專利名稱：：在轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法
技術領域：
：本發明涉及植物基因工程領域中利用轉基因植物生產酶制劑的方法，尤其是涉及利用轉基因水稻生產木聚糖酶的方法。
背景技術：
：我國是世界上飼料原料需求大國，隨著詞料糧總需求量不斷增加，其缺口也逐年增大。我國養殖業的能量詞料資源十分短缺，而作為我國大宗糧食作物一水稻的秸稈和谷粒由于富含木聚糖等抗營養因子詞用效率低下。谷物飼料中的木聚糖是一種不能被單胃動物消化吸收的抗營養因子(Bedford,1995;Choct等，1990)，在動物胃腸道的消化吸收過程中與金屬離子、蛋白質和一些營養物質結合成不易被吸收利用的物質，不僅增加飼料成本還降低了動物的生產性能。我國是世界上最大的養殖國之一，動物在將詞料營養轉化為畜產品的過程中，有很多食入養分未吸收而被排入到環境中去，對土壤和水源造成巨大污染(N、P的污然最為嚴重)。我國每年產生禽畜糞便10多億噸，養殖業對生態環境造成了很大威脅。如何通過飼料改良減輕動物糞便造成的污染問題，是農業和畜牧業可持續發展需要解決的迫切問題。木聚糖酶(EC3.2丄8)能水解谷物和秸稈中的木聚糖，在半纖維素降解中起著關鍵作用，可大幅度提高纖維素類物質的利用效率，具有廣泛應用前景(Biely，1985;孫建義，1998)。研究表明，在肉雞飼料中添加含木聚糖酶的酶制劑能提高飼料轉化效率和生長速率10%以上，木聚糖酶能提高稻谷不同養分消化率7.16%-96.46%;肉雞生長速度和詞料轉化效率分別提高了17.1-20.0%和15.2-15.9%，并接近玉米飼料水平(李衛芬等，1999;2004;王敏奇等，2003)。木聚糖酶主要作用機理通過有效降解谷物飼料細胞壁中的木聚糖，使胞內營養物質釋放出來，有利于動物消化酶分解；并通過消化酶活性的提高和消化道內容物粘度的降低，維持消化道正常形態結構，提高飼料養分的消化吸收率，減少大腸桿菌數量使畜禽的腹瀉率大幅度降低，促進動物健康生長；從而提高谷物飼料轉化效率，接近玉米相同的飼養效果，并大幅度降低飼料成本，提高養殖業的飼料報酬。此外，還具有減少畜禽排泄物中有害物質(氮和磷)排放量和代替抗生素的功效，經濟效益十分顯著(Bedford,1995;Choct等，1995)。因此世界各國尤其發達國家均普遍使用微生物酶制劑來提高養殖業的經濟效益(Cassen,1996;居乃琥，2000)。目前用于提高飼料利用率的木聚糖酶均來自微生物(Wong等，1988;劉明啟等，2004)，一般采用微生物發酵系統生產木聚糖酶，但其使用成本仍然較高，從而制約了木聚糖酶的廣泛應用(Kimura等，2003)。利用植物表達系統生產酶制劑是近年發展起來的生物新技術，主要是釆用特異啟動子誘導外源重組酶基因在農作物中高效表達，使農作物的莖、葉或種子等組織富含重組酶。利用該技術獲得的農作物新品種不僅可大規模生產酶制劑，而且其秸稈和/或種子可加工優質飼料，從而降低養殖業生產成本，大幅度提高生產效率(Goddijinetal.，1995,Hellwigetal.，2004;Whitelam，1995)。已有的研究表明，利用轉基因模式植物一煙草作為生物反應器開展的微生物木聚糖酶基因轉導及表達研究己經獲得成功(Sun等，1997;Herbers等，1995;1996)。Herbers等人(1995，1996)將熱纖梭菌木聚糖酶XynZ和瘤胃微生物木聚糖酶D導入煙草表達，且沒有危害煙草的生長。微生物木聚糖酶也在油菜籽中獲得了表達，它定位于油菜種子中的油質體膜上，實現了外源基因與植物油體特異調控基因的融合表達(Liu等，1997)。2000年澳大利亞的Patel等人將瘤胃真菌木聚糖酶基因(xynA)導入大麥胚乳中表達，這些研究表明利用微生物木聚糖酶基因在植物中的高效表達來生產木聚糖酶是一條可行的技術途徑。但是有關微生物木聚糖酶在其它農作物中表達的研究很少。鑒于水稻是我國重要的農作物，將來源于微生物并經過人工修飾能耐受飼料制粒等高溫加工的木聚糖酶重組基因轉移到水稻中表達，利用農作物如水稻的稻葉和秸稈來生產飼用酶有廣泛的應用前景，迄今為止，在國內外尚未見相關報道。
