一種分離單個核細胞的方法和裝置的制作方法

專利名稱：：一種分離單個核細胞的方法和裝置的制作方法
技術領域：
：本發明提供了一種分離單個核細胞的方法和裝置，特別是一種分離臍帶血、骨髓、外周血單個核細胞的裝置
背景技術：
：臍帶血、骨髓、外周血是造血干細胞的三大來源，造血干細胞移植已成為治療多種血液病、某些惡性實體腫瘤、部分遺傳性疾病、重癥免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。臨床應用已證明造血干細胞移植對于重建或改善骨髓造血功能有良好療效。單個核細胞(腦c)(包括單核細胞、淋巴細胞、干細胞等)是造血干細胞移植的有效成分，MNC的分離是干細胞移植和進一步研究的關鍵環節，它直接關系到分離后樣本體積、造血干/祖細胞或間質干細胞分離率、細胞活性維持及移植的成敗。目前分離單個核細胞主要有以下幾種方法(1)Ficoll_Hypaque(d=1.077，商品名Ficoll液)分層法；即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分層法；(2)3%明膠自然沉降法(3)6y。羥乙基淀粉(HES)自然沉降法其中以Ficoll—Hypaque(d=1.077)分層法最為經典和常用，其原理是常用來分層液比重是1.077士0.001g/mL的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分層液，Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400，000,當密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。由于MNC與血液中的其它成分存在著密度差異，在作密度梯度離心時，各種血液成分將按照密度梯度重新分布聚集，血漿和血小板由于密度較低，懸浮于分離液層面的上方，紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；單個核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可分離到單個核細胞。但是目前國內外分離單個核細胞一般為試管法，試管法單次分離臍帶血量小(最大量25ml),分離臍帶血量多的樣本時，使用的離心管數量多，成本高，工作量大，效率低，重復的開放操作很容易造成微生物污染，不適宜大批量臍血的分離，多用于實驗研究。分離外周血等其它樣本時也存在類似問題。目前己有研究者注意這個問題，并展開了一些研究。如申請號為CN200610114475.9的中國專利，提供了一種用于分離骨髓單個核細胞的試劑盒，包括稀釋液、洗滌液，由分離液A和B組成的分離液，所述的稀釋液為生理鹽水、PBS或Hank's液，洗滌液為生理鹽水、PBS或Hank's液，分離液A為質量/體積百分比濃度為5.5-6.5%的羥乙基淀粉或0.45—0.55%甲基纖維素溶液；分離液B為密度為1.077g/ml的Ficoll—Hypaque溶液或密度1.073g/ml的Percoll液。該試劑盒具有使用方便、成本低廉、分離效果好的有點。但上述發明仍然未解決試管法單次分離量小以及多次重復操作帶來的污染等問題，因此又有研究者提出用多聯袋離心分離單個核細胞。如《三聯袋兩次離心法分離臍血有核細胞研究》(臨床血液學雜志1999年第1期第12巻)中提到使用三聯袋兩次離心法分離臍血有核細胞，臍血收集在400ml三聯袋(上海血液中心)中，在10。C1800r/min倒置離心15min，棄去下層紅細胞層于一轉移袋中，然后正向離心3000r/min15min，棄去部分血槳于另一轉移袋中，使白細胞層的體積濃縮為40ml左右。《多聯袋無菌制備臍帶血間質干細胞的方法及效果》(中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(24):4781-4784)，使用無菌塑料四聯袋(山東威高集團公司生產l個主袋，2個空袋，l個生理鹽水袋)，先將Fico11-Hypaque混合溶液加入四聯袋的主袋內，利用無菌接口機將盛有Ficoll-Hypaque混合溶液的四聯袋與臍帶血收集袋相連，再將樣本血液沿袋壁緩慢加入四聯袋主袋內液面上，保持血液和淋巴細胞分離液的界面清晰。