黃瓜側枝抑制基因cls的蛋白編碼序列的制作方法

專利名稱：：黃瓜側枝抑制基因cls的蛋白編碼序列的制作方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種基因工程
技術領域：
的編碼序列，特別是一種黃瓜側枝抑制基因cls的蛋白編碼序列。
背景技術：
：植物分枝發育在植物形態建成中有重要的地位。作物分枝是影響作物產量的重要農藝性狀之一，在玉米的馴化過程中通過減少分枝可以達到增產的目的，在水稻中分蘗數目過多或者過少都不利于產量的提高。對于黃瓜來說，產量高低和側枝數目也有密切的關系。到目前為止，黃瓜側枝一直被作為數量性狀進行研究，己經定位了幾個和側枝發育相關的QTLs。但從來沒有分離得到基因，更沒有進行過詳細研究。但在玉米、水稻、擬南芥、番茄、豌豆中已經分離得到了多個和側枝發育相關的基因，其中最引人注目的是番茄側枝抑制基因ls的分離和功能驗證。番茄的ls基因是最早影響腋生分生組織形成的基因之一，是植物特有的GRAS轉錄因子家族的重要成員。GRAS基因家族的蛋白產物均為轉錄因子，具有調控其它基因轉錄的能力，名字由最早發現的三個成員，GAI，RGA，SCR的首字母拼寫而成。典型的GRAS蛋白有400-700個氨基酸組成，兩個亮氨酸七聚體重復序列(LeucineH印tadR印eats)包圍的VHIID結構域，一個保守的C-末段和長度、序列可變的N-末端，也就是N-末端的序列賦予了其物種特異性。本發明克隆的基因cls也屬于GRAS基因家族，預測應該也是一個轉錄因子。在對現有技術文獻的分析中，雖然《Proc.Natl.Acad.Sci.USA美國國家科學院學報》，1999，1，96:290-295發表了文章"Thelateralsuppressor(Ls)geneoftomatoencodesanewmemberoftheVHIIDproteinfamily番茄側枝抑制基因Ls編碼蛋白是VHIID家族的一個新成員"對番茄側枝抑制基因Ls的功能作了詳細闡述；《TheorApplGenet理論運用遺傳學》在2003，107:875-883發表的文章"Comparativeanalysisofresponsetophenotypicandmarker-assistedselectionformultiplelateralbranchingincucumber(CucumissativusL.)黃瓜多側枝性狀的分子標記輔助選擇與表型的比較分析"對多側枝性狀進行了QTLs定位，但并未分離得到基因。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種黃瓜側枝抑制基因CLS的編碼序列。本發明可以促進側芽原基形成，用于糧食作物、花卉植物、經濟作物、油料作物上，增加它們的側枝數目，從而增加產量。本發明是通過以下技術方案實現的在本發明的一個方面，提供了一種分離出的cDNA分子，該分子包括編碼具有黃瓜側枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第491-1666位的核苷酸序列有至少70%的同源性。或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件(雜交溫度在55"C-6(TC之間)與SEQIDNO.3中第491-1666位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的核苷酸序列具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片斷，或其活性衍生物。更佳地，所述的編碼序列具有SEQIDNO.3中第491-1666位的核苷酸序列。在本發明另一個方面，提供了一種分離出的黃瓜側枝抑制基因的蛋白質多肽，它包括具有SEQIDN0.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段。該多肽在植物腋生分生組織形成的早期表達，是植物側生器官形成必不可少的蛋白。本發明還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。本發明還提供了一種用上述載體轉化的宿主細胞，它是真核細胞。在實例中該宿主細胞是擬南芥。本發明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段己從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段己經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且己經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。本發明所述的編碼序列，包括編碼具有黃瓜側枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第491-1666位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的編碼框第491-1666位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.3中第491-1666位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.3所述的序列。