發明內容本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種在轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法。為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案一種轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法，該方法包括以下步驟(1)構建含有木聚糖酶基因的植物表達載體。(2)用農桿菌介導得到轉基因植株，使木聚糖酶基因在轉基因植株的種子、莖葉中表達。進一步地，所述步驟(1)具體為將木聚糖酶重組基因atx添加Ru3印片段后，插入到植物表達載體pXYL06上，獲得Atx-Ru3印-pXYL06載體，將載體導入根癌農桿菌EHA105,獲得工程菌Atx-EHA105，利用農桿菌介導的遺傳轉化系統將木聚糖酶基因導入水稻基因組中。所述步驟(2)具體為利用農桿菌介導的遺傳轉化系統，將木聚糖酶重組基因導入水稻基因組中，經過抗性篩選、分化和生根培養獲得了轉基因水稻植株。本發明的有益效果是，本發明方法將來源于微生物并經過人工修飾能耐受飼料制粒等高溫加工的木聚糖酶基因轉移到水稻中，并在水稻葉片、莖桿和種子中高效表達，培育富含木聚糖酶的詞料稻品種，可以大量、廉價生產木聚糖酶。而且轉木聚糖酶基因水稻的谷粒可用于單胃動物詞料，稻葉和秸稈可以作為反芻動物飼料，而無需在詞料中添加通過發酵技術生產的木聚糖酶添加劑，對于稻谷及其秸稈的開發利用具有重要意義，不僅提高農作物價值，而且可減少作為"膠囊化木聚糖酶"飼料的轉基因作物在單位飼料中的使用量，降低飼料成本。無論從經濟角度還是使用方便的角度來說，都更具優勢。優勢如下1、原材料通過農業方式獲得，生產成本低廉，水稻的谷粒和秸稈均可以直接飼喂動物或加工飼料；2、相對于發酵的方法，使用植物生物反應器，無需發酵工藝設備，大大降低資本投資；3、水稻是我國重要的農作物，生產規模可以迅速擴大。圖1是表達載體pXYL06的物理圖譜；圖2是PCR擴增得到的木聚糖酶基因電泳圖譜，圖中，l為標準分子量，2為木聚糖酶基因(640bp);圖3是表達載體的酶切電泳圖，圖中，l為標準分子量，2為pXYL06質粒，3為pXYL06質粒，4為木聚糖酶基因(640bp)atx-Ru3ep-pXYL06載體BamHl/Pstl雙酶切；圖4是用于轉化的目的基因電泳圖譜，圖中，1為marker(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp、3000bp)，2為atx-Ru3ep-pXYL06質粒(轉化后的EHA105中抽提)，3為atx-Ru3ep-1301EHA105菌液，4為陽性對照atx-Ru3ep-pXYL06質粒，5為陰性對照pXYL06質粒，6為陰性對照EHA105菌液；圖5是再生植株PCR檢測木聚糖酶基因的電泳圖，圖中，1為marker,2為陽性質粒，3為野生水稻，4-8為轉基因水稻；圖6是再生植株RT-PCR檢測木聚糖酶基因的電泳圖，圖中，l為marker,2-3、5-6為轉基因水稻，4為野生水稻；圖7是轉基因水稻潮霉素快速檢測圖，圖中1為野生水稻，2和4為未轉化水稻，3和5-8為轉基因水稻；圖8是轉基因水稻的形態及木聚糖酶活性圖，圖中，1-3為轉基因水稻，4為野生水稻。具體實施方式用植物作為反應器來生產重要的、有經濟價值的蛋白質是"分子農業"發展的新趨勢。