專利名稱：一種塊菌與菌根合成方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及印度塊菌(中 華塊菌)與華山松菌根的合成方法。
背景技術：
塊菌(truffles)屬于松、櫟等林下土中生的外 生菌根食用真菌(edible ectomycorrhizal fungi)，由于富含有 蛋白質等營養物質及特殊催欲類化合物和人類免疫系統調節物 質，成為高蛋白、低脂肪、食療兼顧的綠色生態功能性食品，在 歐洲乃至全球倍受青睞，被譽為廚房里的"黑鉆石"，是世界上 迄今最為昂貴的天然食品。我國每年出口印度塊菌(中華塊菌) 360多噸，成為山地林區脫貧致富的新型野生菌根食用菌。并且越 來越受到人們的普遍歡迎，需求日益旺盛。由于所采集的塊菌完 全依賴于林下自然資源，自然產量已供不應求；特別是商業化地 毯式的采集方式，自然生存狀況受到極大的干擾和破壞，近些年 來已導致自然產量大幅度降低；若不采取相應措施，幾年之后必 然成為瀕危物種，乃至消失滅絕。如何實現塊菌類菌根野生食用 菌持續利用已成為世界性難題和創新性研究的熱焦點問題。因此， 首先用塊菌菌種與無菌樹苗在脅迫的條件下合成菌根苗，在人工 菌根合成的基礎上，進行塊菌人工栽培種植已成為塊菌持續發展 的必然要求和必由之路。其中塊菌苗菌根的合成成為塊菌栽培的 關鍵技術。迄今，現有技術中未見有印度塊菌(中華塊菌)與華 山松菌根合成方法的報道和記載。
發明內容
本發明的目的在于提供一種印度塊菌(中華塊菌) 與華山松菌根合成方法。該方法涉及一系列程序步驟，即華山松 種子和塊菌菌種子實體的篩選、無菌樹苗的培育、菌劑制備、培 養基質的配置、優選及其接種，菌根苗的培養與菌根形態解剖及 分子的檢測和確認，移植栽培，以最終實現人工栽培塊菌。
為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案 中華塊菌與華山松菌根合成方法，包括下述步驟
(1) 華山松播種和育苗，
A、 取4-8°C冰箱內保藏2-12個月的華山松種子，30%&02浸 泡2小時，無菌水沖洗數次，棄去漂浮的種子，再用無菌水浸泡 48小時，撈出，用機械方式使種子輕微破口 ，復用75%酒精棉紗 擦拭消毒，放培養皿中備用；
B、 基質備用，取未過篩蛭石與珍珠巖按體積比1/1混勻，加 入水使其含水量達30%， 121-126°C下高壓蒸汽滅菌1小時；或者 取新生產的蛭石和珍珠巖；
C、 播種，將(1) A步驟中備好的種子，以開口端向下的方 向播入基質，播種深度為1.5-2 cm;
D、 育苗；
(2) 中華塊菌菌劑制備和接種，
A、菌劑制備，選2-3月份產的成熟中華塊菌，顯微鏡下觀察 孢子形態，黑褐色孢子與未成熟黃褐色孢子的比例達95:5為成熟 子囊果，成熟子囊果用自來水清洗干凈后，無菌水沖洗3遍，4-8°C冷藏10-20天后，再在-24。C冷凍保存不超過18個月備用；菌劑 制備前將冷凍子囊果取出，自然解凍，將每一子囊果切為數塊，
放置于攪拌機中，加無菌水粉碎，顯微鏡下鏡檢，確定95%的子囊 游離，5%的孢子從子囊分離出為止，菌劑的濃度為每克子囊果/水 二 1/3-5;
B、 接種基質制備及pH值調整，腐殖質土過篩，適量拌入水， 使水分含量30%,高壓滅菌3小時備用；腐殖質、水、蛭石以體積 比1/1/1的比例混合，加入石灰粉，混勻，調整pH為7，備用；
C、 接種，按每株接種5xl07個孢子的量折算出每株需接種的 菌劑的體積，取菌劑澆入基質，拌勻；將步驟(1)所得幼苗自育 苗基質中取出，去根末端，將菌的根系全部浸入步驟(2) A制備 的菌劑后取出，植入步驟(2) B的接種基質；
(3)菌根苗培育，苗置于自然通風大棚，自來水澆灌，干溫 交替培養，培養溫度10-30°C，太陽光照10-H小時。
