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一種塊菌與菌根合成方法

文檔序號:597144閱讀:449來源:國知局
專利名稱:一種塊菌與菌根合成方法
技術領域
本發明屬于生物技術領域,具體涉及印度塊菌(中 華塊菌)與華山松菌根的合成方法。
背景技術
塊菌(truffles)屬于松、櫟等林下土中生的外 生菌根食用真菌(edible ectomycorrhizal fungi),由于富含有 蛋白質等營養物質及特殊催欲類化合物和人類免疫系統調節物 質,成為高蛋白、低脂肪、食療兼顧的綠色生態功能性食品,在 歐洲乃至全球倍受青睞,被譽為廚房里的"黑鉆石",是世界上 迄今最為昂貴的天然食品。我國每年出口印度塊菌(中華塊菌) 360多噸,成為山地林區脫貧致富的新型野生菌根食用菌。并且越 來越受到人們的普遍歡迎,需求日益旺盛。由于所采集的塊菌完 全依賴于林下自然資源,自然產量已供不應求;特別是商業化地 毯式的采集方式,自然生存狀況受到極大的干擾和破壞,近些年 來已導致自然產量大幅度降低;若不采取相應措施,幾年之后必 然成為瀕危物種,乃至消失滅絕。如何實現塊菌類菌根野生食用 菌持續利用已成為世界性難題和創新性研究的熱焦點問題。因此, 首先用塊菌菌種與無菌樹苗在脅迫的條件下合成菌根苗,在人工 菌根合成的基礎上,進行塊菌人工栽培種植已成為塊菌持續發展 的必然要求和必由之路。其中塊菌苗菌根的合成成為塊菌栽培的 關鍵技術。迄今,現有技術中未見有印度塊菌(中華塊菌)與華 山松菌根合成方法的報道和記載。

發明內容
本發明的目的在于提供一種印度塊菌(中華塊菌) 與華山松菌根合成方法。該方法涉及一系列程序步驟,即華山松 種子和塊菌菌種子實體的篩選、無菌樹苗的培育、菌劑制備、培 養基質的配置、優選及其接種,菌根苗的培養與菌根形態解剖及 分子的檢測和確認,移植栽培,以最終實現人工栽培塊菌。
為了實現本發明的上述目的,本發明提供了如下的技術方案 中華塊菌與華山松菌根合成方法,包括下述步驟
(1) 華山松播種和育苗,
A、 取4-8°C冰箱內保藏2-12個月的華山松種子,30%&02浸 泡2小時,無菌水沖洗數次,棄去漂浮的種子,再用無菌水浸泡 48小時,撈出,用機械方式使種子輕微破口 ,復用75%酒精棉紗 擦拭消毒,放培養皿中備用;
B、 基質備用,取未過篩蛭石與珍珠巖按體積比1/1混勻,加 入水使其含水量達30%, 121-126°C下高壓蒸汽滅菌1小時;或者 取新生產的蛭石和珍珠巖;
C、 播種,將(1) A步驟中備好的種子,以開口端向下的方 向播入基質,播種深度為1.5-2 cm;
D、 育苗;
(2) 中華塊菌菌劑制備和接種,
A、菌劑制備,選2-3月份產的成熟中華塊菌,顯微鏡下觀察 孢子形態,黑褐色孢子與未成熟黃褐色孢子的比例達95:5為成熟 子囊果,成熟子囊果用自來水清洗干凈后,無菌水沖洗3遍,4-8°C冷藏10-20天后,再在-24。C冷凍保存不超過18個月備用;菌劑 制備前將冷凍子囊果取出,自然解凍,將每一子囊果切為數塊,
放置于攪拌機中,加無菌水粉碎,顯微鏡下鏡檢,確定95%的子囊 游離,5%的孢子從子囊分離出為止,菌劑的濃度為每克子囊果/水 二 1/3-5;
B、 接種基質制備及pH值調整,腐殖質土過篩,適量拌入水, 使水分含量30%,高壓滅菌3小時備用;腐殖質、水、蛭石以體積 比1/1/1的比例混合,加入石灰粉,混勻,調整pH為7,備用;
C、 接種,按每株接種5xl07個孢子的量折算出每株需接種的 菌劑的體積,取菌劑澆入基質,拌勻;將步驟(1)所得幼苗自育 苗基質中取出,去根末端,將菌的根系全部浸入步驟(2) A制備 的菌劑后取出,植入步驟(2) B的接種基質;
(3)菌根苗培育,苗置于自然通風大棚,自來水澆灌,干溫 交替培養,培養溫度10-30°C,太陽光照10-H小時。