水稻是我國重要的農作物，在已成功構建能編碼優良性能木聚糖酶的重組基因基礎上(GenBankAccessionNo.AY858101)，根據植物基因表達特點，構建適合單子葉植物轉化的木聚糖酶基因表達載體，以水稻為轉基因材料，通過農桿菌介導將已構建的表達載體導入水稻愈傷組織中；經HYG抗性來選擇轉基因水稻，并采用分子鑒定等技術進行檢測，同時分析木聚糖酶的表達水平，獲得利用轉基因水稻生產木聚糖酶的方法。本發明在轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法，包括以下步驟(1)構建含有木聚糖酶基因的植物表達載體；本發明的木聚糖酶基因是來源于褐色單孢菌和枯草芽孢桿菌的重組基因，重組基因能較好耐受飼料制粒等的高溫，重組基因GenBank登錄號為AY858101。首先構建用于單子葉植物轉化的木聚糖酶基因表達載體以經修飾的重組基因置于組成型啟動子(CaMV35S)驅動之下，表達載體中有報告基因gus和篩選標記基因hyg(潮霉素抗性基因)，攜帶目的基因的雙元表達載體的酶基因末端插入6個his序列，便于木聚糖酶表達產物的純化。上述表達載體的構建是通過如下方法完成木聚糖酶重組基因atx添加Ru3ep片段后(編碼基因序列Nol，Ru3ep片段序列No2)，插入到植物表達載體pXYL06上，獲得Atx-Ru3ep-pXYL06載體，將載體導入根癌農桿菌EHA105,獲得工程菌Atx-EHA105，利用農桿菌介導的遺傳轉化系統將木聚糖酶基因導入水稻基因組中，所選外植體為水稻幼胚或成熟胚誘導形成的愈傷組織。(2)用農桿菌介導得到轉基因植株，使木聚糖酶基因在轉基因植株的種子、莖葉中表達。利用農桿菌介導的遺傳轉化系統，將木聚糖酶重組基因導入水稻基因組中，經過抗性篩選、分化和生根培養獲得了轉基因水稻植株。通過PCR、Northern雜交對轉化水稻植株進行分子鑒定，驗證外源基因已經整合到水稻基因組中。最后對轉基因植株進行木聚糖酶的活性分析。以下五個實施例詳細闡明了本發明的具體實施方式。實施例l:木聚糖酶表達載體的構建1、材料的準備木聚糖酶基因使用GenBank登錄號為AY858101的木聚糖酶基因。菌種大腸桿菌Eco//DH5a、根癌農桿菌EHA105。各種限制性內切酶、pGEM^質粒和T-載體購自Promega公司。化學試劑酵母浸膏和胰蛋白胨購自OXOID公司，組織培養用試劑購自Sigma公司。其他化學試劑均為國產分析純。引物合成上海博亞生物技術有限公司，測序由上海博亞生物技術有限公司完成。2、木聚糖酶基因表達載體構建Ru3ep克隆導入到pGElvfT-載體上，連接產物轉化E.coli感受態細胞，提取質粒，酶切鑒定測序后得到pGEME/H，Xba/和Pst/酶切pGEMRu3印，Bami//和XbaI酶切pGEMAtx，分別回收目的片段，將兩片段加T4DNA連接酶連接，連接產物轉化E.coli感受態細胞，提取質粒，酶切鑒定測序后得到pGEMAtxE/H。Bamif/和Pst/酶切pGEMAtxE/H，Bami//和Pst/酶切pXYL06質粒，瓊脂糖電泳回收目的片段，兩片段加T4DNA連接酶連接，連接產物轉化E.coli感受態細胞，提取質粒，酶切鑒定測序后得到Atx-E/H-pXYL06載體。實施例2:遺傳轉化的前期準備1.水稻轉化起始材料的獲得以水稻幼胚誘導愈傷組織取水稻未成熟種子(灌漿期)消毒，用鑷子夾住種子擠出幼胚，置入N6培養基中，25-28'C暗處培養5天；繼代培養時，用鑷子剝胚性愈傷組織(去掉芽及膜狀物)，置入繼代培養基中(突起面向上)，25—28"C暗處培養3天。以水稻成熟胚誘導愈傷組織取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子消毒，置入N6培養基中，28'C光照培養3周；繼代培養時，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色，致密呈球狀)，置入繼代培養基中，在28'C光照培養1周。