本發明技術方案的提出基于下述的塊菌菌根合成原理印度 塊菌(中華塊菌)是一種與木本(主要為松科Pinaceae、殼斗科 Fagaceae、榛科Corylaceae、樺木科Betulaceae等)植物開；成夕卜 生菌根的共生性地下生真菌，其生長發育及子實體形成都必須與 這些植物的根系共生才能實現。因此采用人工合成的基質培育樹 苗，用塊菌的組織和孢子制成菌種菌劑接種，在人為控制的條件 下，滿足塊菌菌劑孢子萌發感染樹苗幼根的需求，促成菌根的形 成，把合成的菌根樹苗種植栽培在適宜的山地(PH值7-7.6、炭 氮比C/N二10)，以實現塊菌的人工栽培，確保持續發展。本發明印度塊菌(中華塊菌)與華山松菌根合成的方法，優化 了菌根樹苗的培育、培養基質和菌劑制作及菌根合成和菌根的檢 測與確認。
本發明具體的合成步驟和技術方法如下
1. 基質制備與育苗
基質制備蛭石與珍珠巖按體積比1/1混勻，加入自來水使 其含水量達30%，121-126。C下高壓蒸汽滅菌1小時后冷卻備用(若 為新生產的蛭石和珍珠巖也可不必滅菌，可直接使用)。
播種與育苗挑選成熟飽滿的種子，用75%酒精表面消毒滅菌， 以機械的方法使其開裂微口 ，開口端向下播入上述基質。播種深
度1.5-2 cm為宜；要適時澆灌；播種后第10日開始出芽，30日 后幾乎全部種子出芽完成，萌發率的統計從第6日至第30日；苗 齡在1.5-3月時即可接種。
2. 菌劑及其制備
子實體篩選與保藏首先顯微鏡檢鑒定印度塊菌(中華塊菌)， 確認塊菌子實體準確無誤，避免其他塊菌混入；從中選取成熟的 印度塊菌，以深黑褐色的孢子量比率達95%以上的為成熟子囊果； 沖刷清洗去除泥土后，用無菌水沖洗；4-8°C冷藏箱保藏10-20天 后，移入-24°C冷凍室保存備用。
菌劑制備冷凍子囊果自然解凍，用小刀將每一子囊果切為 數塊；將小切塊放置于攪拌機中，加無菌水粉碎，顯微鏡下鏡檢， 以確定無肉眼可見的組織塊，使95%的子囊游離，約5%的孢子從 子囊分離出為止。菌劑的濃度以每克子囊果/水二 lg/3-5ml為宜。3. 接種
基質制備及PH值調整腐殖質土過篩，適量拌入水，水分含 量30%，高壓滅菌3小時備用；滅菌后的腐殖質與蛭石以體積比
1/1的比例混均，加入石灰粉，充分混勻，調整pH值為7—7.6
時即可備用。
接種與培育根據每株接種含有5xl07個孢子菌劑的劑量要
求，取上述制成的菌劑原液稀釋20倍，取5ml稀釋菌液移入基質， 攪拌均勻；取上述培養的幼苗剪去根端，并將整個根系浸入稀釋 菌劑之后移植基質培育。接種后的幼苗置于自然通風大棚培育。
4. 菌根形態及分子水平驗證
外觀特征菌根形成后菌根末級分枝棒狀或近圓柱狀，表面
光滑，有時具外延菌絲，最末端淡黃色至近白色，向基部顏色漸
深，常形成深淺相間的蛇紋樣斑；菌套明顯，有時表面覆蓋外延
菌絲，菌套細胞不透明。抽樣統計每株菌根數量均為700-800個， 單株根系感染率達95%以上。
解剖特征外菌套平面觀非膠質化，擬薄壁組織 (pseudoparenchymatous tissue) M 型，表面具表皮樣細胞 (epidermal cells )。內菌套平面觀介于疏絲組織型 (pletenchymatous tissue)與擬薄壁組織型之間，近H型，多 數部位近哈蒂氏狀(Hartig net-like),菌絲排列較緊密，粗2 - 4 pm，薄壁，無色；外延菌絲伸長，近等粗，圓柱狀，薄壁，少分 枝，無色。
分子水平驗證經過制菌劑子實體和截取華山松菌根樹苗菌 根總DNA的提取，采用了改進的CTAB法和真菌DNA試劑盒、PCR擴增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5對比分析，分別都得到100%的一 致性，表明所培育獲得的華山松幼苗菌根是由印度塊菌菌絲侵入 形成的；確認華山松印度塊菌菌根合成成功。
具體實施例方式為了更好地了解本發明，下面用本發明的實 施例證來進一步說明本發明的內容，但本發明的內容并不局限于 此。
