專利名稱：：腸道病毒ev71核酸熒光定量rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種腸道病毒EV71核酸熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，可應用于手足口病等暴發疫情的實驗室應急檢測。(二)
背景技術：
手足口病(HandfootmouthdiseaseHFMD)是嬰幼兒常見的傳染病，由腸道病毒引起，臨床上以發熱和手、足、口腔等部位出現皮滲、潰瘍等表現為主，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等致命性并發癥。手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區均有此病流行的報導。今年3月上旬，安徽阜陽幾家醫院陸續收治了以發熱伴口腔、手足臀部皮滲為主的疾病患兒，經實-瞼室4企測，確定該病為腸道病毒EV71感染。目前，廣東、浙江、山東、北京、上海等地均發現疫情。截止5月9日止，全國感染手足口病近2.5萬例，造成34名患兒死亡。中國手足口病的爆發流行引起了全球的關注，衛生部已將手足口病納入國家丙類法定報告傳染病，通過網絡直報系統對疫情進行監測。由于HFMD是由多種人腸道病毒感染引起，其中以EV71及CoxA16型最為常見，為了對該病迅速查明病因，及時采取控制措施，急需進行實驗室快速診斷，但腸道病毒傳統的檢測方法是病毒分離和中和法定型，繁瑣費時，不適合早期診斷。(三)
發明內容本發明目的是提供一種手足口病感染實驗室應急檢測的腸道病毒EV71萸光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法。本發明采用的技術方案是一種腸道病毒EV71核酸熒光定量RT-PCR4企測試劑盒，所述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的引物和4笨針序列如下EV71YGF1:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3';EV71YGRl:5,-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3';EV71YGpbl:5'畫TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3,。此外本試劑盒中還包括dNTP,MgCl2,RNase抑制劑，AMV逆轉錄酶，Taq酶等，這些組分對于本領域技術人員來說屬于公知常識，可根據需要選用。本發明還涉及腸道病毒EV71核酸的熒光定量RT-PCR檢測方法，所述方法包括(1)根據腸道病毒EV71基因序列，設計引物和探針序列如下EV71YGF1:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA誦3';EV71YGRl:5，-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3';EV71YGpbl:5'-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC陽3，；(2)提取待測樣品RNA，以待測樣品RNA為模板、在包括步驟(1)所述引物和探針序列的RT-PCR反應體系中進行RT-PCR反應；(3)對RT-PCR反應產物進行熒光檢測，根據焚光檢測的最低Ct值和最高熒光強度判斷結果，熒光RT-PCR反應呈陽性，則待測樣品含有腸道病毒EV71核酸。本發明關鍵在于引物和探針序列的設計，RT-PCR反應體系組成、反應條件選擇和反應結果判斷均可按本領域常規方法進行。所述RT-PCR反應體系每25nL組成如下優選的，所述熒光定量RT-PCR反應體系每25juL組成如下RT-PCR緩沖液終濃度為lxExTaqHS0.1U/|uLRTEnzymeMixII0.1U/|LiL上游與下游引物各0.40pM探針0.20fiM模板RNA8|LiLDEPC水補足至25juL。所述RT-PCR緩沖液為onestepRT-PCR緩沖液，其終濃度為1x,是指緩沖液各組分在反應體系中的終濃度與1xonestepRT-PCR中各組々的濃度相同。通常采用反應體系1/2體積的2xonestepRT-PCR。優選的，所述熒光定量RT-PCR反應條件為42°C30min,95°C2min進行逆轉錄，然后95。C5s，55°C35s，在55。C進行單點熒光檢測，共進4亍40個循環。所述樣品RNA提取可按常規方法進行，如采用德國QIAGEN公司的RNeasyMiniKit或其它試劑盒，按照試劑盒說明書進行提取。HFMD由人腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackievirus)A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型；埃可病毒(ECHOviruses)和腸道病毒71型(EV71)感染引起，其中以EV71及CoxA16型最為常見。EV71感染兒童引起的手足口病大部分病例病情較輕，可治愈,但少數患者可出現心肌炎、無菌性腦膜炎和肺水腫等并發癥，嚴重時可危及生命。對手足口病爆發疫情盡早作出實驗室確診是及時采取防控措施與對診治療的關鍵。