專利名稱：一種制備螢火蟲熒光素酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備螢火蟲熒光素酶的方法。
背景技術：
熒光素酶(ludfemse)是一種能將化學能轉變為光能的高效生物催化劑，螢火
蟲熒光素酶(簡稱蟲熒光素酶，firefly luciferase， FL)以熒光素(luciferin)、三磷酸
腺苷(ATP)和02為底物，在Mg2+存在時，將化學能轉化為光能，并發出光量子，
反應式如下 luciferase
A丁P + luciferin + Oi^j"^ AMP + PPi + oxyluciferin + CQa + light
ATP既是熒光素酶催化發光的必需底物，又是所有生物生命活動的能量來源。 在其它反應底物均過量存在的情況下，熒光素酶催化發射熒光的數值與ATP的量呈 線性關系。利用這一特性，早在1947年McELroy等就應用FL來測定ATP，此后， 熒光素酶在生物化學及生物技術的分析應用方面得到了不斷發展。特別是在細菌檢 測方面，由于各生長時期的細菌均有較恒定水平的ATP含量，提取細菌的ATP，利 用生物發光法測定出ATP的含量后，即可推算出樣品中的含菌量，整個過程僅需十 幾分鐘。由于生物發光法無需培養過程、操作簡便、靈敏度高，是目前檢測微生物 最快的方法之一。熒光素酶由于其具有敏感性高、特異性好、反應迅速、操作簡單 和應用范圍廣等優點，現已成為醫學、生物學、環境科學等研究領域中一種新的手 段。因此，對熒光素酶的需求量也日益增加。
作為FL生產原料的螢火蟲，其人工捕捉或養殖受地域和季節限制，且生產周期 長、養殖成本高、提取的酶成分復雜。隨著分子生物學技術的發展，人們轉向用基 因工程方法進行生產。1985年，De Wet等首次克隆了北美螢火蟲(尸.尸;;rafc)的FL 基因，并在大腸桿菌(五w/zehc/^ co/0中表達，從中得到具有生物活性的FL。隨 后，各種發光甲蟲的FL基因相繼克隆成功，并能在原核和真核表達系統中表達。但 是，目前能夠提供FL的廠家主要有Promega、 Sigma和Roche三家國外公司，隨著FL 在國內需求量的增加，FL生產的國產化將是大勢所趨。
大腸桿菌表達系統是基因表達技術中發展最早、目前應用最廣泛的經典表達系 統。它具有遺傳背景清楚、目的基因表達水平高、培養周期短和抗污染能力強等特點，在基因表達技術中占有重要的地位，是分子生物學研究和生物技術產業化發展
進程中的重要工具。
發明內容
本發明的目的是提供一種制備螢火蟲熒光素酶的方法。
本發明所提供的制備螢火蟲熒光素酶的方法，是將螢火蟲熒光素酶基因插入原 核表達載體的多克隆位點，得到含有螢火蟲熒光素酶基因的重組表達載體，再將該 重組表達載體導入大腸桿菌細胞，得到含有該重組表達載體的重組細胞，培養該重 組細胞，表達得到螢火蟲熒光素酶。
所述原核表達載體可為pET系列表達載體，如pET28a。 本發明中所使用的大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21(DE3)。 上述方法中需要用IPTG誘導螢火蟲熒光素酶基因表達，其中，IPTG的濃度為
lmmol/L，誘導時間為6h，誘導溫度為22"C，搖瓶轉速220 r/min，(旋轉半徑為
30匪)。
上述方法中還包括將得到的螢火蟲熒光素酶進行純化的步驟。 本發明的制備螢火蟲熒光素酶的方法具有過程簡單、生長周期短、成本低廉、 易于純化等優點。可緩解蟲熒光素酶主要依賴進口的局面，同時可以促進熒光法微 生物快速檢測系統的開發以及蟲熒光素酶在醫學、環境科學等方面的應用，為ATP 生物發光微生物的快速檢測以及其它方面的應用提供優質的酶制劑。
圖1為本發明的螢火蟲熒光素酶的制備方法及檢測流程圖 圖2為蟲熒光素酶基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果 圖3為重組表達載體的PCR鑒定結果 圖4為重組表達載體的酶切鑒定結果 圖5為蟲熒光素酶的SDS-PAGE純化結果
具體實施例方式
下述實施例中所涉及的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。 本發明的螢火蟲熒光素酶制備過程的具體流程如圖1所示。 實施例1、含有螢火蟲熒光素酶基因(/wc)的重組表達載體的構建 1、引物設計
根據含有北美螢火蟲(尸./Vfl&)熒光素酶基因的載體pGEM-luc (購自promega公司)的核苷酸序列，在其開放閱讀框的末端加上終止密碼子TAA，結合含有His 標簽的載體pET28a的多克隆位點與/wc基因的限制性內切酶位點設計引物。在上游 引物的5，端引入AWel酶切位點，在下游引物的5'端引人狄oI酶切位點，引物由上海 生工公司合成，具體序列如下-
上游弓I物luc-R: 5，-GGCCGGCATATGGAAGACGCCAAAAAC-3' 下游引物luc-F: 5,-GGCCCTCGAGTTACAATTTGGACTTTCC-3， 2、蟲熒光素酶基因(/"c)的PCR擴增
以含有/wc基因的載體pGEM-luc (購自promega公司)為模板，進行PCR擴增， 具體的反應體系為
10X Buffer5 u 1
10mM d鮮s4 iil
上游引物(50 pmol/y 1)1 Ul
下游引物(50 pmol/ul)1 Ul
模板DNA0. 1 u 1
Taq聚合酶0. 5 u 1
滅菌超純水38. 4 y 1