上述水稻幼胚和成熟胚的胚性愈傷均可作為轉化起始材料，培養基的配置參照"PlantCell,TissueandOrganCulture:fimdamentalmethods，，(O丄.Gamborg，G.C.Phillipseds"Springer)。2.農桿菌EHA105感受態制備1)菌單菌落，接種于5mlLB/YEP液體培養基(rif50mg/L)，28°C，200rpm，培養16—24h;2)取2ml培養物于50ml新的培養基種繼續培養到OD800=0.5左右；3)5000卬m4t;離心5min棄上清，回收菌體；4)10ml預冷的O.lMNaCl懸浮，5000rpm4。C離心5min，棄上清，回收菌體；5)2ml預冷的0.05MCaC12(含甘油0.5ml)懸浮；6)200ul每管分裝，液氮速凍，-S(TC保存。實施例3:農桿菌介導的遺傳轉化1、Atx-E/H-1301載體導入農桿菌EHA1051)從-80'C冰箱中取出200ul感受態細胞農桿菌EHA105，冰浴化開；2)往200ul感受態細菌中加入3-5ulAtx-Ru3ep-pXYL06Vector質粒，快速輕輕混勻，冰浴靜置30min;3)快速浸入液氮，維持5min，再37'C冰浴5min;4)加入4倍無抗生素的液體培養基，混勻，28。C搖2—4h;5)涂布前一般將菌液濃縮為原感受態細胞體積，即4000—5000rpm離心5min，取部分上清，再用槍頭吹吸均勻，最后涂布至培養基(rif+，50ug/mhKm+，50ug/ml)表面。培養前，需28。C正放lh至菌液完全吸收，再倒放48h以上；6)挑斑搖菌(rif+，50ug/ml;Km+，50ug/ml),抽質粒做PCR驗證。2、農桿菌培養挑取農桿菌單克隆或吸取所保存的農桿菌菌液100ul于5mlYEP(含50mg/lKm和50mg/lRif)培養液中，28°C，220rpm振蕩培養20-24h至菌液OD600的終濃度為0.1—0.8;3、轉化將搖好的適量農桿菌菌液置于離心管中，4°C，4000rpm，離心2min，去上清。用含乙酰丁香酮200umol/l的AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD600的終濃度為0.01;將長到一定大小的水稻胚性愈傷組織挑出，放入農桿菌懸浮液侵染約20min;將愈傷組織置于共培養基上(在培養基上鋪一層無菌濾紙)，25-C暗培養2—3天。4、選擇培養將愈傷組織用無菌水清洗5-6次，轉入含500mg/l頭孢拉定(或頭孢噻肟鈉)和50mg/l潮霉素的選擇培養基上，28'C光照培養2周；將存活的抗性愈傷轉到含500mg/l頭孢拉定(或頭孢噻肟鈉)和50mg/l潮霉素的選擇培養基上進行第二輪選擇，28。C光照培養2周，長出顆粒性的抗性愈傷組織。5、再生挑取顏色鮮黃的抗性愈傷，移入裝有分化培養基，生長迅速，3-4周后分化成苗。待苗長至lcm左右，放入生根培養基中生根壯苗，即得到再生水稻苗。實施例4再生植株的檢測1、轉基因植株的基因組DNA提取參照《植物基因工程》中CTAB法提取(王關林、方宏筠主編，2002)1)取0.2-0.5g新鮮葉片，于含有液氮的研缽內輕輕碾碎冷凍的葉片樣品。一旦組織開始融化，加入700plCTAB提取緩沖液；2)樣品于65。C溫育30-60min;然后加入等體積氯仿異戊醇乙醇混合液混勻的于室溫放置15min;12000r/min離心10min;3)用除去尖端的移液尖頭小心地將上層水相移至另一離心管內，務必避免界面蛋白質和底部有機相葉綠素的污染；4)加入約2/3體積的預冷的異丙醇(-20°C)，小心混勻，放置5min;5)12000r/min，離心10min，傾去上清，得DNA沉淀；6)沉淀用70%酒精洗滌兩次，離心棄上清；風干后溶于500^1含200嗎/LRNase的ddH20中。