腸道病毒檢測傳統的方法是采用細胞培養進行病毒分離，然后用腸道病毒組合血清進行型別鑒定，該方法雖然正確可靠，但繁雜耗時，不適應早期應急診斷。近年來，隨著分子生物學技術的發展，采用RT-PCR技術對腸道病毒進行診斷國內外已有報導，它具有靈敏度高，特異性強，所需時間短等優點，目前已在腸道病毒的核酸檢測中得到應用[4-6],但其檢測時間仍需67h,且容易由于PCR擴增產物污染而產生^f叚陽性。近幾年發展起來的以特異性熒光探針為特點的熒光定量PCR技術，實行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴增產物污染的機會，而且較常規RT-PCR技術，無論從敏感性，特異性與速度上都更具有優勢，當然它對引物和探針的設計也提出了更高的要求。本申請發明人從美國的NCBI基因庫上下載了近二十年來世界各地的腸道EV71毒林，對其進行了同源性比較，在EV71的VP1區設計若干對引物與Taqman探針，對該區域進行特異性擴增，從中篩選出最佳的引物和探針，并對熒光RT-PC方法進行優化，驗證其每l感性、特異性和重復性。經腸道病毒標準抹、EV71毒株與近期手足口病爆發疫情疑似患者臨床樣本的檢測比較，該方法具有高特異性，只能檢出腸道EV71型，與其他腸道病毒如柯薩奇A組CA4、CA16、CA21、柯薩奇B5、艾苛病毒E6、E30、POLIOI型等毒株均無交叉反應，而且比常規RT-PCR法更敏感、快速和簡便。腸道病毒EV71的RT-PCR檢測敏感度在l.OTCIDso左右，從病毒核酸提取、RT-PCR反應與電泳，整個過程大約需6~7h左右，而采用本方法從核酸提取至完成檢測，僅需3h左右，能同時完成多個疑似患者臨床樣本的高通量檢測，敏感度達0.1TCID5G,比普通PCR的靈敏度高10倍左右，可直接從手足口病患者的腦脊液、糞便、皰疹液等臨床樣本中檢測腸道病毒EV71核酸，而且EV71核酸陽性的樣本可與腸道病毒通用熒光RT-PCR法檢測的腸道病毒核酸互相驗證。用建立的新方法，對近期浙江省疑似手足口病爆發疫情疑似患者120份臨床樣本進行實驗室早期快速診斷，獲得了令人滿意的結果，為該病及時采耳又控制措施發揮了很好的作用。本發明的有益效果主要體現在本發明方法對腸道病毒EV71的檢測有高度的特異性，與其他腸道病毒CA16、CA4、CA21、E6、E30、CoxB5、POLIO等病毒無交叉反應；本發明方法檢測的靈敏度達0.1TCID50,可直接從疑似手足口病患者的腦脊液、皰滲液和糞便等標本中檢測腸道病毒EV71核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右；本發明方法一種快速檢測腸道病毒EV71特異、敏感的方法，非常適用于手足口病等由腸道病毒EV71感染引起突發疫情的實驗室早期診斷。(四)圖1為腸道病毒EV71熒光RT-PCR方法特異性試驗結果；A:腸道病毒EV71;B和C:手足口病患者的皰滲液；圖2為熒光RT-PCR法檢測腸道病毒EV71的靈敏度；AE分別代表不同的病毒濃度，乂人A至E依次為1000、100、10、1、0.1TCIDso;圖3為熒光RT-PCR法檢測手足口病疑似患者臨床樣本中腸道病毒EV71核酸；A:腸道EV71陽性對照，B:手足口病疑似患者臨床樣本的檢觀'J。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1:1材料與方法1.1病毒林與臨床標本腸道病毒EV71、柯薩奇A組(CA)CA4、CA16、CA21、柯薩奇B5、E6、E30、POLIO1型等病毒林來源于中國醫學科學院、北京生物制品研究所和浙江省疾病預防控制中心分離林。臨床樣本來源于近期浙江省手足口病爆發疫情疑似患者的腦脊液、皰滲液、糞便等，樣本采集后帶冰運送到實驗室。1.2引物與探針從GenBank上下載不同年份和地區的腸道病毒EV71基因序列，用生物學軟件進行同源性比較，在VP1區設計特異性引物和TaqMan探針，序列為EV71YGFl:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3,，EV71YGRl:5，-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3，，EV71YGpb1:5，-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC—3'。引物和探針委托上海基康生物工程有限公司合成。1.3病毒定量標準與病毒RNA的提取以腸道病毒EV71為標準毒株，用人橫紋肌瘤細胞(RD)進行病毒效價滴定(1062TCID5。/ml)后作為參考林，將其稀釋至IOOO、100、10、1、0.1、0.01TCID5o每個反應管。病毒RNA的提取采用德國QIAGEN公司的ReansyMiniKit,按試劑盒說明書提取。1.4熒光RT-PCR反應體系和條件的優化試劑盒選用Takara^^司的onestepPrimeScriptRT-PCR(PerfectRealtime),Code:DRR064A,按說明書操作，反應體系為25pl，其中2xonestepRT畫PCR緩沖液12.5ul,ExTaqHS(5U/|il)0.5ul,RTEnzymeMixII(5U/|il)0.5ul(試劑盒自帶)，上游與下游引物(20(imol/L)各0.6(al，探針(20pmol/L)0.3|ul,模板RNA8(al，DEPC水1.5|il。反應條件為42°C30min,95°C2min進行逆轉錄，然后95°C5s，55°C35s,在55。