該術語還包括能與SEQIDNO.3中核苷酸第491-1666位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQIDNO.3中從核苷酸第491-1666位的核苷酸序列的同源性至少70%，可優選80%，進一步優選90%，最佳優選95%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與黃瓜側枝抑制基因相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，可優選1-60個，進一步優選1-20個，最佳優選1-10個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數個(通常為60個以內，可優選30個以內，進一步優選10個以內，最佳優選5個以內)核苷酸。本發明所述的編碼序列具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。還包括具有與黃瓜側枝抑制相關相同功能的、SEQIDNO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，可優選l-30個，進一步優選l-20個，最佳優選1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，可優選10個以內，進一步優選5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。本發明還包括黃瓜側枝抑制基因相關蛋白的活性片斷和活性衍生物。本發明的黃瓜側枝抑制基因的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在中度(雜交溫度55-6(TC)或者高度嚴緊條件下(雜交溫度高于65°C)能與黃瓜側枝抑制基因相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用黃瓜側枝抑制基因的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發明中，"黃瓜側枝抑制基因變異多肽"指與SEQIDNO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，可優選8個，進一步優選5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>發明還包括側枝抑制基因蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然側枝抑制基因相關多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他己知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的黃瓜側枝抑制多肽時，可以將黃瓜側枝抑制基因的編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成黃瓜側枝抑制蛋白表達載體。如本發明所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中，術語"宿主細胞"為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。還可用原位雜交技術分析黃瓜側枝抑制蛋白CLS在黃瓜不同組織中的表達情況。此外，本發明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有黃瓜側枝抑制基因核苷酸編碼序列的8-100個連續核苷酸，較佳地具有15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼黃瓜側枝抑制基因相關的核酸分子。本發明還提供了檢測樣品中是否存在黃瓜側枝抑制相關核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于黃瓜側枝抑制相關核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據本發明的黃瓜側枝抑制核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選黃瓜側枝抑制相關同源基因或同源蛋白。為了得到與黃瓜側枝抑制相關基因的黃瓜cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選黃瓜cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對黃瓜側枝抑制相關的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自黃瓜的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech,Stratagene，PaloAlto,Cal.。這種篩選方法可以識別與黃瓜側枝抑制相關的基因家族的核苷酸序列。本發明的黃瓜側枝抑制相關核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ".(1963)J".AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的分子。利用本發明的黃瓜側枝抑制基因，通過各種常規篩選方法，可篩選出與黃瓜側枝抑制相關發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。植物分枝發育在植物形態建成中具有重要地位。作物的分枝是影響作物結實多少并進而影響單產的重要農藝性狀之一。