將四聯袋平衡后置入大型低溫離心機內，1500r/min、22°C離心30min。離心后輕輕取出四聯袋，將主袋放在分漿夾上，此時袋內的液體自上而下分為5層血漿血小板層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層、多核細胞層、紅細胞層。將血漿血小板層的上2/3液體擠壓入四聯袋的一空袋內，將剩余的血漿血小板層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層的上部，擠壓入四聯袋另一空袋內，即為富含單個核細胞的液體。但是該方案仍然存在紅細胞混入量高等問題。有鑒于此，特提出本發明。
發明內容本發明的目的在于提供一種分離單個核細胞的方法。本發明的目的在于提供一種分離單個核細胞的裝置。簡單的說，本發明提供的一種分離單個核細胞的方法，包括(1)、前處理.將臍帶血、骨髓或外周血離心，將上層富血小板血漿層除去，然后加入適量質量百分比濃度為6%的羥乙基淀粉溶液和生理鹽水；使得血液的紅細胞比積為50—65%，其中羥乙基淀粉溶液和生理鹽水的體積比為l:4一1:5;(2)、加液將經過步驟(1)前處理過的臍帶血、骨髓或外周血倒入淋巴細胞分離液中，保持臍帶血、骨髓或外周血和淋巴細胞分離液的界面清晰，前處理過的臍帶血、骨髓或外周血與淋巴細胞分離液的體積比為l:1一2:1;所述淋巴細胞分離液為Ficoll-Hypaque混合溶液；(3)、離心將步驟(2)所得的液體離心；此時液體自上而下分為5層，分別為含有少量血漿血小板的上清層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層、多核細胞層、紅細胞層；(4)、分離將含有少量血漿血小板的上清層層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層的上部取出，即為富含單個核細胞的液體；(5)洗滌在富含單個核細胞的液體中加入生理鹽水，離心，棄去上清液，再加入生理鹽水，同樣的條件下離心，棄去上清液；剩下的部分即為單個核細胞液。其中，步驟(5)最后所得的單個核細胞液中還加入生理鹽水，以調整單個核細胞的最終濃度和體積。所述的步驟(l)中離心條件為2000—2500rpm、22。C下離心5min;步驟(3)中離心條件為1000—1500rpm、22。C下離心30min;步驟(5)中離心條件為2200—2800rpm、22'C下離心7min。所述的所有步驟在密閉系統中進行。本發明還提供了一種分離單個核細胞的裝置，該裝置為由1一4號4個袋組成的四聯袋，其中l號袋為主袋，作用是盛放臍帶血、骨髓或外周血和淋巴細胞分離液的混合液體，2號袋為空袋，用于收集目的細胞層的液體；3、4號袋為生理鹽水袋，已經預充生理鹽水，主要用于無菌洗滌后的目的細胞；4個袋用密閉無菌塑料導管相聯，其中1號袋與2號袋相聯，3、4號袋分別與2號袋相聯。優選的連接方式為所述的塑料導管一端與l號袋相連，從l號袋引出后分流，形成一個三通結構，其中所分流的一路導管與2號袋相連，另一路導管繼續分流，再形成另一個三通結構，所分流的兩路導管分別與3號袋和4號袋相連。在塑料導管與每個袋子相連處均設有止流夾，以防止液體在袋子相互流動，但是當打開止流夾后液體可以根據需要流向所設定的袋子。每個袋子均配有輸液頭，用于加液或輸注；每個袋子還配有與外接袋無菌連接的導管，其作用是可以利用無菌連接技術隨時加入制備過程中所需的液體。優選所述l號袋長18cm，寬9cm，可盛液體200ml左右；所述的2號袋長16cm,寬10cm;所述的3、4號袋長18cm，寬12cm。以下是本發明的詳細描述。《多聯袋無菌制備臍帶血間質干細胞的方法及效果》(中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(24):4781-4784)提供了一種分離臍帶血間質干細胞的方法，本發明實質上是在其基礎上的進一步改進，包括以下步驟(1)、前處理；將臍帶血、骨髓或外周血離心，將上層富血小板血槳層除去，然后加入適量的羥乙基淀粉溶液和生理鹽水；使得血液的紅細胞比積為50—65%;以維持血液的整體密度，使得當血液加入到淋巴細胞分離液時不會下沉，破壞液面；其中，離心條件優選2000—2500rpm、22。