基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法

專利名稱：基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種基于環介導等溫擴增技 術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
目前對結核分歧桿菌有多種檢測方法，從以病原微生物分離鑒
定、形態學鑒定和自動生化鑒定為主的國家標準(GB/T4789.7 — 2003)，到特異蛋白的免疫學檢測技術、核酸探針、聚合酶鏈式反應 (PCR)技術等分子生物學檢測方法[食品安全檢測與現代生物技術，化 學工業出版社，2004年]。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準 確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術試圖突破傳統的形 態學、生化反應等微生物學檢測舊模式，不需要對微生物進行分離提 純，而直接用樣品或樣品的增菌液對其基因及基因產物進行快速檢 測，并且與分子生物學技術及生物信息學手段相結合，向準確、快速、 靈敏和自動化的方向發展。
以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實 際應用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要 專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光 實時定量聚合酶鏈式反應(real time PCR)技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，
因此不適用于現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術 中熒光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快 速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確 性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術發展的最 新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等 溫擴增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測 技術上的長足進步，現已建立起來的環介導等溫擴增技術(LAMP) 具有很多的優越性，且目前也未見有用環介導等溫擴增技術檢測結核 分歧桿菌的基因快速診斷試劑盒。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測成本低、使 用方便、檢測快速高效、靈敏度高的基于環介導等溫擴增技術的結核 分歧桿菌基因快速診斷試劑盒，該試劑盒是基于環介導等溫擴增技術 來檢測結核分歧桿菌的。
本發明的另一個目的是提供上述結核分歧桿菌基因快速診斷試 劑盒的檢測方法。
本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的 一、本發明的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒，是由兩對引物、
S^DNA聚合酶、裂解液l、裂解液2、穩定液、樣品預處理液、顯色
液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中，其中 所述兩對引物為外引物F3: GGCTGGTCTCTGGCGTT,如SEQ ID NO:l所示； 外引物B3: GGCCTATACAAGACCGAGCT,如SEQ ID NO:2
所示；
內引物FIP: GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGT AGGCAGCCT，如SEQ ID NO:3所示；
內引物BDP: GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGG CAAGCCCT,如SEQ ID NO:4所示；
上述反應液每lL中含有1.6 2mmo1 dNTP、 20 25mmolTris-Cl、 10 12.5mmol氯化鉀、10 12.5mmol硫酸銨、8 10mmol硫酸鎂、 l 1.25ml TritonX-lOO、 0.8 lmol甜菜堿、內引物FHVBIP各1.6 2mol和外引物F3/B3各0.2 0.25mo1。優選的比例是每1L中含有 2mmoldNTP、 25mmol Tris-Cl、 12.5mmol氯化鉀、12.5mmol硫酸銨、 10mmol硫酸鎂、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜堿、內引物FDVBIP各 2mol和夕卜引物F3/B3各0.25mo1。
上述裂解液1每1L中含有10 20 mmol pH8.3的Tris-HC1、50 100 mmol KC1、 2.5 5 mmol MgCl2、 5 10ml Triton X-IOO、 5 1 0ml吐溫-20和0.1 0.2g明膠。
上述裂解液2為蛋白酶K。
上述陽性對照為結核分歧桿菌基因組DNA。
上述顯色液優選為SYBR Green I或EvaGreen。
上述穩定液優選為石蠟油。
二、本發明基因快速診斷試劑盒的生產工藝1、 將內引物FHVBIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測，抽樣質檢；
2、 將反應液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢;
3、 將穩定液無菌分裝，抽樣質檢；
4、 將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；
5、 組裝試劑盒。
三、本發明基因快速診斷試劑盒的檢測方法
1、 樣品處理
將待測痰樣液化后于離心管中離心，去上清，收集沉淀；在裂解 液l中加入裂解液2，吹打混勻后，加入前述沉淀中，水浴裂解反應， 反應結束后離心，上清即為樣品模板DNA;
上述痰樣液化所用的液化試劑為質量百分數4%NaOH溶液或胰 酶，液化至樣品中無痰絲即可；
上述水浴裂解反應中，水浴溫度為55 60°C，裂解反應時間為 60min 90min。
2、 環介導等溫擴增技術反應過程
在反應管中加入反應液38 40體積％、Bst DNA聚合酶0.9 1.8 體積％ 、穩定液52 54.5體積％ 、樣品模板DNA4.5 9體積％ ， 63 65"C恒溫反應45 90min。所述體積百分比是指占四個組分總體積的 體積百分比。
3、 反應后處理
在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。
