保收率為90%,純度95%。此外，賴氨酸的情況下，使用氯化鉀時，收率為90%,純度為99%,使用氯化鈣時，收率為90%,純度為99%。8實施例下面，通過實施例和比較例更具體地說明本發明，但本發明并不限于這些實施例。實施例1:賴氨酸鹽酸鹽結晶的取得(使用KC1)含有硫酸根離子的賴氨酸發酵液(賴氨酸硫酸鹽發酵液)的制造可用下述公知的方法制造將碳源、氮源和微量營養素溶解于水中，加熱殺菌后，倒入發酵罐。在其中添加預先增殖的生產賴氨酸的微生物的混懸液，開始培養。培養中用冷水控制發酵溫度保持在354(TC,此外，向發酵罐內一邊補充空氣一邊控制溶解氧。伴隨著培養的進行，一邊補充不足的碳源、氮源和其它、若干的營養素，一邊以培養25~40小時為基準，當培養中的賴氨酸生產速度下降時，結束培養。對得到的賴氨酸硫酸鹽發酵液除菌，得到下述組成的除菌液。體積2384ml2549g賴氨酸基10.9w/w%279gso44.1w/w%105gK0w/w%1gCl0.1w/w%3gPH7.0將該除菌液減壓濃縮到以賴氨酸基(游離態賴氨酸)換算為37w/w°/o(50mmHg)，添加142g氯化鉀(KC1)，于60。C攪拌3小時。然后，采用臺式精選機分離混懸液中的結晶，結果得到135g的硫酸鉀(K2S04)濕結晶和729g的賴氨酸鹽酸鹽溶液。在保持60。C的同時向該溶液中添加水258g,以防止硫酸鉀的析出，然后，于20。C的浴中經6小時緩慢地冷卻至20。C。此外，在冷卻中途，在40。C時，添加10g的賴氨酸鹽酸鹽二水合物結晶作為結晶用的晶種。冷卻后，采用臺式離心分離機分離，結果取得76g的賴氨酸鹽酸鹽二水合物結晶。再釆用流化床干燥機在110。C干燥30分鐘，結果取得純度99%的賴氨酸鹽酸鹽無水物結晶61g和母液770g。另一方面，采用循環賴氨酸發酵母液的方法，根據下述方法取得賴氨酸鹽酸鹽無水物結晶。將該最終母液760g混合到下一循環的發酵除菌液1947g(賴氨酸含量202g(按賴氨酸鹽酸鹽換算))中，添加氯化鉀116g后，濃縮至賴氨酸濃度為130g/100g-H2O。濃縮后，保持混懸液溫度為60。C的同時，分離混懸液中的石危酸鉀，得到137g的碌u酸鉀和890g的上清液。然后，向該上清液中添加160g水，然后，自60。C冷卻至2(TC,由此可得到215g的賴氨酸鹽酸鹽二水合物的濕結晶。再在110。C干燥30分鐘，結果可得到純度99%的賴氨酸鹽酸鹽的無水物結晶180g。這樣反復循環9次，結果以回收率90%取得純度99%的賴氨酸鹽酸鹽無水物結晶。實施例2:賴氨酸鹽酸鹽結晶的取得(使用CaCl2)采用和實施例1同樣的方法制造賴氨酸硫酸鹽發酵液。為保存發酵液，用硫酸調至pH3.0進行保管。將賴氨酸硫酸鹽發酵液進行MF膜除菌，得到下述組成的除菌液。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>為了將該除菌液的pH值調節為中性，加入12g氫氧化鈣(Ca(0H)2),使pH=5.5。于25。C攪拌30分鐘，結果硫酸釣結晶析出。采用Nutsche過濾該混懸液，結果得到9.8g的石充酸鈣結晶。向濾液中加入114g氯化4丐(CaCl2),結果碌u酸4丐析出。將其用Nutsche過濾，結果得到231g硫酸釣二水合物的濕結晶和1475g的賴氨酸鹽酸鹽溶液。釆用減壓濃縮將其濃縮至370g,結果得到60。C的賴氨酸鹽酸鹽濃縮液(濃度35g/dl)。將該賴氨酸鹽酸鹽溶液冷卻至20。C,取得賴氨酸鹽酸鹽的混懸液，采用臺式精選機進行結晶分離，結果由于大量含有硫酸鈣二水合物的濕結晶，所以不優選。因此，首先，通過采用Nutsche過濾該濃縮液，得到硫酸釣二水合物的濕結晶和賴氨酸鹽酸鹽溶液。將該賴氨酸鹽酸鹽溶液冷卻至20。C,取得賴氨酸鹽酸鹽的混懸液，采用臺式精選機進行結晶分離，得到203g賴氨酸鹽酸鹽二水合物的濕結晶。再采用流化床干燥機于11(TC干燥30分鐘，則可取得純度99%的賴氨酸鹽酸鹽無水物結晶156g。然后，采用循環賴氨酸發酵母液的方法，根據和實施例l中同樣的方法可取得賴氨酸鹽酸鹽無水物結晶。