本發明是具有形成側生分生組織能力的植物細胞。在側芽原基形成的早期作用，是植物側生分生組織發育中的關鍵基因。完全能夠讓無側枝的擬南芥突變體長出側枝，說明該基因在不同物種中的保守性非常強，完全可以用于糧食作物、觀葉、觀莖花卉植物上的應用，增加它們側枝的數目已提高這些植物的產量或者觀賞價值。因此，本發明具有很大的應用價值。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1黃瓜側枝抑制基因的克隆1.組織分離(isolation)黃瓜s06為我們實驗室收集的歐洲溫室品種，將黃瓜置于28'C發芽24小時，然后播種于穴盤中，待黃瓜兩片子葉完全展平時大概一周的時間，準備抽取DNA或RNA。2.RNA的分離(RNAisolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至1.5mLEP管中，抽提總RNA(TRIzolReagents,GIBCOBRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。3.基因的全長克隆(CloningofFull-lengthc腿)根據擬南芥，番茄，水稻的側枝抑制基因的核苷酸保守序列，利用同源基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQIDNO.1)+BP002(SEQIDNO.2)]得到2002BP(931bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用M13或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabid叩sisthaliana)黃瓜側枝抑制基因的同源性很高，故初步認為它是一個側枝抑制基因。(2)3,-RACEPCR[AP+BP003(5，TTCATAAGACTGGTGATAGACTCTCA-3，)]得到2002BP3，(817bp),回收，連接到T-Easy載體上，用M13或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsisthaiiana)側枝抑制基因的同源性很高，故初步認為它是一個與側枝抑制相關基因。(3)5'-RACE第一輪PCR[AAP+BP004(5，GAGAAATAAAATGAGCACAACGGATA—3，)]第二輪PCR[(AUAP+BPR005(5，-CACAACGGATAAGTAATTGACGCAT-3，))得到2001BP5'(約500bp)(過程同(l))將測序結果的重疊區拼接，發現過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區。BLAST的結果證明從黃瓜中新得到的基因確為一個與植物分枝相關的基因。通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的黃瓜側枝抑制基因的全長編碼序列(SEQIDNO.3)。實施例2黃瓜側枝抑制相關基因的序列信息與同源性分析本實施例新的黃瓜側枝抑制基因cDNA全長為2175bp(SEQIDNO.3)，其中開放讀框位于491-1666位核苷酸(1175個核苷酸)。根據全長cDNA推導出黃瓜側枝抑制基因的氨基酸序列，共391個氨基酸殘基，詳細序列見SEQIDNO.3。將黃瓜側枝抑制基因相關的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non—redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non—redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與番茄側枝抑制基因(AF098674)只在核苷酸的部分區段上有同源性(附表2)，在氨基酸(AAD05242)水平上具有67%的相同性(附表3);番茄側枝抑制基因已經被證明具有明顯的促進側芽萌發的作用，可以認為cls基因在促進側芽起始上也具有相似的作用。表272%IdentityinoverlapQuery1236TGAATCCMAAGTGGTGACAATAGCTGAMAGGAAGCAMTTTCAACCATCCATTATTCA1295Sbjct990TGAACCCTAAAATTGTTACAATCGCGGAGAAGGAAGCAMTCATAACCATCCTCTTTTTT1049Query1296TGCMAGATTTGTAGAGGCATTGAATCATTACACTTTATTATTTGATTCATTAGAAGCAA1355Sbjct1050TACMAGATTCATCGAGGCGTTGGATTATTATACAGCTGTGTTTGATTCACTGGAAGCTA1109Query1356CTTTACCTCCAMCAGTAGGGAGAGATTGGCAGTGGAGCAAGTTTGGTTTGGGAGGGMA1415iiiiiiimimiliimiiimiliiimmii11iSbjct1110CATTGCCACCGGGTAGTCGAGAGAGGATGACAGTTGMCAAGTGTGGTTTGGGAGAGAGA1169Query1416TAAACGACATCGTTTCAGGAGMGTGAATAA—-GAMMACAACACTATGCTGAAAGGT1472iiiiiimiiiuimmiiimiiimmSbjct1170TTGTTGATATCGTTGCGATGGAAGGAGATAMAGGAMGAMGACA------TGAAAGGT1