實施例1:
印度塊菌(中華塊菌)與華山松菌根苗合成方法 1、華山松育苗
(1) '備種
秋季采集成熟華山松種子，4-8。C冰箱內保藏，保藏期不超過 l年。用前取出，30%&02浸泡2小時，其間攪動數次一無菌水沖 洗數次一棄去漂浮的種子一無菌水浸泡48小時，撈出一用機械方 式，使種子輕微破口一復用75%酒精棉紗擦拭消毒，放培養皿中備 用。
(2) 基質
蛭石(未過篩)與珍珠巖按體積比1/1混勻，加入自來水使 其含水量達30%， 121-126°C下高壓蒸汽滅菌1小時；若為新生產 的蛭石和珍珠巖也可不滅菌直接使用。
(3) 播種
將備好的種子，以開口端向下的方向播入基質。播種深度為 1.5-2 cm;容器為425 x 340x 200 mm透水塑料筐。(4)育苗
自來水澆灌；播種后第10日開始出芽，30日后幾乎全部種子 出芽完成，萌發率的統計從第6日至第30日，發芽率約為80%;
苗齡1. 5-3月時即可接種。 2、菌劑
選2-3月份國產成熟印度塊菌(中華塊菌)，不分大小；顯微
鏡下鏡檢孢子形態等分類學特征以確定種的正確性；孢子成熟度， 即以黑褐色孢子(成熟)與黃褐色孢子(未成熟)的比例達95 : 5。 硬毛刷在自來水中洗刷去表面泥土并清洗至無泥土殘留，無菌水 沖洗3遍；4-8。C冷藏10-20天后，-24。C冷凍保存；保存期不應 超過18個月。
菌劑制備前將冷凍子囊果從冰箱內取出，自然解凍。解凍后 用小刀將每一子囊果切為數塊；將切塊放置于PHILIPS HR2839型 二合一攪拌機中，每次放子囊果約200g，加無菌水粉碎，最初加 水少許，后逐漸增加水量，粉碎約3-4分鐘，顯微鏡下鏡檢，以 確定無肉眼可見的組織塊，95%的子囊彼此分離，約5%以上的孢子 從子囊內分離出為止。菌劑的濃度以每克子囊果/水=lg/3-5ml 為宜。
孢子計數菌劑原液充分攪勻，在容器上中下部位各取lml， 置于3個量筒內，量筒內lml稀釋至10ml，攪勻；每一量筒上中 下部各取一滴，置血球計數板；算出單位體積原液折合的孢子數 目；同時，取原液10ml菌劑以無菌水稀釋20倍后置燒杯中供接 種時蘸根。 '3、 接種
(1) 基質制備及PH值確定
腐殖質2目過篩，適量拌入自來水，使水分含量約30%， 121-126° C高壓蒸汽滅菌3小時；以上高壓滅菌后的腐殖質與蛭石
(滅菌或否)以體積比1/l的比例混合后備用；
以上基質取一定質量(如100g)，分為4等份，在各等份中分 別加入不同質量的熟石灰粉，充分混勻，每份各取30ml，加入150ml 蒸餾水，其間攪'動數次，l小時后，用精密pH試紙(5. 5-9. 0)測 得每份基質的PH值。計算或推算pH為7_7.6時基質與石灰的質 量比。按以上比例在基質中加入石灰，充分混勻后備用。
(2) 接種
方法按每株接種5xl()7個孢子的量折算出每株需接種的菌劑 原液的體積，如菌劑原液稀釋20倍后，以量筒量取5 ml菌劑后 澆入基質，將菌劑與基質拌勻備用；幼苗自育苗基質中取出，用 剪刀剪去根的末端以促使生出更多的側根；將根系全部浸沒入步 驟2制備的稀釋菌劑后取出，容器底部1/5放入接種基質后將幼 苗植入；基質占容器容積的4/5。
4、 菌根苗培育
接種苗置于自然通風大棚，自來水澆灌，干溫交替，培養溫 度10-30°C，每天光照10-14小時。
5、 菌根形態
接種后約需3-5個月，塊菌菌絲侵入幼苗根系形成菌根。確 認菌根是否形成，需要從菌根形態及其解剖特征和分子水平(即親子鑒定)予以確認。