本發明所說的基于環介導等溫擴增技術(loop-mediated isotherma 1 amplication of DNA,簡稱LAMP)快速檢測結核分歧桿菌的方法， 是利用fof DNA聚合酶和根據靶基因序列設計的兩對特殊的內、外 引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的 六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合 成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的 莖-環DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離 子與反應溶液中的Mg^結合，產生副產物一焦磷酸鎂乳白色沉淀， 即可通過肉眼觀察判定結果。LAMP反應是在恒溫(63 65°C)條件 下45 90分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環 使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易污染 及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術素質要 求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于 建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度 特異性的基因擴增法。將恒溫基因擴增技術與PCR技術(包括熒光 實時定量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏度、特異性 和檢測范圍等方法學指標上相當于或優于PCR技術，且不依賴任何 專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于 熒光定量PCR技術。國內目前尚未有這方面的試劑盒出售。目前國 家標準中以微生物分離培養和形態學鑒定為主、結合生化分析和血清 學分型鑒定的通行方法，初步鑒定需2 3天，完成鑒定報告需10 15天；采用本發明的基因快速診斷試劑盒僅需2小時。并且，本發 明的反應液中加入了顯色液，鑒定結果更為直觀清晰。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果l.本發明的基因快 速診斷試劑盒只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設 備，檢測成本低；2.本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四 條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特 異性；3.本發明的基因快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到l小 時即可完成擴增，且產率高；4.本發明的基因快速診斷試劑盒靈敏度 高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發明的基因快速診斷試劑盒 鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg"結合， 產生副產物一焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液 后，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。
具體實施例方式
實施例l試劑盒的制備
(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 外引物F3: GGCTGGTCTCTGGCGTT，如SEQ ID NO:l所示； 外引物B3: GGCCTATACAAGACCGAGCT，如SEQ ID NO:2
所示；
內引物FIP: GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGT AGGCAGCCT，如SEQ ID NO:3所示；
內引物BIP: GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGG CAAGCCCT，如SEQ ID NO:4所示；(2) 購置DNA聚合酶fi^DNA聚合酶置于容器。
(3) 配制反應液反應液按每1L中含有2mmo1 dNTP、 25mmo 1 Tris-Cl、 12.5mmol氯化鉀、12.5mmol硫酸銨、10mmol硫酸鎂、1. 25ml TritonX-100、 lmol甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mo1和外引物 F3/B3各0.25mol配制，置于容器。
(4) 配制裂解液1:裂解液1按每1L中含有lOmmol pH8.3的T ris-HCl、 50mmo1 KC1、 2.5mmol MgCl2、 5ml Triton X-IOO、 5ml吐 溫-20和0.1g明膠配制。
(5 )配制上述裂解液2:裂解液2按lml含20mg蛋白酶K配制。
(6) 購置穩定液石蠟油，置于容器。
(7) 購置顯色液SYBR Green I，置于容器。
(8) 提取陽性對照結核分歧桿菌基因組DNA，置于容器。
(9) 將上述8個容器裝成試劑盒，封裝。 制備工藝簡述如下
1、 將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測，抽樣質檢；
2、 將反應液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；
3、 將穩定液分裝，抽樣質檢；
4、 將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；
5、 組裝試劑盒。
實施例2試劑盒的制備反應液按每1L中含有1.6mmoldNTP、 20mmol Tris-Cl、 lOmmol 氯化鉀、10mmol硫酸銨、8mmol硫酸鎂、lml TritonX-100、 0.8mol 甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6mol和外引物F3/B3各0.2mol配制，
置于容器，
裂解液1按每1L中含有20 mmol pH8.3的Tris-HCl、 100 mmol KC1、 5 mmol MgCl2、 10ml Triton X-IOO、 10ml吐溫-20和0.2g明
膠配制。
顯色液為EvaGreen。 其他同實施例l。
實施例3結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒的應用 1、樣品處理(模板DNA提取)
(1)取痰樣l 2ml，加入等體積4質量免NaOH溶液渦懸混勻， 使兩者充分接觸，靜置30分鐘至充分液化無痰絲，吸取0.5mL液化 好的樣品入Eppendorf管中，10000r/min離心5分鐘，棄上清液，沉 淀加生理鹽水lmL。振蕩洗滌沉淀后10000r/min離心5分鐘。如此2
次，棄上清液，收集沉淀；