223Query1473ATGMTCATGGGAMCMTGCTTAAAAGTTTAGGGTTTTCTAATATTCCTTTAAGCCCTT1532Sbjct1224TTAGATCATGGGAAGTTATGTTGAGGAGTTGTGGATTTAGTAATGTTGCTTTAAGCCCTT1283Query1533TCGCTCTCTCACAAGCTAMCTCCTTCTTAGACTTCATTATCCTTCTGAAGGTTATCATC1592Sbjct1284TTGCATTATCACAAGCTAAGCTTCTTTTGAGACTTCATTATCCTTCTGAAGGCTATCMC1343Query1593TCCAAATCCTTC-ATGATTCCCTTTTTCTT-GGTTGGCAAMTCAACCCCTCTTTTCAGT1650Sbjct1344TCGGAGT--TTCGAGTMTTCTTTCTTCTTAGGTTGGCAAMTCAACCCCTTTTCTCCAT1401Query1651CTCTTCATGGCATTGAAAAAAA1672iuiiimimmiSbjct1402CTCGTCTTGGCGTTGAGAAAAA142369%identityinoverlapQuery779ATTCAATCTTGTTACTTATCATTGAATCMATCACGCCCTTTATTAGATTCACCCATTTA838lllllllliMlllliIIIIIIIIIIiiUIIiiIIil111Sbjct524ATTCAATCATCATATCTATCTCTAMCCMGTTACCCCTTTCATAAGGTTTACTCMTTA583Query839ACTGCAAATCAAGCCATTTTAGMGGTATTGAAGAAAGTGGT-ATG—ATTCATGTTTTG895Sbjct584ACCGCTAATCAAGCGATTTTAGMGCGATTAACGGTMTCATCAAGCAATCCACATCGTT643Query896GATTTCGATATTATGCATGGTGTTCAATGGCCTCCTCTTATGCAAGCTTTGGCCGATCGTSbjct644GATTTCGACATTAATCACGGGGTTCAATGGCCACCGTTMTGCAAGCACTAGCTGATCGT955703Query956TTTCCTTCTCCTATGCTTCGTATTACTGCCACTGGTGTTGATCTTAATTTCCTTCATMG1015Sbjct704TACCCTGCTCCCACTCTTCGMTCACCGGTACTGGAMTGACCTTGATACCCTTCGTAGA763Query1016ACTGGTGATAGACTCTCAAGATTTGCCCMTCACTTGGTTTGAGGTTTCAGTTTCACCCTiiiiiiiiiiiiiimiiimiiiimilmilm11imSbjct764ACAGGTGATCGTTTAGCTAAATTTGCTCACTCATTAGGGTTGAGATTTCMTTCCATCCT107582368%identityinoverlapQuery563CAMTGCGTCMTTACTTATCCGTTGTGCtcattttatttctcaatctgatttcatttca622MMIIIIllllIIiIIMIIIIMillIIIIIIIMIISbjct272CAMTCCGCCAGCTACTCATTAGCTGTGCGGAGTTGATTTCGCAGTCCGATTTCTCGGCC331Query623682IISbjct332GCGAAAAGACTCCTTACTATATTATCAACTAACTCATCTCCTTTTGGTGATTCAACTGM391Query683AGATTACTCCAT694Sbjct392CGGTTAGTCCAT403Query:黃瓜側枝抑制基因CLS的核苷酸序列Sbjct:番茄LS的核苷酸序列(AF098674)表2為本發明的黃瓜側枝抑制基因(els)與番茄側枝抑制基因(ls)的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>YL++SFLGWQNQPLFS+SSWSbjct403YQLGVSSNSFFLGWQNQPLFSISSW427Query:黃瓜側枝抑制基因CLS的氨基酸序列Subjct:番茄LS的氨基酸序列(MD05242)表3為本發明的黃瓜側枝基因(els)與擬南芥側枝抑制基因(Is)的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用"+"標出。實施例3cls基因的亞細胞定位GRAS家族蛋白成員的功能是轉錄因子，基于己經發現的一些GRAS成員，如RGA和SLR1有核定位信號。但用分子生物學軟件(pS0RT，http〃psort.nibb.ac.jp)分析表明CLS無跨膜區域，為了確定CLS是否定位在核里，構建了一個包含綠色熒光蛋白GFP的融合蛋白CLS-GFP，構建進順時表達載體PA-7。用基因槍轟擊到洋蔥的表皮里，24'C暗培養36個小時后用激光共聚焦顯微鏡觀察。結果綠色熒光信號主要在核中檢測到，表明CLS是定位在核里，推測是一個轉錄因子。實施例4黃瓜側枝抑制基因相關蛋白或多肽在擬南芥中進行真核細胞表達及轉基因植株的鑒定含目的基因(黃瓜側枝抑制基因cls)表達載體的構建根據黃瓜側枝抑制基因的全長cDNA序列(SEQIDNO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將黃瓜側枝抑制基因cDNA克隆至中間載體(如pUCM-T)，進一步克隆到雙元表達載體(pM0N530)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，采用花序浸染法轉化擬南芥。