夕卜觀牛寺征菌根系統 (mycorrhizal systems ) 二叉狀 (dichotomous)，有時近珊瑚狀(coralloid)或介于以上兩種類 型之間，偶簡單不分枝(unramified)，總長2-4.6 mm，具1- 4 級次生分枝，有時數個具3-4級分枝的菌根沿根緊密排列形成近 簇狀；末級分枝棒狀或近圓柱狀，頂端直，長0.8-3.9 min，頂端 直徑(220) 350 - 500 Mm，基部粗250-350 jam,表面光滑，有時 具外延菌絲，最末端淡黃色至近白色，較小黃褐色或紅褐色，向 基部顏色漸深，偶頂端與基部同色，常形成深淺相伺的蛇紋樣； 菌套明顯，有時表面覆外延菌絲，菌套細胞不透明；皮層細胞不 可見；外延菌絲缺或僅限于最末一級分枝，長，白色，明顯。菌 索末見。菌核末見。
解剖特征外菌套平面觀非膠質化，擬薄壁組織 (pseudoparenchymatous t issue) M型(依Agerer， 1987-2002)， 表面具表皮樣細胞(epidermal cells),不具菌絲網(hyphal nets),細胞薄壁，黃褐色，常局部菌絲顏色較深，表面光滑無附 屬物，長10 - 25 Mm，粗(5) 8 - 20 jim，每20 )umX 20 方塊 內7- IO個細胞(包含完整的與僅部分位于樣方的細胞)。內菌套 平面觀介于疏絲組織型(pletenchymatous tissue)與擬薄壁組 織型之間，接近H型(依Agerer， 1987-2002)，多數部位近哈蒂 氏狀(Hartig net-like),菌絲排列較緊密，粗2- 4 ^n，薄壁， 無色；外延菌絲伸長，近等粗，圓柱狀，粗2-3pm，薄壁，少分 枝，無色。鎖狀聯合缺。囊狀體和厚垣孢子缺。
分子水平驗證經過制菌劑子實體和截取華山松菌根樹苗菌 根總DNA的提取，采用了改進的CTAB法和真菌DNA試劑盒、PCR擴增及ITS1/ITS4禾n ITS4/ITS5對比分析，分別都得到100%的一 致性，表明所培育獲得的華山松幼苗菌根是由印度塊菌菌絲侵入 形成的；確認華山松印度塊菌菌根合成成功。
菌根數量抽樣統計每株菌根數量為700-800個，單株根系 感染率(菌根數/ (不感染根尖數+菌根數)為95%。
注此處"一個菌根"的定義為由連續的可識別的菌套所 覆蓋的區域所形成一個單元。多分枝的菌根，若由連續的菌套所 覆蓋，視為一個菌根。
與現有技術相比，本發明具備的優益性在于
本發'明為實現國產印度塊菌及其近緣種的人工栽培奠定了必 備的關鍵技術。通過本發明實現了國產塊菌與華山松菌根的合成， 利用本方法可以大批量規模化合成培育菌根樹苗，為下一步塊菌 的人工種植產業化提供技術保障。本發明可應用于荒山土壤修復 與改良、植樹造林及植被的修復與重建，對于開發利用石灰巖山 地區及偏僻山地林區具有巨大潛力和廣闊的應用前景。本發明的 方法操作簡易，容易廣泛應用與推廣。本發明為生物學(微生物 學、菌物學)與農學與林學(栽培學和林業)及其交叉學科菌根
學Mycorrhizology領域的技術交叉，汲取了多個學科的多重優點， 具有實用簡便的優勢。
權利要求
1、中華塊菌與華山松菌根合成方法，包括下述步驟(1)華山松播種和育苗，A、取4-8℃冰箱內保藏2-12個月的華山松種子，30％H2O2浸泡2小時，無菌水沖洗數次，棄去漂浮的種子，再用無菌水浸泡48小時，撈出，用機械方式使種子輕微破口，復用75％酒精棉紗擦拭消毒，放培養皿中備用；B、基質備用，取未過篩蛭石與珍珠巖按體積比1/1混勻，加入水使其含水量達30％，121-126℃下高壓蒸汽滅菌1小時；或者取新生產的蛭石和珍珠巖；C、播種，將(1)A步驟中備好的種子，以開口端向下的方向播入基質，播種深度為1.5-2cm；D、育苗；(2)中華塊菌菌劑制備和接種，A、菌劑制備，選2-3月份產的成熟中華塊菌，顯微鏡下觀察孢子形態，黑褐色孢子與未成熟黃褐色孢子的比例達95∶5為成熟子囊果，成熟子囊果用自來水清洗干凈后，無菌水沖洗3遍，4-8℃冷藏10-20天后，再在-24℃冷凍保存不超過18個月備用；菌劑制備前將冷凍子囊果取出，自然解凍，將每一子囊果切為數塊，放置于攪拌機中，加無菌水粉碎，顯微鏡下鏡檢，確定