(2)于50^1裂解液1中加入0.5^1裂解液2，配置成樣品裂解 液，加入上述沉淀物中，6(TC水浴裂解反應lh，煮沸15min終止反 應后，10000rpm離心2分鐘，上清即為樣品模板DNA。 2、環介導等溫擴增技術的反應過程 (1)在20(^1反應管配制反應體系反應液22^d， fof DNA聚合酶0.5jxl (4u)，穏定液30m1，模板dna2.5(！1。
(2)將配制好的反應管于64。C恒溫反應lh。 3、反應后處理
向上述反應管中加入2^1 SYBRGreenI，混勻，同時也向陽性對 照管(結核分歧桿菌基因組DNA)中加入SYBRGreenI混勻，若反
應管與對照管一樣顯現綠色則為陽性，若反應管顯現橙色則為陰性。基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法序列表.txt SEQUENCE LISTING
<110> 廣州華峰生物科技有限公司
<120>基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法
<130>
<160> 4
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
〈211〉 17
<212〉 DNA
〈213〉 人工合成
<400> 1
ggctggtctc tggcgtt 17
〈210〉 2
<211> 20
<212〉 DNA
<213〉 人工合成
〈400〉 2
ggcctataca agaccgagct 20
〈210〉 3
<2.11> 42
〈212〉 DNA <213〉人工合成
〈400〉 3
gcctctacca gtactgcggc ttttga.gcgt agtaggcagc ct 42
<210〉 4
<211> 40
<212> 腿 <213>人工合成
<400〉 4
gttgaaccag tcgacccagc gttttaaccc ggcaagccct 40
權利要求
1. 一種結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒，其特征在于由兩對引物、BstDNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、穩定液、反應液、顯色液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中，上述兩對引物為外引物F3GGCTGGTCTCTGGCGTT；外引物B3GGCCTATACAAGACCGAGCT；內引物FIPGCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGTAGGCAGCCT；內引物BIPGTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGGCAAGCCCT；每1L反應液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-Cl、10～12.5mmol氯化鉀、10～12.5mmol硫酸銨、8～10mmol硫酸鎂、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；每1L裂解液1中含有10～20mmol pH8.3的Tris-HCl、50～100 mmol KCl、2.5～5mmol MgCl2、5～10ml Triton X-100、5～10ml吐溫-20和0.1～0.2g明膠；上述裂解液2為蛋白酶K；上述陽性對照為結核分歧桿菌基因組DNA。
2、 根據權利要求l所述試劑盒，其特征在于所述顯色液為SYBR Green域EvaGreen。
3、 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述每1L反應液中 含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-Cl、 12.5mmol氯化鉀、12.5mmo1硫 酸銨、lOmmol硫酸鎂、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜堿、內引物 FIP/BIP各2mo1和外引物F3/B3各0.25mol。
4、 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述每1L裂解液1 中含有10 mmol pH8.3的Tris-HCl、 50mmo1 KC1、 2.5mmo1 MgCl2、 5ml Triton X-IOO、 5ml吐溫-20和O.lg明膠。
5、 根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于所述穩定液為石 蠟油。
6、 利用權利要求1所述試劑盒檢測結核歧桿菌的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1) 將待測痰樣液化后于離心管中離心，去上清，收集沉淀；(2) 在裂解液1中加入裂解液2，吹打混勻后，加入上述沉淀 中，水浴裂解反應，反應結束后離心，上清即為樣品模板DNA;(3) 在反應管中加入反應液38 40體積％、 Bst DNA聚合酶0. 9 1.8體積％、穩定液52 54.5體積％、樣品模板DNA 4.5 9體積 。％，恒溫反應；(4) 在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣 品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。
7、 根據權利要求6所述檢測方法，其特征在于步驟(1)中的液 化為加入質量百分數4 %NaOH溶液或胰酶對痰樣進行液化。
8、 根據權利要求6所述檢測方法，其特征在于步驟(2)中，水浴溫度為55 6(TC，裂解反應時間為60min 90min。
9、根據權利要求6所述檢測方法，其特征在于步驟(3)中，恒 溫反應的反應條件為溫度63 65"C，反應時間45 90min。
全文摘要
本發明提供一種基于環介導等溫擴增技術的結核分歧桿菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法，該試劑盒由兩對引物、DNA聚合酶、反應液、裂解液1、裂解液2、穩定液、顯色液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中。本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性。本發明的基因快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備。本發明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg²⁺結合，產生副產物—焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，更加明顯可靠。
文檔編號C12Q1/68GK101302553SQ20081002844
公開日2008年11月12日 申請日期2008年5月30日 優先權日2008年5月30日
發明者劉妙琴, 曹以誠, 李心暉, 杜正平, 磊 石, 譚惠媚, 趙長臣, 洵 陳 申請人:廣州華峰生物科技有限公司