C下離心5min;優選的離心轉速為2400rpm;羥乙基淀粉溶液的質量百分比濃度為6%，羥乙基淀粉溶液和生理鹽水的體積比為l:4一1:5;除去的上層富血小板血漿層經進一步處理，使之不含紅細胞后可作為最終懸浮液或其它應用。加入羥乙基淀粉還可以加速紅細胞沉降，以利于單個核細胞浮出。前處理先除去富血小板血槳層、并加入羥乙基淀粉可以提高分離后MNC計數、腦C回收率、CD34+細胞數，降低臺盼蘭拒染率、紅細胞混入量，同時可以使分離出的血漿得到充分利用。如果是自體外周血、骨髓采集分離市留取上清層(血漿)，可用于懸浮分離后的千細胞；如果是臍帶血的上清層，不僅可以用于懸浮分離后的干細胞，而且由于其中含有比成人高的多的細胞因子，也可用于細胞培養及誘導分化。(2)、加液將前處理過的臍帶血、骨髓或外周血倒入淋巴細胞分離液中，保持臍帶血、骨髓或外周血和淋巴細胞分離液的界面清晰，前處理過的臍帶血、骨髓或外周血與淋巴細胞分離液的體積比為l:1一2:1，優選2:1;淋巴細胞分離液為Fico11-Hypaque混合溶液，實質上為比重l.077±0.001g/ml的聚蔗糖-泛影葡胺；其作用是作為密度梯度離心的梯度液。(3)、離心將步驟(2)所得的液體離心；此時液體自上而下分為5層，分別為含有少量血漿血小板的上清層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層、多核細胞層、紅細胞層；這是由于人血液中各種細胞比重不同。紅細胞(RBC)的相對密度約為l.092g/ml左右，多核細胞的相對密度約為l.090g/ml左右，單個核細胞的相對密度為l.070g/ml左右，因此經一定速度離心沉淀，即可按其相應密度梯度分布，將各種血細胞分層。本步驟離心的條件優選為1000—1500rpm、22。C下離心30min;優選離心轉速為1200rpm;(4)、分離將含有少量血漿血小板的上清層層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層的上部取出，即為富含單個核細胞的液體；(5)洗滌在富含單個核細胞的液體中加入生理鹽水，離心，離心條件為2200—2800rpm、22。C下離心7min;優選離心轉速為2500rpm;棄去上清液，再加入生理鹽水，同樣的條件下離心，棄去上清液；剩下的部分即為單個核細胞液。兩次生理鹽水洗滌可以顯著降低紅細胞混入量。此外，還可以在步驟(5)最后所得的單個核細胞液中加入生理鹽水，使MNC懸浮，以調整顧C的最終濃度和體積。另外，本發明還提供了一種根據上述方法分離單個核細胞的裝置，該裝置由l一4號4個四聯袋構成，如附l所示。其中l號袋為主袋，作用是盛放臍帶血、骨髓或外周血和淋巴細胞分離液的混合液體，并作為離心容器，其中，臍帶血、骨髓或外周血事先需要經過離心處理，以除去上層富血小板血槳層，降低臺盼蘭拒染率、紅細胞混入量；2號袋為空袋，用于收集目的細胞層的液體；3、4號袋為生理鹽水袋，預充生理鹽水，主要用于無菌洗滌后的目的細胞。l一4號4個袋的容量可根據樣本體積的大小選擇相應的無菌塑料袋，可以從30m廣500ml不等。優選其中l號袋長18cm，寬9cm，可盛液體200ml左右。2號袋為長16cm，寬10cm;3、4號袋為生理鹽水袋，長18cm，寬12cm。4個袋用密閉無菌塑料導管相聯，其中1號袋與2號袋相聯，3、4號袋分別與2號袋相聯，優選的連接方式為塑料導管一端與l號袋相連，從l號袋引出后分流，形成一個三通結構，其中所分流的一路導管與2號袋相連，另一路導管繼續分流，再形成另一個三通結構，所分流的兩路導管分別與3號袋和4號袋相連，這樣可使連接關系最簡單，可有效簡化成本。在塑料導管與每個袋子相連處均設有止流夾，以防止液體在袋子相互流動，但是當打開止流夾后液體可以根據需要流向所設定的袋子。同時每個袋子均配有輸液頭，用于加液或輸注。此外，每個袋子還配有與外接袋無菌連接的導管，其作用是可以利用無菌連接技術隨時加入制備過程中所需的液體。本發明四聯袋的具體操作步驟可參見實施例。