95％的子囊游離，5％的孢子從子囊分離出為止，菌劑的濃度為每克子囊果/水＝1/3-5；B、接種基質制備及pH值調整，腐殖質土過篩，適量拌入水，使水分含量30％，高壓滅菌3小時備用；腐殖質、水、蛭石以體積比1/1/1的比例混合，加入石灰粉，混勻，調整pH為7，備用；C、接種，按每株接種5×107個孢子的量折算出每株需接種的菌劑的體積，取菌劑澆入基質，拌勻；將步驟(1)所得幼苗自育苗基質中取出，去根末端，將菌的根系全部浸入步驟(2)A制備的菌劑后取出，植入步驟(2)B的接種基質；(3)菌根苗培育，苗置于自然通風大棚，自來水澆灌，干溫交替培養，培養溫度10-30℃，太陽光照10-14小時。
2、按照權利要求1所述的方法，其特征在于 (1)華山松種子篩選和育苗，A、種子的篩選與消毒殺菌選取保藏在4-8°C冰箱1年以內 的華山松種子，用30%&02浸泡2小時，期間每15分鐘攪拌1次， 之后無菌水沖洗4-5次，棄去漂浮的種子，再用無菌水浸泡48小 時，撈出，用機械方式使種子輕微破口，反復用75%酒精棉紗擦拭 消毒，置于培養皿中備用；B、基質的制備取未過篩的蛭石與珍珠巖按體積比1/1的 比例混勻，加入水使其含水量達30%，在121-126°C下高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌1個小時；將制備好的基質在無菌的條件下分裝入容 器為425 x 340x 200 mm透水塑料容器備用；C、播種將(1) A步驟中備好的種子，以開口端向下的方向播入步驟(O B制備好的基質容器內，播種深度為1.5-2 cm， 覆蓋培養；D、育苗無菌水澆灌；播種后通常第10日開始出芽，30 日種子出芽大部分完成；苗齡在1. 5-3月時開始接種。'(2)印度塊菌菌劑制備和接種，A、 菌劑制備選取成熟的印度塊菌即中華塊菌子實體，顯微鏡下鏡檢確認子實體準確，并檢查無其它塊菌混入；鏡檢觀察到 黑褐色孢子達到95%以上子實體為成熟的子囊果；成熟子囊果用毛 刷及自來水清洗干凈后，無菌水沖洗3-4遍，置4-8。C冷藏冰箱 內冷藏10-20天后，移入-24。C冷凍保藏箱內保藏備用；保藏時間不超過18個月；菌劑制備前將冷凍子囊果取出，自然解凍，將每一子囊果切為數塊，放置于攪拌機中，加無菌水粉碎；顯微鏡下鏡檢，確定 95%以上的子囊游離，5%的孢子從子囊中分離出為止；菌劑的濃度 為每克子囊果用水3-5 ml稀釋為宜，制成菌劑原液備用；用時可 再稀釋20倍；B、 接種基質制備及pH值調整腐殖質土過篩，適量拌入水， 使水分含量達30%，高壓滅菌3小時；滅菌后的腐殖質與蛭石以體 積比1: 1的比例混均；加入適量石灰粉，混勻調整pH值為7—7.6 為宜，備用；C、接種，按每株需接種5"07個孢子的量折算出每株需接種的菌劑的體積，取菌劑原液稀釋后澆入上述滅菌后的基質內，充 分拌勻；將步驟(1)所得無菌幼苗自育苗基質中取出，剪去根末 端，將幼苗根系全部浸入步驟(2) A制備的菌劑稀釋夜中沾取孢子菌劑后取出，.植入步驟(2) B制備的接種基質中培養；(3)菌根幼苗的培育與管理接種幼苗置于自然通風的塑料大棚內，自來水澆灌，干濕交替培養，培養溫度為10-26°C，每天 光照10-14小時；華山松印度菌根苗培育5-6個月后，移植。
全文摘要
中華塊菌與華山松菌根合成方法，涉及一系列程序步驟，即華山松種子和塊菌菌種子實體的篩選、無菌樹苗的培育、菌劑制備、培養基質的配置、優選及其接種，菌根苗的培養與菌根形態解剖及分子的檢測和確認，移植栽培，最終實現人工栽培塊菌。
文檔編號C12N1/14GK101328464SQ20081005844
公開日2008年12月24日 申請日期2008年5月27日 優先權日2008年5月27日
發明者于富強, 劉培貴, 王向華, 田霄飛, 耿麗英, 鄧曉娟, 娟 陳 申請人:中國科學院昆明植物研究所