l.植物的生長按照蛭石6黑土1珍珠巖0.25的比例配好基質，裝到直徑8CM的穴盤中，將擬南芥種子點播在上面，覆蓋上保鮮膜，放入4"C冷藏室，3天后轉入溫度24。C日照16h黑暗8h的光照培養箱中培養。當植株長至莖高約3cm時，去除其頂生化序，以刺激腋生花序的生長，注意避免傷及腋生花序。待腋生花序長出，其下部的花已有授粉現象出現時進行轉化，轉化前，將已授粉的花以及果莢除掉。2.菌液制備及侵染操作挑取鑒定好的農桿菌單克隆放于20ml含有壯觀霉素spe/卡那霉素KM各200ul的LB液體培養基中，28°C，250rpm震蕩培養至0D600為0.5左右。在轉化前一天，轉入50ml同樣的LB液體培養基過夜，第二天，當菌液0D600在1.2-1.6之間時取出使用。室溫5000rpm離心15分鐘，棄上清，沉淀懸浮于相應體積的滲透培養基(1/2MS+蔗糖5。/6+silwetL77200ul/L+6BAlmg/ml)PH值5.6，將農桿菌懸浮液倒在小燒杯中，將長有擬南芥的培養杯倒扣在里面，侵染30s，取出暗培養1天。根據情況可以再浸染一次。培養3-4周，待種子成熟后，收取種子，干燥箱中存放2周。3.轉化子的篩選及遺傳分析將種子均勻分散到固體篩選培養基(MS，1%蔗糖，0.8%瓊脂，PH5.7，卡那霉素50mg/ml)表面。擬南芥培養擬南芥培養平皿4'C處理兩天，22-25'C遮光培養兩天后，放入恒溫培養室，大約兩周后，既可區分轉化株與未轉化株，轉化株移栽到土中以收取T1代種子。4.轉化子的遺傳分析為得到純合的擬南芥轉基因株，轉化株自交三代，取T3代種子進行生理生化測試。鑒于擬南芥las基因對側芽原基的形成具有明顯的促進作用，擬南芥"缺失突變體在短日照條件下表現出蓮座期完全沒有側枝的特點。因此互補成功的植株在短日照處理28天后再在長日照下生長一個月，首先表現出蓮座期有較多側枝長出，其次用半定量RT-PCR鑒定結果表明表型互補的植株中能檢測到黃瓜側枝抑制基因的轉錄，但在擬南芥"突變體和野生型中則檢測不到。這證明cls基因對側芽的萌發具有確切的作用，黃瓜cls基因將可用于利用轉基因技術改變植物側枝數目的研究和產業化生產中。實施例5黃瓜側枝抑制基因cls在黃瓜中的拷貝數分析采用常規方法從黃瓜七天幼苗的葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用BamH和EcoRI酶切DNA[20pg(微克)/樣品]后，將DNA轉至雜交膜(尼龍膜)上后。使用AmershamPharmacia公司GeneImagesContentsCDP-Starlabellingmodule(PRN3540)，我們將cls基因編碼區標記為探針，然后進行雜交(于60。C雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC,P/。SDS)中，于60°C漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，1%SDS)中于60。C漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIGlabeled試劑盒說明書)。結果(Southernblot)在雜交膜上僅出現一條雜交條帶，說明cls基因在黃瓜中只存在一個拷貝。實施例6黃瓜側枝抑制基因cls在黃瓜中的原位表達1.材料的準備取十天苗齡的黃瓜頂芽材料用FAA固定液，4'C固定12-16h，經過酒精梯度脫水，透明處理后包埋進石蠟(ParaplastPlus,sigma)切片，切片厚度10um。2.探針的準備用黃瓜側枝抑制基因序列設計引物YWF-TGGATCCGAACCAGAACAGCAGGAA,YWR-TGTCGACGTGGCAGTAATACGAAGC擴增黃瓜側枝抑制基因cls的部分cDNA片斷，共454bp測序正確后亞克隆到pSK載體上，抽取質粒分別用BamHI和Sail完全酶切作為T7和T3聚合酶的模版。線性化得到正義和反義探針。探針一般水解成75-150bp大小的片段，水解時間按照下列公式計算T(time)=(Li-Lf)/KLiLf(Li:原始探針的長度；Lf:最后雜交探針的長度；k=0.llkb/min。)3.原位雜交過程非放射標記的RNA原位雜交的操作過程按照地高辛RNA標記試劑盒(Roche,USA)提供的方法進行。用OlympusBX-51數碼相機拍照。RNA原位雜交表明在肉眼未見到有側芽形成之前就可以檢測到CLS在腋生分生組織中的表達。而且與腋生分生組織的高表達相反，CLS在頂端分生組織并沒有表達。這些結果說明CLS在側生分生組織起始和側芽形成中起到了關鍵作用。本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(1)序列特征(A)長度:23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述:SEQIDNO.1CA(A/G)TGGCC(T/A/G)CC(A/G/T)TT(G/A)ATGCAAGC(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征:(A)長度:24bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.2(3)SEQIDNO.3的信息(i)序列特征:(A)長度2175bp(B)類型核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