本發明技術方案的提出基于下述的塊菌菌根合成原理印度 塊菌(中華塊菌)是一種與木本(主要為松科Pinaceae、殼斗科 Fagaceae、榛科Corylaceae、樺木科Betulaceae等)植物開;成夕卜 生菌根的共生性地下生真菌,其生長發育及子實體形成都必須與 這些植物的根系共生才能實現。因此采用人工合成的基質培育樹 苗,用塊菌的組織和孢子制成菌種菌劑接種,在人為控制的條件 下,滿足塊菌菌劑孢子萌發感染樹苗幼根的需求,促成菌根的形 成,把合成的菌根樹苗種植栽培在適宜的山地(PH值7-7.6、炭 氮比C/N二10),以實現塊菌的人工栽培,確保持續發展。本發明印度塊菌(中華塊菌)與華山松菌根合成的方法,優化 了菌根樹苗的培育、培養基質和菌劑制作及菌根合成和菌根的檢 測與確認。
本發明具體的合成步驟和技術方法如下
1. 基質制備與育苗
基質制備蛭石與珍珠巖按體積比1/1混勻,加入自來水使 其含水量達30%,121-126。C下高壓蒸汽滅菌1小時后冷卻備用(若 為新生產的蛭石和珍珠巖也可不必滅菌,可直接使用)。
播種與育苗挑選成熟飽滿的種子,用75%酒精表面消毒滅菌, 以機械的方法使其開裂微口 ,開口端向下播入上述基質。播種深
度1.5-2 cm為宜;要適時澆灌;播種后第10日開始出芽,30日 后幾乎全部種子出芽完成,萌發率的統計從第6日至第30日;苗 齡在1.5-3月時即可接種。
2. 菌劑及其制備
子實體篩選與保藏首先顯微鏡檢鑒定印度塊菌(中華塊菌), 確認塊菌子實體準確無誤,避免其他塊菌混入;從中選取成熟的 印度塊菌,以深黑褐色的孢子量比率達95%以上的為成熟子囊果; 沖刷清洗去除泥土后,用無菌水沖洗;4-8°C冷藏箱保藏10-20天 后,移入-24°C冷凍室保存備用。
菌劑制備冷凍子囊果自然解凍,用小刀將每一子囊果切為 數塊;將小切塊放置于攪拌機中,加無菌水粉碎,顯微鏡下鏡檢, 以確定無肉眼可見的組織塊,使95%的子囊游離,約5%的孢子從 子囊分離出為止。菌劑的濃度以每克子囊果/水二 lg/3-5ml為宜。3. 接種
基質制備及PH值調整腐殖質土過篩,適量拌入水,水分含 量30%,高壓滅菌3小時備用;滅菌后的腐殖質與蛭石以體積比
1/1的比例混均,加入石灰粉,充分混勻,調整pH值為7—7.6
時即可備用。
接種與培育根據每株接種含有5xl07個孢子菌劑的劑量要
求,取上述制成的菌劑原液稀釋20倍,取5ml稀釋菌液移入基質, 攪拌均勻;取上述培養的幼苗剪去根端,并將整個根系浸入稀釋 菌劑之后移植基質培育。接種后的幼苗置于自然通風大棚培育。
4. 菌根形態及分子水平驗證
外觀特征菌根形成后菌根末級分枝棒狀或近圓柱狀,表面
光滑,有時具外延菌絲,最末端淡黃色至近白色,向基部顏色漸
深,常形成深淺相間的蛇紋樣斑;菌套明顯,有時表面覆蓋外延
菌絲,菌套細胞不透明。抽樣統計每株菌根數量均為700-800個, 單株根系感染率達95%以上。
解剖特征外菌套平面觀非膠質化,擬薄壁組織 (pseudoparenchymatous tissue) M 型,表面具表皮樣細胞 (epidermal cells )。內菌套平面觀介于疏絲組織型 (pletenchymatous tissue)與擬薄壁組織型之間,近H型,多 數部位近哈蒂氏狀(Hartig net-like),菌絲排列較緊密,粗2 - 4 pm,薄壁,無色;外延菌絲伸長,近等粗,圓柱狀,薄壁,少分 枝,無色。
分子水平驗證經過制菌劑子實體和截取華山松菌根樹苗菌 根總DNA的提取,采用了改進的CTAB法和真菌DNA試劑盒、PCR擴增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5對比分析,分別都得到100%的一 致性,表明所培育獲得的華山松幼苗菌根是由印度塊菌菌絲侵入 形成的;確認華山松印度塊菌菌根合成成功。
具體實施例方式為了更好地了解本發明,下面用本發明的實 施例證來進一步說明本發明的內容,但本發明的內容并不局限于 此。