加入等體積氯仿異戊醇乙醇混合液，混勻，12000r/min，離心10min;7)小心取出上清加入1/10體積的NaAc(pH5.2)和兩倍體積的無水乙醇，混勻。-20。C放置30min;12000r/min，離心5min。去上清；8)沉淀用70%酒精洗滌，室溫干燥后溶于50pl無菌水中，用于PCR檢測。2.再生植株的PCR檢測木聚糖酶基因檢測引物5RX01:5垂AGGATCCAACCATGGCTGTTACATCCAACGAGAC-33RX02(30bp):5畫CCTGCAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAC-3反應體系(50W):再生植株DNAl,Ojxl;10xPCRbuffer5.0jnl;MgC12;3.(Vl;dNTP1.0pl;5RX011.0ul;3RX011.0^1;Taq酶0.5^1;加水至50fil。反應條件94°C，2min;94。C，50s;62。C，50s;(-0.2。Cpercycle)72。Clmin;35個循環；72'C延伸10min。篩選出的陽性植株(如圖5所示)。3、轉基因水稻植株總RNA的RT-PCR分析1)水稻總RNA的提取取基因組DNA的PCR驗證為陽性的轉基因水稻的葉片50-100mg于研缽中，用液氮浸泡并磨成粉末，轉入1.5mleppendorf管中，加入lmlTrizol試劑，劇烈振蕩，放置5min;加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，12000r/min離心30s;取上層水相于一新1.5mleppendorf中，力Q0.5ml異丙醇，于-20。C下放置30min，12000r/min離心10min;棄上清液，力nlml75%乙醇，混合，12000r/min離心2min;棄上清液，室溫或真空干燥沉淀，加20-100lil水，于-2(TC下貯存。2)第一鏈cDNA的合成采用上海生工生物工程有限公司的MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒，在冰浴的試管中加入如下反應混合物總RNA1-5|xl01igo(dT)18(0.5嗎1|ilRnase-freeddH206國llj^1Total12(il輕輕混勻后離心3-5s;反應混合物在7(TC下水浴5min后，冰浴30s，然后離心3-5s;將試管冰浴，再加入如下組分5xReactionbuffer4jxlRNaseInhibitor(20U/|il)1|ildNTPMix(lOmmol/L)__輕輕混勻后離心3-5s;37。C水浴5min，加入l^ilM-MuLVRT(200U/pl)終體積為200^1;反應混合物37'C水浴60min;在70'C加熱lOmin結束反應，置冰上進行后續實驗或冷凍保存。3)cDNA的PCR分析利用木聚糖酶基因的特異性引物5RX01和3RX02對cDNA進行PCR分析，PCR的反應體系和反應條件同上，僅是反應的模板換成cDNA。RT-PCR分析檢測結果見圖6。結果表明木聚糖酶基因已經整合到水稻基因組中。實施例5轉基因水稻后代中木聚糖酶活性的檢測轉基因水稻TO代植株經過分子檢測，木聚糖酶基因為陽性的植株自交授粉結實后，所的種子為T1種子。Tl種子播種后可以正常萌發、發育成T1植株。對T1植株進行PCR檢測，自交授粉，得到T2種子。選擇PCR檢測木聚糖酶基因為陽性的T1植株用來進行植酸酶活性分析。1)木聚糖酶活力單位定義每分鐘產生相當于lpmol還原糖(以木糖計)的酶量為1個酶活力單位(U)。2)試劑木聚糖和活性亮藍木聚糖(RemanzolbrilliantblueRXylan,RBB-Xylan)購自美國Sigma公司。