>簡TGATAGACTCTCAAGATTTGCCCAATCACT醒TCTTCTTCATGATCGTGATCATCATCGCGT1141TGAAGCTCTCGCCGTTAACTGCGTACTCTA1201CGATGTTCGAGTATTGCTTAATAAAATCAA1261TGAAAAGGAAGCAMTTTCAACCATCCATT1321TCATTACACTTTATTATTTGATTCATTAGA1381ATTGGCAGTGGAGCAAGTTTGGTTTGGGAG1441GAATAAGAAAAAACAACACTATGCTGAAAG1501TTTAGGGTTTTCTAATATTCCTTTAAGCCC1561TAGACTTCATTATCCTTCTGAAGGTTATCA1621TGGTTGGCAAAATCAACCCCTCTTTTCAGT1681AAATTAAAAATTAGGTTTGATTTAGAACCT1741TTAATGTCCAGAGMACGATGAAGGTGCTA1801TTAGGTACATCTTCAGATCTCTTAAGTAAA1861GAAAAGGAAGTATTAATCGTCTTTGAAATT1921ACATGTCTGACTTMTTGAGATGTTCAGGC1981AGCCTATGTAATTTGGCATATGATGATACT2041GCCTAGATTCTTTTCAGGTGTTCTTAAAGA2101AATGTATTATTATTTTTTGTTATTGTACTAAAAAAAAAAA嵐AATGGTTTGAGGTTTCAGTTTCACCCTTTGCTTATCCCTGCTGCTCTTACCCTCTTCCCCGACTTGCACAGGTTTTACAGGTTAATGAAGGAGGCTTTGAATCCAAAAGTGGTGACAATAGCATTCATGCAAAGATTTGTAGAGGCATTGAAAGCAACTTTACCTCCAAACAGTAGGGAGAGGGAAATAAACGACATCGTTTCAGGAGAAGTGTATGAATCATGGGAAACAATGCTTAAAAGTTTCGCTCTCTCACAAGCTAAACTCCTTCTTCTCCAAATCCTTCATGATTCCCTTTTTCTCTCTTCATGGCATTGAAAAAAAAACCCAAACGTCAAGAAAAATAGAGGAATTGACGAGCTAGAATGTATCAACCTAGCTAGTTAAGATGTATTAGCAAGAAGAATATGGAGAGTTTGCATAGCATGCTTTTAGATGGGGTGCAATGAATATCTATTGAACTAGTGGAAGGTTGGTTTGTTGGCTAACTTTGCTTAATTAAATGTGTAAAAGGGGAAAGGGTGAAACCGACAAATATTGAAAATAAAATCTCTGTTTTATTTTTCMAAGG〈210〉3〈211〉391<212>PRT〈213〉CLS蛋白〈400〉21MDPSFNSSHQEHQQEPEQQEDHCLQMRQLLIRCAHFISQSDFISAHHLLSILSSNSSPYG61DSTQRLLHYFSSSLSHLLPSSNYNSSFHH朋HDIEKIQSCYLSLNQITPFIRFTHLTANQ121AILEGIEESGMIHVLDFDIMHGVQWPPLMQALADRFPSPMLRITATGVDLNFL服TGDRL181SRFAQSLGLRFQFHPLLLLHDRDHHRVIPAALTLFPDEALAVNCVLYLHRFYRLMKDDVR241VLLNKIKALNPKVVTIAEKEA腳HPLFMQRFVEALNHYTLLFDSLEATLPPNSRERLAV301EQVWFGREINDIVSGEVNKKKQHYAERYESWETMLKSLGFSNIPLSPFALSQAKLLLRLH361YPSEGYHLQILHDSLFLGWQNQPLFSVSSWH權利要求1、一種黃瓜側枝抑制基因CLS的編碼序列，其特征在于，所述的編碼序列，包括編碼具有黃瓜側枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第491-1666位的核苷酸序列有至少70％的同源性。2、根據權利要求1的黃瓜側枝抑制基因CLS的編碼序列，其特征是，所述的編碼序列，它的開放閱讀框為自第491-1666共1175個堿基。3、根據權利要求2的黃瓜側枝抑制基因CLS的編碼序列，其特征是，所述的開放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。斗、根據權利要求l的黃瓜側枝抑制基因CLS的編碼序列，其特征是，所述的編碼序列，具有SEQIDNO.3的氨基酸序列。4、根據權利要求1的黃瓜側枝抑制基因CLS的編碼序列，其特征是，所述的編碼序列，它是具有形成側生分生組織能力的植物細胞。全文摘要本發明涉及的是一種基因工程
技術領域：
的一種黃瓜側枝抑制基因CLS的編碼序列。所述的編碼序列，包括編碼具有黃瓜側枝抑制蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第491-1666位的核苷酸序列有至少70％的同源性。所述的編碼序列，它的開放閱讀框為自第491-1666共1175個堿基。本發明可以促進側芽原基形成，用于糧食作物、花卉植物、經濟作物、油料作物上，增加它們的側枝數目，從而增加產量。文檔編號C12N15/79GK101240281SQ200810034529公開日2008年8月13日申請日期2008年3月13日優先權日2008年3月13日發明者原麗華,姚丹青,弛張,朱立煌,潤蔡申請人:上海交通大學