C進行單點熒光4全測，共進行40個循環。結果判斷選擇熒光檢測模式FAM,熒光基線調整取3-15個循環的熒光信號平均值，閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點，樣本呈典型的擴增曲線，判斷為陽性。無典型的擴增曲線，判斷為陰性。體系的優化試驗，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應體系中，引物濃度乂人100~900(imo1/〗笨針濃度從50~300jmiol/采用矩陣法優選引物和探針的最佳濃度，根據最低Ct值和最高熒光強度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。1.5RT-PC版應腸道病毒EV71RT-PCR引物序列，上游159S:5，匿ACYATGAAAYTGTGCAAGG-3，，下游162A:5'畫CCRGTAGGKGTRCACGCRAC-3'。擴增片斷448bp。采用TAKARA公司onestepRT-kit(code:DRR024A)，按試劑盒說明書操作，反應體系為25|11,其中10xRT-PCR緩沖液2.5ul,MgCl225ul(25mM),dNTP混合物(各10mM)2.5|ul,RNase抑制劑(40U/|al)0.5^1,AMV酶(5U/pl)0.5ul,Taq酶(5U/|il)0.5ul，上游與下游引物(20^M)各0.5|il，模板RNA8|ul,DEPC水4.5(J。反應條件為50。C30min,95°C3min進行逆轉錄，然后95。C20s,50°C25s,72°C30s進4亍擴增，40個循環后轉入72。C10min,取8iul產物電泳后判斷有無特異性條帶(448bp)。1.6焚光RT-PCR特異性、敏感性和重復性試驗選擇腸道病毒EV71C型毒林柯薩奇A組CA4、CA16、CA21、柯薩奇B5、艾柯病毒E6、E30、POLIO1型和近期手足口;^暴發疫情疑似患者的腦脊液、皰滲液和糞便等臨床樣本，對上述病毒抹和樣本分別提取核酸，用腸道病毒EV71熒光RT-PCR方法進朽-;險測，^驗-〖正方法的特異性；對已標定TCID50的腸道病毒EV71型(1062TCID50/ml)稀釋后分別提取RNA,平行進行熒光RT-PCR與RT-PCR反應，比較其靈壽丈度。此外，對每一個濃度的病毒稀釋液作3次重復檢測，得到的Ct值計算標準差，驗證方法的重復性。2結果2.1熒光RT-PCR反應體系及條件采用TAKARA公司的一步法焚光RT-PCR試劑盒，總反應體系為25ILil。矩陣法優選后引物最佳濃度均為0.4pM，探針最佳濃度為0.2pM,模板RNA8jil，最后用DEPC水補至25jil。用MJResearchOption2熒光斗企測系統進行才企測，反應參凌史為42°C30min逆轉錄，95。C變性2min,以95。C5s,55。C35s擴增40個循環，在55。C進行單點焚光纟企測，可獲得最低Ct值和最高熒光強度。2.2特異性試驗本發明建立的熒光RT-PCR方法對腸道病毒EV71具有較好的特異性，對其他腸道病毒如CA16、CA4、CA21、E6、E30、COXB5、POLIOl型等無交叉反應，近期流行的手足口病患者的皰滲液顯示陽性反應。結果見圖1。2.3敏感性試驗對腸道病毒EV71毒株，采用RD細胞進行病毒效價測定(1062TCID50/ml),然后稀釋成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID50,提取病毒RNA,分別用焚光RT-PCR與常規RT-PCR方法進行檢測，結果熒光RT-PCR方法^r測每丈感性達到0.1TCID5。，RT-PCR方法4企測每丈感性達1.0TCID5Q,熒光RT-PCR方法比常規RT-PCR方法的靈敏度高10倍左右(見圖2)。2.4重復性試-驗腸道病毒EV71毒株按10倍梯度稀釋成4個不同的濃度，對每一個濃度的樣本作3個重復纟全測，結果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差在0.05~0.29之間，具有較好的重復性(表1)。表1熒光RT-PCR法檢測腸道病毒EV71的重復性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.5臨床樣本的檢測從近期浙江省各地報告的手足口爆發疫情疑似患者的腦脊液、糞便和皰滲液共120份臨床樣本中直接提取病毒RNA，用腸道病毒通用熒光RT-PCR方法(采用TAKARA/^司的一步法熒光RT-PCR試劑盒，總反應體系為25pl。矩陣法優選后引物最佳濃度均為0.60(amol/L,探針最佳濃度為O.30|imol/L，模板RNA10|^1，最后用DEPC水補至25|iil。用MJResearchOption2熒光檢測系統或RocheLightcycle焚光^r測系統進行4企測，反應參數為45°C30min逆轉錄，94。C變性2min，以93°C15s,60。Clmin擴增40個循環，在60。C進行單點熒光檢測，可獲得最低Ct值和最高熒光強度)(嚴菊英，盧亦愚，徐昌平，等。