本發明方法和所用四聯袋分離單個核細胞在密閉系統中完成，解決了微生物污染問題，而且不受分離樣本體積限制，分離成本低，效率高，單份臍血僅需一套聯袋，特別是同時分離多份樣本時，效率可以幾倍于試管法。分離后MNC計數、MNC回收率、CD34+細胞數均高于試管法(P〈0.05),臺盼蘭拒染率、紅細胞混入量二者比較差異無統計學意義(P〉0.05)。同時，本發明相對于《多聯袋無菌制備臍帶血間質干細胞的方法及效果》一文中采用的方法和四聯袋，由于采用先將臍帶血、骨髓或外周血離心除去大部分的富血小板血漿層，然后再與淋巴分離液混合離心分層，而且用生理鹽水洗滌2次，因此分離后的顧C計數、腦C回收率、CD34+細胞數均比該文方法高，臺盼蘭拒染率、紅細胞混入量比其低，效果顯著。在此基礎上，對分離的單個核細胞進行培養同時加入促誘導分化的細胞因子，分析了影響增值、分化的幾種影響因素，而一般的方法由于非目的細胞含量高，必須有或無血清培養基先進行培養、傳代，以進一步純化目的細胞，然后進行誘導，整個過程甚至需要幾個月時間。目前人們利用間充質干細胞移植治療腦缺血、心肌梗塞、帕金森病等的動物疾病方面己經取得了良好效果，也有學者采用培養擴增后的人間充質干細胞作為移植物進行骨再生研究，但多限于動物實驗，很少直接用于人體，主要是臨床應用安全性。本發明方法利用四聯袋無菌連接技術制備單個核細胞靜脈輸注治療酒精性股骨頭缺血性壞死和腦梗塞后遺癥，在發出細胞前24h進行細胞培養，均未發現細菌生長，避免了細菌污染，所分離的單個核細胞是一種原始的免疫缺陷細胞，具有良好的免疫耐受性，同時又因分離過程紅細胞混入量很低，不需ABO及HLA配型亦可使用，沒有出現發熱、感染及過敏等不良反應，從而保證了臨床的安全，療程短且療效明顯，提高了患者的生活質量。本發明無須在百級凈化環境下即可分離單個核細胞，不受樣本數量、體積限制，效率高，無污染，不僅可以用于實驗室研究，也可以直接用于人體治療，且結構簡單，便于成批生產。圖l本發明四聯袋結構示意圖1:主袋2:空袋3、4:生理鹽水袋5、導管6:聯接導管的三通7:輸液頭8:與外接袋無菌連接的導管9:止流夾具體實施例方式本發明實施方式所用試劑和儀器如下四聯袋(一個主袋，一個空袋，兩個0.9%氯化鈉液袋，山東威高集團公司)，大容量低溫離心機(德國Heraeus公司)，50ml試管(美國BD公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，生物顯微鏡(重慶奧特光學儀器公司)，人淋巴細胞分離液(密度1.077/cm3，天津灝洋公司)，6%HES(山東華魯制藥公司)，0.5%臺盼藍染液(0.5g的臺盼藍，IO(MO.9%氯化鈉液)，KX-21型血細胞計數儀(日本東亞公司)，無菌接口機(日本泰爾茂公司)。DMEM/F12(Gibco)，B27(Gibco)，重組人EGF(Sigraa)，bFGF(Sigma)，鼠抗人Nestin(Sigma)實施例l四聯袋如圖l所示，由1一4號4個四聯袋構成，如附l所示。其中l號袋為主袋，作用是盛放臍帶血、骨髓或外周血和淋巴細胞分離液的混合液體，并作為離心容器，其中，臍帶血、骨髓或外周血事先需要經過離心處理，以除去上層富血小板血漿層，降低臺盼蘭拒染率、紅細胞混入量；2號袋為空袋，用于收集目的細胞層的液體；3、4號袋為生理鹽水袋，預充生理鹽水，主要用于無菌洗滌后的目的細胞。1—4號4個袋的容量可根據樣本體積的大小選擇相應的無菌塑料袋，可以從30m廣500ml不等。優選其中l號袋長18cm，寬9cm，可盛液體200ml左右。2號袋為長16cm，寬10cm;3、4號袋為生理鹽水袋，長18cm，寬12cm。4個袋用密閉無菌塑料導管5相聯，塑料導管5—端與1號袋主袋1相連，從l號袋引出后分流，形成一個三通結構6，其中所分流的一路導管與2號袋空袋2相連，另一路導管繼續分流，再形成另一個三通結構6，所分流的兩路導管分別與3號袋和4號袋生理鹽水袋3、4相連。在塑料導管5與每個袋子相連處均設有止流夾9，以防止液體在袋子相互流動，但是當打開止流夾9后液體可以根據需要流向所設定的袋子。同時每個袋子均配有輸液頭7，用于加液或輸注。此外，每個袋子還配有與外接袋無菌連接的導管8，其作用是可以利用無菌連接技術隨時加入制備過程中所需的液體。