實施例1:
印度塊菌(中華塊菌)與華山松菌根苗合成方法 1、華山松育苗
(1) '備種
秋季采集成熟華山松種子,4-8。C冰箱內保藏,保藏期不超過 l年。用前取出,30%&02浸泡2小時,其間攪動數次一無菌水沖 洗數次一棄去漂浮的種子一無菌水浸泡48小時,撈出一用機械方 式,使種子輕微破口一復用75%酒精棉紗擦拭消毒,放培養皿中備 用。
(2) 基質
蛭石(未過篩)與珍珠巖按體積比1/1混勻,加入自來水使 其含水量達30%, 121-126°C下高壓蒸汽滅菌1小時;若為新生產 的蛭石和珍珠巖也可不滅菌直接使用。
(3) 播種
將備好的種子,以開口端向下的方向播入基質。播種深度為 1.5-2 cm;容器為425 x 340x 200 mm透水塑料筐。(4)育苗
自來水澆灌;播種后第10日開始出芽,30日后幾乎全部種子 出芽完成,萌發率的統計從第6日至第30日,發芽率約為80%;
苗齡1. 5-3月時即可接種。 2、菌劑
選2-3月份國產成熟印度塊菌(中華塊菌),不分大小;顯微
鏡下鏡檢孢子形態等分類學特征以確定種的正確性;孢子成熟度, 即以黑褐色孢子(成熟)與黃褐色孢子(未成熟)的比例達95 : 5。 硬毛刷在自來水中洗刷去表面泥土并清洗至無泥土殘留,無菌水 沖洗3遍;4-8。C冷藏10-20天后,-24。C冷凍保存;保存期不應 超過18個月。
菌劑制備前將冷凍子囊果從冰箱內取出,自然解凍。解凍后 用小刀將每一子囊果切為數塊;將切塊放置于PHILIPS HR2839型 二合一攪拌機中,每次放子囊果約200g,加無菌水粉碎,最初加 水少許,后逐漸增加水量,粉碎約3-4分鐘,顯微鏡下鏡檢,以 確定無肉眼可見的組織塊,95%的子囊彼此分離,約5%以上的孢子 從子囊內分離出為止。菌劑的濃度以每克子囊果/水=lg/3-5ml 為宜。
孢子計數菌劑原液充分攪勻,在容器上中下部位各取lml, 置于3個量筒內,量筒內lml稀釋至10ml,攪勻;每一量筒上中 下部各取一滴,置血球計數板;算出單位體積原液折合的孢子數 目;同時,取原液10ml菌劑以無菌水稀釋20倍后置燒杯中供接 種時蘸根。 '3、 接種
(1) 基質制備及PH值確定
腐殖質2目過篩,適量拌入自來水,使水分含量約30%, 121-126° C高壓蒸汽滅菌3小時;以上高壓滅菌后的腐殖質與蛭石
(滅菌或否)以體積比1/l的比例混合后備用;
以上基質取一定質量(如100g),分為4等份,在各等份中分 別加入不同質量的熟石灰粉,充分混勻,每份各取30ml,加入150ml 蒸餾水,其間攪'動數次,l小時后,用精密pH試紙(5. 5-9. 0)測 得每份基質的PH值。計算或推算pH為7_7.6時基質與石灰的質 量比。按以上比例在基質中加入石灰,充分混勻后備用。
(2) 接種
方法按每株接種5xl()7個孢子的量折算出每株需接種的菌劑 原液的體積,如菌劑原液稀釋20倍后,以量筒量取5 ml菌劑后 澆入基質,將菌劑與基質拌勻備用;幼苗自育苗基質中取出,用 剪刀剪去根的末端以促使生出更多的側根;將根系全部浸沒入步 驟2制備的稀釋菌劑后取出,容器底部1/5放入接種基質后將幼 苗植入;基質占容器容積的4/5。
4、 菌根苗培育
接種苗置于自然通風大棚,自來水澆灌,干溫交替,培養溫 度10-30°C,每天光照10-14小時。
5、 菌根形態
接種后約需3-5個月,塊菌菌絲侵入幼苗根系形成菌根。確 認菌根是否形成,需要從菌根形態及其解剖特征和分子水平(即親子鑒定)予以確認。