腸道病毒TaqMan熒光定量RT-PCR法快速沖企測，中國公共衛生，2007，(7))、本發明腸道病毒EV71熒光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法(見操作1.5)同時檢測腸道病毒和腸道EV71病毒核酸，結果腸道病毒通用焚光RT-PCR方法檢測出腸道病毒核酸陽性84份，本發明腸道病毒EV71熒光RT-PCR方法4企測出腸道EV71核酸陽性49份，普通RT-PCR法檢測出EV71核酸陽性41份，本發明腸道病毒EV71熒光RT-PCR方法比普通RT-PCR法檢測EV71的陽性率高。所有腸道EV71核酸陽性的樣品腸道病毒核酸均陽性。本發明腸道病毒EV71熒光RT-PCR方法用于臨床樣本檢測的驗證在4個平行實驗室進行，均獲得了滿意的結果，圖3顯示的是部分臨床樣本的檢測圖譜。序列表—ST25SEQUENCELISTING<110>浙江省疾病預防控制中心<120>腸道病毒EV71核酸熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法<130〉<160>3<170>Patentlnversion3.4<210>1〈211〉26〈212>DNA<213〉Unknown〈220〉<223〉人工序列<400〉1tgattgagacacgcgtgtgttcctta26<210〉2<211>20<212>DNA<213>Unknown<220〉<223>人工序列〈400〉2cccgctctgctgaagaaact20<210〉3〈211>25<212>腿<213>IInk腳n<220〉〈223〉人工序列<400>3tcgcacagcacagctgagaccactc2權利要求1.腸道病毒EV71核酸熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的引物和探針序列如下EV71YGF15’-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3’；EV71YGR15’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’；EV71YGpb15’-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3’。2.腸道病毒EV71核酸的熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于所述方法包括(1)根據腸道病毒EV71基因序列，設計引物和探針序列如下EV71YGF1:5，-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA隱3';EV71YGRl:5，-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3';EV71YGpbl:5'畫TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3，；(2)纟是取待測樣品RNA,以待測樣品RNA為模板、在包括步驟(1)所述引物和探針序列的RT-PCR反應體系中進行RT-PCR反應；(3)對RT-PCR反應產物進行熒光檢測，根據熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度判斷結果，熒光RT-PCR反應呈陽性，則待測樣品含有腸道病毒EV71核酸。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述RT-PCR反應體系每25HL組成如下RT-PCR緩沖液終濃度為lxExTaqHS0.1U/|liLRTEnzymeMixII0.1U/pL上游與下游引物各0.40pM探針0.20)iM模板RNA8|liLDEPC水補足至25|uL。4.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述熒光定量RT-PCR反應條件為42°C30min，95°C2min進行逆轉錄，然后95°C5s,55°C35s,在55"C進行單點熒光檢測，共進行40個循環。全文摘要本發明提供了一種應用于手足口病感染實驗室應急檢測的腸道病毒EV71熒光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法。所述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的引物和探針序列如下EV71YGF15’-TGATTGAGACACGC/GTGTGTT/CCTTA-3’；EV71YGR15’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’；EV71YGpb15’-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3’。本發明方法對腸道病毒EV71的檢測有高度的特異性，與其他腸道病毒CA16、CA4、CA21、E6、E30、CoxB5、POLIO等病毒無交叉反應；本發明方法檢測的靈敏度達0.1TCID<sub>50</sub>，可直接從疑似手足口病患者的腦脊液、皰疹液和糞便等標本中檢測腸道病毒EV71核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右。文檔編號C12Q1/68GK101328507SQ20081006309公開日2008年12月24日申請日期2008年7月10日優先權日2008年7月10日發明者嚴菊英,燕馮,盧亦愚,徐昌平,寅陳申請人:浙江省疾病預防控制中心