pH3-7為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，100ml緩沖液按以下比例混勻。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>提取緩沖液(50mM檸檬酸鈉pH6，含10mMEDTA，lmMDTT，0.1%Triton)1%木聚糖，DNS試劑取50.0(^3，5-二硝基水楊酸溶于400ml水中，邊攪拌邊加入80.0gNaOH讓其溶解，然后漸漸加入150g酒石酸鉀鈉，加熱至45'C,冷卻定容至5000ml,放于棕色瓶中，室溫保存。3)P-l，4-內切木聚糖酶活性測定參見文獻Baileyetal.(1989)。用樺木木聚糖為底物，用DNS法測定P-l，4-內切木聚糖酶活性。(3-l,4-內切木聚糖酶活性測定在試驗管和空白管中各加入1.8ml木聚糖底物，在一定溫度下水浴中預熱5min;在試驗管中加20(Hd樣品搖勻；精確反應10min后，兩個管中都加入3.OmlDNS試劑。在空白管中再加入200|nl樣品。將兩個試管同時沸水浴5min，取出試管，冷卻至室溫；然后以空白為對照在540nm處測定樣品的吸光值。根據標準曲線上計算酶活。4)準曲線制作配制好10|amol/ml木糖母液(150mg木糖溶解于合適緩沖液中，定容至100ml)。用相應緩沖液稀釋母液，使之成為0l(^mol/ml木糖濃度的標準液，每個標準液做三個重復，各試管中加入1.8ml底物，再加200pl標準稀釋液，后面操作步驟和樣品測定相同。空白為加入200nl相應緩沖液而代替加入200nl標準液。5)轉基因水稻葉片木聚糖酶活性的測定，取0.2g葉片加液氮研磨，加入lml提取緩沖液，15，000g離心l.O分鐘，上清也既為酶的粗提液。6)木聚糖酶活性測定結果顯示轉基因水稻中木聚糖酶活性比未轉基因對照高出10倍，表明木聚糖酶基因在水稻葉片中表達。進一步選育穩定遺傳的、高表達木聚糖酶活性的水稻新種質材料，供水稻育種和生產使用。權利要求1、一種在轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)構建含有木聚糖酶基因的植物表達載體。(2)用農桿菌介導得到轉基因植株，使木聚糖酶基因在轉基因植株的種子、莖葉中表達。2.根據權利要求1所述的在轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體為將木聚糖酶重組基因atx添加Ru3印片段后，插入到植物表達載體pXYL06上，獲得Atx-Ru3印-pXYL06載體，將載體導入根癌農桿菌EHA105，獲得工程菌Atx-EHA105,利用農桿菌介導的遺傳轉化系統將木聚糖酶基因導入水稻基因組中。3.根據權利要求l所述的在轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為利用農桿菌介導的遺傳轉化系統，將木聚糖酶重組基因導入水稻基因組中，經過抗性篩選、分化和生根培養獲得了轉基因水稻植株。全文摘要本發明公開了一種在轉基因水稻中高效生產木聚糖酶的方法，本發明的技術方案是構建含有木聚糖酶重組基因的、能在植物中高效表達的載體，利用農桿菌介導轉化水稻幼胚或成熟胚誘導形成的愈傷組織，得到轉基因植株，使木聚糖酶在轉基因植株的莖、葉和種子中表達。采用本發明方法獲得的轉基因水稻是富含木聚糖酶的飼料稻品種，轉木聚糖酶基因水稻的谷粒可用于單胃動物飼料，稻葉和秸稈可以作為反芻動物飼料，可方便直接地用于飼料中而無需在飼料中添加通過發酵技術生產的木聚糖酶添加劑，提高谷物飼料轉化效率，大幅度降低飼料成本，經濟效益十分顯著。文檔編號C12N15/56GK101319206SQ20081006305公開日2008年12月10日申請日期2008年7月8日優先權日2008年7月8日發明者孫建義,翁曉燕申請人:浙江大學