夕卜觀牛寺征菌根系統 (mycorrhizal systems ) 二叉狀 (dichotomous),有時近珊瑚狀(coralloid)或介于以上兩種類 型之間,偶簡單不分枝(unramified),總長2-4.6 mm,具1- 4 級次生分枝,有時數個具3-4級分枝的菌根沿根緊密排列形成近 簇狀;末級分枝棒狀或近圓柱狀,頂端直,長0.8-3.9 min,頂端 直徑(220) 350 - 500 Mm,基部粗250-350 jam,表面光滑,有時 具外延菌絲,最末端淡黃色至近白色,較小黃褐色或紅褐色,向 基部顏色漸深,偶頂端與基部同色,常形成深淺相伺的蛇紋樣; 菌套明顯,有時表面覆外延菌絲,菌套細胞不透明;皮層細胞不 可見;外延菌絲缺或僅限于最末一級分枝,長,白色,明顯。菌 索末見。菌核末見。
解剖特征外菌套平面觀非膠質化,擬薄壁組織 (pseudoparenchymatous t issue) M型(依Agerer, 1987-2002), 表面具表皮樣細胞(epidermal cells),不具菌絲網(hyphal nets),細胞薄壁,黃褐色,常局部菌絲顏色較深,表面光滑無附 屬物,長10 - 25 Mm,粗(5) 8 - 20 jim,每20 )umX 20 方塊 內7- IO個細胞(包含完整的與僅部分位于樣方的細胞)。內菌套 平面觀介于疏絲組織型(pletenchymatous tissue)與擬薄壁組 織型之間,接近H型(依Agerer, 1987-2002),多數部位近哈蒂 氏狀(Hartig net-like),菌絲排列較緊密,粗2- 4 ^n,薄壁, 無色;外延菌絲伸長,近等粗,圓柱狀,粗2-3pm,薄壁,少分 枝,無色。鎖狀聯合缺。囊狀體和厚垣孢子缺。
分子水平驗證經過制菌劑子實體和截取華山松菌根樹苗菌 根總DNA的提取,采用了改進的CTAB法和真菌DNA試劑盒、PCR擴增及ITS1/ITS4禾n ITS4/ITS5對比分析,分別都得到100%的一 致性,表明所培育獲得的華山松幼苗菌根是由印度塊菌菌絲侵入 形成的;確認華山松印度塊菌菌根合成成功。
菌根數量抽樣統計每株菌根數量為700-800個,單株根系 感染率(菌根數/ (不感染根尖數+菌根數)為95%。
注此處"一個菌根"的定義為由連續的可識別的菌套所 覆蓋的區域所形成一個單元。多分枝的菌根,若由連續的菌套所 覆蓋,視為一個菌根。
與現有技術相比,本發明具備的優益性在于
本發'明為實現國產印度塊菌及其近緣種的人工栽培奠定了必 備的關鍵技術。通過本發明實現了國產塊菌與華山松菌根的合成, 利用本方法可以大批量規模化合成培育菌根樹苗,為下一步塊菌 的人工種植產業化提供技術保障。本發明可應用于荒山土壤修復 與改良、植樹造林及植被的修復與重建,對于開發利用石灰巖山 地區及偏僻山地林區具有巨大潛力和廣闊的應用前景。本發明的 方法操作簡易,容易廣泛應用與推廣。本發明為生物學(微生物 學、菌物學)與農學與林學(栽培學和林業)及其交叉學科菌根
學Mycorrhizology領域的技術交叉,汲取了多個學科的多重優點, 具有實用簡便的優勢。
權利要求
1、中華塊菌與華山松菌根合成方法,包括下述步驟(1)華山松播種和育苗,A、取4-8℃冰箱內保藏2-12個月的華山松種子,30%H2O2浸泡2小時,無菌水沖洗數次,棄去漂浮的種子,再用無菌水浸泡48小時,撈出,用機械方式使種子輕微破口,復用75%酒精棉紗擦拭消毒,放培養皿中備用;B、基質備用,取未過篩蛭石與珍珠巖按體積比1/1混勻,加入水使其含水量達30%,121-126℃下高壓蒸汽滅菌1小時;或者取新生產的蛭石和珍珠巖;C、播種,將(1)A步驟中備好的種子,以開口端向下的方向播入基質,播種深度為1.5-2cm;D、育苗;(2)中華塊菌菌劑制備和接種,A、菌劑制備,選2-3月份產的成熟中華塊菌,顯微鏡下觀察孢子形態,黑褐色孢子與未成熟黃褐色孢子的比例達95∶5為成熟子囊果,成熟子囊果用自來水清洗干凈后,無菌水沖洗3遍,4-8℃冷藏10-20天后,再在-24℃冷凍保存不超過18個月備用;菌劑制備前將冷凍子囊果取出,自然解凍,將每一子囊果切為數塊,放置于攪拌機中,加無菌水粉碎,顯微鏡下鏡檢,確定95%的子囊游離,5%的孢子從子囊分離出為止,菌劑的濃度為每克子囊果/水=