具體操作步驟為以盛有無菌條件下采集的臍帶血收集袋為樣品，在KX-21血球計數儀上檢測樣本的顧C計數。1、前處理將樣品收集袋平衡后置入大型低溫離心機內，2400rpm、22'C離心5min。離心后輕輕取出塑料收集袋放在分漿夾上，將上層富血小板血漿層擠壓到另一空袋，做為最終懸浮液或其他應用。然后將體積比為l:4的羥乙基淀粉溶液和生理鹽水加入收集袋內，使得血液的紅細胞比積為50—65%，羥乙基淀粉溶液重量百分比濃度為6%。2、加液利用無菌接口機將Ficoll-Hyp叫ue混合溶液(淋巴細胞分離液)的樣管與四聯袋主袋的與外接袋無菌連接的導管8聯接，按照前處理過血液的體積以2:l的比例，將Ficoll-Hypaque混合溶液(淋巴細胞分離液)加入到四聯袋主袋內，使主袋上方保留一些氣體，形成一個較大的液面。再將樣品收集袋與盛有淋巴細胞分離液的主袋無菌連接，使樣本收集袋中血液沿主袋袋袋壁緩慢加入主袋的液面上，保持血液和淋巴細胞分離液的界面清晰。3、離心將加液后的四聯袋平衡后置入大型低溫離心機內，1200rpm、22'C離心30min。離心后輕輕取出塑料袋放在分漿夾上，此時袋內的液體自上而下分為5層，分別為含有少量血漿血小板的上清層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層、多核細胞層、紅細胞層。4、分離將含有少量血漿血小板的上清層層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層的上部，擠壓入2號空袋內，即為富含MNC的液體。此時用止流夾阻斷1號袋與2號袋通路。5、洗滌打開2號袋與3號袋的止流夾，將3號袋內的生理鹽水加入2號袋并加滿，然后關閉2號袋與3號袋的止流夾。將四聯袋平衡后2500rpm、22。C離心7min，將上清液擠壓入l號主袋。然后將3號袋剩余的生理鹽水和4號袋的生理鹽水再次將2號袋加滿，如上條件離心，離心后將上清液擠壓入3號袋。6、懸浮將4號袋剩余的生理鹽水按照臨床要求體積加入2號袋，以調整懸浮麗C的最終濃度或體積。斷開2號袋與其他袋的聯接，即為密閉系統收集的MNC。同時留樣檢測。實施例2樣品收集袋中為骨髓，羥乙基淀粉溶液和生理鹽水體積比為l:5,前處理過的臍帶血、骨髓或外周血與淋巴細胞分離液的體積比為l:1，前處理時離心條件為2000rpm、22。C離心5min，步驟(3)中離心條件為1000rpm、22。C下離心30min，洗滌時離心條件為2200rpm、22'C下離心7min，其它步驟和條件同實施例l。實施例3樣品收集袋中為外周血，前處理時離心條件為2500rpm、22。C離心5min，步驟(3)中離心條件為1500rpm、22。C下離心30min，洗滌時離心條件為2800rpm、22。C下離心7min，其它步驟和條件同實施例l。實施例4樣品收集袋中為外周血，前處理時離心條件為2200rpm、22。C離心5min，步驟(3)中離心條件為1200rpm、22。C下離心30min，洗滌時離心條件為2600rpm、22。C下離心7min，其它步驟和條件同實施例l。比較例l本比較例是從臍帶血中分離單個核細胞的幾種方法的比較。所采用方法分別是-實施例1方法、試管法和《多聯袋無菌制備臍帶血間質干細胞的方法及效果》一文中所采用方法(以下簡稱對比文)；1、材料和方法l.l試劑與儀器見實施例l前說明，對比文所用四聯袋為無菌塑料四聯袋(山東威高集團公司生產l個主袋，2個空袋，l個生理鹽水袋)。1.2臍血來源臍血來自鄭州市婦幼保健院正常足月分娩的胎兒臍帶血，取標本前征得產婦及家屬同意，產婦體健，無肝炎、梅毒、艾滋病等傳染性疾病，胎兒無先天性異常，ADA-A抗凝，血量在66140ml，平均體積86ml。臍血分離前按衛生部血液檢測標準進行檢測。1.3實施例1法、試管法、對比文法分離臍血單核細胞方法及分組比較1.3.1對比文法分離臍血單核細胞方法按照樣本的體積以1:1的比例，先將Ficoll-Hypaque混合溶液加入四聯袋的主袋內，利用無菌接口機將盛有Ficoll-Hypaque混合溶液的四聯袋與臍帶血收集袋相連，再將樣本血液沿袋壁緩慢加入四聯袋主袋內液面上，保持血液和淋巴細胞分離液的界面清晰。