這樣反復循環9次，結果可取得回收率90%、純度99%的賴氨酸鹽酸鹽無水物結晶。實施例3:精氨酸鹽酸鹽結晶的取得(使用KC1)含有硫酸根離子的精氨酸發酵液(精氨酸硫酸鹽發酵液)的制造使用生產精氨酸的微生物代替生產賴氨酸的微生物，其它和實施例1中同樣操作，可制造精氨酸硫酸鹽發酵液。將得到的精氨酸硫酸鹽發酵液除菌，得到下述組成的除菌液。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>向該除菌液中，添加氯化鉀42g使之溶解后，濃縮至精氨酸濃度為100g/100g-H20。濃縮后，釆用臺式精選才幾分離60。C混懸液中析出的結晶，得到40g^5危酸鉀的濕結晶和230g精氨酸溶液。然后，向該溶液中添加水30g,冷卻至20°C,采用臺式精選機對混懸液進行分離，取得30g的精氨酸鹽酸鹽濕結晶和226g精氨酸溶液。然后，采用循環精氨酸發酵母液的方法，對取得精氨酸鹽酸鹽結晶的方法根據模擬法進行試算。經計算，反復循環9次時，可取得回收率90%、純度99%的精氨酸鹽酸鹽結晶。產業實用性本發明可用于使用堿性氨基酸鹽酸鹽的動物飼料領域和化妝品原料領域、醫藥原料領域中。權利要求1.從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者以產生堿性氨基酸的微生物的生物菌體為催化劑進行了酶反應的含有硫酸根離子的酶反應液中取得堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的方法，其特征在于，(1)向含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者酶反應液中，添加選自鈣、鉀、鎂和鋇中的金屬的氯化物，使該硫酸根離子以該金屬的硫酸鹽結晶的形式析出，(2)從該堿性氨基酸發酵液中除去該金屬的硫酸鹽結晶，(3)將除去了該金屬的硫酸鹽結晶的堿性氨基酸發酵液維持在該金屬的硫酸鹽的飽和溶解度以下的同時進行冷卻，使堿性氨基酸以其鹽酸鹽結晶的形式析出，(4)分離并采集該堿性氨基酸結晶。2.權利要求1所述的方法，其特征在于，將該堿性氨基酸發酵液或者酶反應液中含有的菌體在所述工序(1)之前或所述工序(2)之后除去。3.權利要求1或2所述的方法，其特征在于，該堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、烏氨酸或組氨酸。4.權利要求1~3任一項所述的方法，其特征在于，硫酸根離子相對于該含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或酶反應液中的堿性氨基酸的當量比為50~150%。5.權利要求1~4任一項所述的方法，其特征在于，該金屬的氯化物的添加量以相對于該硫酸根離子的當量比計為80~120o/o。全文摘要本發明的目的在于提供一種產品收率和品質與以往技術中的大致相同并且更簡便的、從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液中分離取得堿性氨基酸鹽酸鹽的方法。本發明提供一種從含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者以產生堿性氨基酸的微生物的生物菌體為催化劑進行了酶反應的含有硫酸根離子的酶反應液中取得堿性氨基酸鹽酸鹽結晶的方法，其特征在于，(1)向含有硫酸根離子的堿性氨基酸發酵液或者酶反應液中，添加選自鈣、鉀、鎂和鋇中的金屬的氯化物，使該硫酸根離子以該金屬的硫酸鹽結晶的形式析出，(2)從該堿性氨基酸發酵液中除去該金屬的硫酸鹽結晶，(3)將除去了該金屬的硫酸鹽結晶的堿性氨基酸發酵液維持在該金屬的硫酸鹽的飽和溶解度以下的同時進行冷卻，使堿性氨基酸以其鹽酸鹽結晶的形式析出，(4)分離并采集該堿性氨基酸結晶。文檔編號C12P13/24GK101558164SQ20078004582公開日2009年10月14日申請日期2007年10月22日優先權日2006年12月25日發明者岸野光廣,龜井利道申請人:味之素株式會社