1/3-5;B、接種基質制備及pH值調整,腐殖質土過篩,適量拌入水,使水分含量30%,高壓滅菌3小時備用;腐殖質、水、蛭石以體積比1/1/1的比例混合,加入石灰粉,混勻,調整pH為7,備用;C、接種,按每株接種5×107個孢子的量折算出每株需接種的菌劑的體積,取菌劑澆入基質,拌勻;將步驟(1)所得幼苗自育苗基質中取出,去根末端,將菌的根系全部浸入步驟(2)A制備的菌劑后取出,植入步驟(2)B的接種基質;(3)菌根苗培育,苗置于自然通風大棚,自來水澆灌,干溫交替培養,培養溫度10-30℃,太陽光照10-14小時。
2、按照權利要求1所述的方法,其特征在于 (1)華山松種子篩選和育苗,A、種子的篩選與消毒殺菌選取保藏在4-8°C冰箱1年以內 的華山松種子,用30%&02浸泡2小時,期間每15分鐘攪拌1次, 之后無菌水沖洗4-5次,棄去漂浮的種子,再用無菌水浸泡48小 時,撈出,用機械方式使種子輕微破口,反復用75%酒精棉紗擦拭 消毒,置于培養皿中備用;B、基質的制備取未過篩的蛭石與珍珠巖按體積比1/1的 比例混勻,加入水使其含水量達30%,在121-126°C下高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌1個小時;將制備好的基質在無菌的條件下分裝入容 器為425 x 340x 200 mm透水塑料容器備用;C、播種將(1) A步驟中備好的種子,以開口端向下的方向播入步驟(O B制備好的基質容器內,播種深度為1.5-2 cm, 覆蓋培養;D、育苗無菌水澆灌;播種后通常第10日開始出芽,30 日種子出芽大部分完成;苗齡在1. 5-3月時開始接種。'(2)印度塊菌菌劑制備和接種,A、 菌劑制備選取成熟的印度塊菌即中華塊菌子實體,顯微鏡下鏡檢確認子實體準確,并檢查無其它塊菌混入;鏡檢觀察到 黑褐色孢子達到95%以上子實體為成熟的子囊果;成熟子囊果用毛 刷及自來水清洗干凈后,無菌水沖洗3-4遍,置4-8。C冷藏冰箱 內冷藏10-20天后,移入-24。C冷凍保藏箱內保藏備用;保藏時間不超過18個月;菌劑制備前將冷凍子囊果取出,自然解凍,將每一子囊果切為數塊,放置于攪拌機中,加無菌水粉碎;顯微鏡下鏡檢,確定 95%以上的子囊游離,5%的孢子從子囊中分離出為止;菌劑的濃度 為每克子囊果用水3-5 ml稀釋為宜,制成菌劑原液備用;用時可 再稀釋20倍;B、 接種基質制備及pH值調整腐殖質土過篩,適量拌入水, 使水分含量達30%,高壓滅菌3小時;滅菌后的腐殖質與蛭石以體 積比1: 1的比例混均;加入適量石灰粉,混勻調整pH值為7—7.6 為宜,備用;C、接種,按每株需接種5"07個孢子的量折算出每株需接種的菌劑的體積,取菌劑原液稀釋后澆入上述滅菌后的基質內,充 分拌勻;將步驟(1)所得無菌幼苗自育苗基質中取出,剪去根末 端,將幼苗根系全部浸入步驟(2) A制備的菌劑稀釋夜中沾取孢子菌劑后取出,.植入步驟(2) B制備的接種基質中培養;(3)菌根幼苗的培育與管理接種幼苗置于自然通風的塑料大棚內,自來水澆灌,干濕交替培養,培養溫度為10-26°C,每天 光照10-14小時;華山松印度菌根苗培育5-6個月后,移植。
全文摘要
中華塊菌與華山松菌根合成方法,涉及一系列程序步驟,即華山松種子和塊菌菌種子實體的篩選、無菌樹苗的培育、菌劑制備、培養基質的配置、優選及其接種,菌根苗的培養與菌根形態解剖及分子的檢測和確認,移植栽培,最終實現人工栽培塊菌。
文檔編號C12N1/14GK101328464SQ20081005844
公開日2008年12月24日 申請日期2008年5月27日 優先權日2008年5月27日
發明者于富強, 劉培貴, 王向華, 田霄飛, 耿麗英, 鄧曉娟, 娟 陳 申請人:中國科學院昆明植物研究所
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