將四聯袋平衡后置入大型低溫離心機內，1500r/min、22'C離心30min。離心后輕輕取出四聯袋，將主袋放在分漿夾上，此時袋內的液體自上而下分為5層血漿血小板層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層、多核細胞層、紅細胞層。將血漿血小板層的上2/3液體擠壓入四聯袋的一空袋內，將剩余的血漿血小板層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層的上部，擠壓入四聯袋另一空袋內，即為富含單個核細胞的液體。打開無菌生理鹽水袋與富含單個核細胞/間質干細胞的袋的通道，將無菌生理鹽水加入單個核細胞/間質干細胞袋內，平衡后2500r/min、22。C離心7min，棄去上清液，再重復洗滌1次，根據臨床要求用無菌生理鹽水或臍帶血血漿調整懸浮單個核細胞最終濃度1.3.2試管法分離臍血單核細胞方法將采集6小時內的臍血倒入50ml試管內，2000r/min，4。C離心10min，移液管吸出上層部分血漿，剩余的紅細胞懸液每管加入6%HES液3ml充分混勻，再加入0.9%氯化鈉液等倍稀釋。將稀釋的臍血緩緩加入盛有沐木巴細胞分離液的50ml試管內，臍血與淋巴細胞分離液比例為2:1。1800r/min,20min,4'C離心，移液管吸出單核細胞層，1500r/min,8min，重復洗滌兩次。1.3.3分組將45份臍血采用隨機數字表的方法分成兩組，每組15份標本。一組采用實施例1法、一組采用對比文法分離MNC(對比文組)，另一組采用試管法分離(試管組)。1.3.4細胞計數與檢測將三種方法制備的單核細胞用KX-21型血細胞計數儀計數，0.5%臺盼藍染色，顯微鏡下計數活細胞。流式細胞儀檢測分離后CD34+細胞數。1.4細胞培養培養方法將分離的單核細胞以5X106/ml接種于含DMEM/F12培養液的75ml培養瓶中，加入相應細胞因子，5%C02，37'C及飽和濕度條件下培養，培養7天后傾去全部液體，以后根據細胞生長情況，每周全量換液12次，細胞長到8090%融合傳代。分別觀察不同細胞因子組合、紅細胞混入量、首次換液時間對細胞增殖、分化的影響。1.5統計分析實驗數據用spssl0.0軟件分析，采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準0=0.05，p〈0.05有統計學意義。2.結果2.1三種方法分離臍血單核細胞的比較2丄1三組臍血分離前臍血量66140ml,平均86ml;臍血量、細胞濃度及MNC數相比差異無顯著性(pX).05)。見表l。表l分離前三組臍血基本情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注試管法組與對比文組比較*t=0.057，p>0.05;**t=1.433，p>0.05;***t=1.519，p>0.05對比文組與實施例1組比較*t=1.102，p>0.05;**t=1.304，p>0.05;***t=0.317,p>0.052丄2三組方法分離臍血單核細胞的主要指標分離后MNC數、MNC回收率、CD34+細胞數、均高于試管法(p<0.05)，臺盼蘭拒染率、紅細胞混入量二者比較差異無統計學意義(pX).05)，MNC細胞活力相當。見表2表2三種方法分離臍血后主要指標檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注試管法組與對比文組比較t=2.116,p<0.05;*t=0.468,p>0.05;★t=3.269,p<0.05;※t=1.607,p>0.05;▲t=2.173，p<0.05對比文組與實施例1組比較t=0.254,p>0.05;參t=2.513,p<0.05;*t=0.269,p>0.05;※t=0.607,p>0.05;▲t=0.793,p>0.052.1.3細菌培養三種方法分離的MNC均進行需氧菌、厭氧菌和霉菌培養。實施例1法和對比文法無一例細菌污染，而試管法有1例細菌污染，革蘭氏染色為陽性菌；1例真菌污染，肉眼觀察有霉菌斑塊，倒置顯微鏡下可發現菌絲。可見，本發明分離單個核細胞紅細胞混入量低，無須在百級凈化環境下即可分離單個核細胞，不受樣本數量、體積限制，效率高，無污染，不僅可以用于實驗室研究，也可以直接用于人體治療，且結構簡單，便于成批生產。權利要求1、一種分離單個核細胞的方法，其特征在于，包括(1)、前處理將臍帶血、骨髓或外周血離心，將上層富血小板血漿層除去，然后加入適量質量百分比濃度為6％的羥乙基淀粉溶液和生理鹽水；使得血液的紅細胞比積為50-65％，其中羥乙基淀粉溶液和生理鹽水的體積比為1∶4-1∶5；(2)、加液將經過步驟(1)前處理過的臍帶血、骨髓或外周血倒入淋巴細胞分離液中，保持臍帶血、骨髓或外周血和淋巴細胞分離液的界面清晰，前處理過的臍帶血、骨髓或外周血與淋巴細胞分離液的體積比為1∶1-2∶1，優選2∶1；所述淋巴細胞分離液為Ficoll-Hypaque混合溶液；(3)、離心將步驟(2)所得的液體離心；此時液體自上而下分為5層，分別為含有少量血漿血小板的上清層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層、多核細胞層、紅細胞層；(4)、分離將含有少量血漿血小板的上清層層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液層的上部取出，即為富含單個核細胞的液體；(5)洗滌在富含單個核細胞的液體中加入生理鹽水，離心，棄去上清液，再加入生理鹽水，同樣的條件下離心，棄去上清液；剩下的部分即為單個核細胞液。2、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(5)最后所得的單個核細胞液中還加入生理鹽水，以調整單個核細胞的最終濃度和體積。3、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中離心條件為2000—2500rpm、22。C下離心5min;步驟(3)中離心條件為1000—1500rpm、22。C下離心30min;步驟(5)中離心條件為2200—2800rpm、22。C下離心7min。4、根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的所有步驟在密閉系統中進行。5、一種分離單個核細胞的裝置，其特征在于，該裝置為由1一4號4個袋組成的四聯袋，其中l號袋為主袋，作用是盛放臍帶血、骨髓或外周血和淋巴細胞分離液的混合液體，2號袋為空袋，用于收集目的細胞層的液體；3、4號袋為生理鹽水袋，已經預充生理鹽水，主要用于無菌洗滌后的目的細胞；4個袋用密閉無菌塑料導管相聯，其中1號袋與2號袋相聯，3、4號袋分別與2號袋相聯。6、根據權利要求5所述的裝置，其特征在于，所述的塑料導管一端與l號袋主袋相連，從l號袋引出后分流，形成一個三通結構，其中所分流的一路導管與2號袋空袋相連，另一路導管繼續分流，再形成另一個三通結構，所分流的兩路導管分別與3號袋和4號袋生理鹽水袋相連。7、根據權利要求5或6所述的裝置，其特征在于，在塑料導管與每個袋子相連處均設有止流夾，以防止液體在袋子相互流動，但是當打開止流夾后液體可以根據需要流向所設定的袋子。8、根據權利要求5或6所述的裝置，其特征在于，每個袋子均配有輸液頭，用于加液或輸注，每個袋子還配有與外接袋無菌連接的導管，其作用是可以利用無菌連接技術隨時加入制備過程中所需的液體。9、根據權利要求5或6所述的裝置，其特征在于，所述l號袋長18cm，寬9cm，可盛液體200ml左右；所述的2號袋長16cm，寬10cm;所述的3、4號袋長18cm，寬12cm。全文摘要本發明提供了一種分離單個核細胞的方法和裝置，特別是一種分離臍帶血、骨髓、外周血單個核細胞的方法和裝置，無須在百級凈化環境下即可分離單個核細胞，不受樣本數量、體積限制，效率高，無污染，不僅可以用于實驗室研究，也可以直接用于人體治療，且結構簡單，便于成批生產。文檔編號C12M1/00GK101560495SQ20081008968公開日2009年10月21日申請日期2008年4月14日優先權日2008年4月14日發明者葉圣勤,李國喜,李建斌,杜廣有,程四國,祥胡,邢培清申請人:深圳市北科生物科技有限公司;河南省紅十字血液中心