總反應體積50 ul
將反應體系混勻，短暫離心后，放入PCR擴增儀(Eppendorf)中，按下列反應 程序進行PCR反應先94。C變性5 min，然后94。C 30s， 55°C 30s， 72°C 1. 5min， 共30個循環，最后72'C延伸10 min， 4'C冷卻備用。
對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。其中，泳道1為PCR 擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，M為250bp的麗A分子量標準。
3、 重組表達載體的構建
將上述步驟2獲得的含有/"c基因的PCR擴增產物用限制性內切酶7W/el和J力o[進 行雙酶切，酶切產物與用同樣酶切的載體pET28a (購自Novagen公司)用T4連接酶 進行連接，將得到的含有/wc基因的重組表達載體命名為pET28a-luc。
4、 重組表達載體的PCR與酶切鑒定
以重組表達載體pET28a-luc為模板，以luc-R和luc-F為引物，進行PCR擴增。對 PC財廣增產物l。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。其中，泳道1為PCR擴增產物 的瓊脂糖凝膠電泳結果，M為250bp的DNA分子量標準。結果表明，擴增得到大小約為1650bp的目的條帶。
將重組表達載體pET28a-luc用限制性內切酶A^el和J^oI進行雙酶切，酶切產物 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示。其中泳道l為重組表達載體pET28a-luc 酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，M為250bp的DNA分子量標準。從圖4中可以看出， 重組表達載體pET28a-luc酶切后可以看到兩條帶， 一條帶為載體pET28a，另一條帶 為大小約為1650bp的/wc基因。
采用T7通用引物對序列進行測定，測序由上海生工生物技術公司完成。測序結 果表明，插入的1650bp的蟲熒光素酶基因/wc序列如序列表中序列l所示。
實施例2、蟲熒光素酶的誘導表達
將上述實施例l的重組表達載體pET28a-luc轉入大腸桿菌BL21 (DE3)的感受態細 胞中；挑取單菌落，接種于2ml含有終濃度為5(^g/ml卡那霉素的LB培養液中，37°C 200rpm/min振蕩培養過夜。將菌懸液以l: IOO的體積比擴大培養，當菌液的OD,值 達到0.8時，取0.5ml菌液在不同濃度的異丙基-0-D-硫代半乳糖苷(IPTG) (0.5， 1， 1.5， 2mmol/U、不同溫度(22°C， 37°C)和不同時間(2、 4、 6、 12和18h)下 進行誘導，優化誘導條件。同時設轉pET28a和未用IPTG誘導的大腸桿菌BL21(DE3) 作為對照。
分別取上述不同誘導條件下培養的轉入重組表達載體pET28a-luc的大腸桿菌 BL21(DE3)、轉入空載體的大腸桿菌BL21(DE3)和未用IPTG誘導的大腸桿菌 BL21(DE3)，用超聲波破碎菌體，提取蛋白，通過SDS-PAGE電泳觀察蛋白的表達情 況，以確定最佳表達條件。
結果表明，當IPTG的濃度為lmmol/L，誘導時間為6h，誘導溫度為22"，搖瓶 轉速為220r/min (旋轉半徑為30mm)時，蟲熒光素酶的表達量最大。
實施例3、蟲熒光素酶的分離純化
由于上述實施例1構建的重組表達載體pET28a-luc上帶有融合標簽(HisTag) 的基因序列，所以表達出的目的蛋白上也帶有HisTag標簽。因此，禾擁絡合]^2+ 的瓊脂糖顆粒(90pm)通過親和層析法可以進行目的蛋白的純化。親和層析柱購于 GE Healthcare公司。
將轉入重組表達載體pET28a-luc的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有卡那霉素的LB 培養基中培養，按照上述實施例2的方法用IPTG進行誘導表達后，以5000 rpm/min 離心10 min收獲菌體沉淀；將菌體沉淀用含終濃度為0.2mg/ml溶菌酶的BindingBuffer (20 mM磷酸鈉，0.5MNaCl， 20 mM咪唑，pH7.4)重新溶解，超聲波裂解 30次，每次3S， 4。C條件下17000g/min離心20 min收集上清準備上樣。具體的純 化步驟如下
1) 用Binding Buffer平衡柱。
2) 將收集的樣品上清上柱。
3) 用Binding Buffer緩慢過柱淋洗去掉雜蛋白。
4) 用Elute Buffer(20 mM磷酸鈉，0.5MNaCl， 500 mM咪唑，pH7.4)緩慢過 柱，將純化的目的蛋白收集到離心管中。
5) 取純化后的目的蛋白進行SDS-PAGE，觀察目的蛋白的純化效果。 結果如圖5所示，其中，泳道1為樣品純化前的SDS-PAGE檢測結果，泳道2
為樣品純化后的SDS-PAGE檢測結果，M為14. 4KDa 97. 4KDa的蛋白質分子量標準。 實施例4、螢火蟲螢光素酶的產率和酶活的檢測
按照上述實施例2的方法誘導表達后，收獲菌體沉淀，含量為12g/L;按照實 施例3的純化方法分離純化后，用Bradford蛋白濃度測定方法進行產率的測定，實 驗設三次重復，結果表明，蟲熒光素酶蛋白的濃度為54mg/inL。每升發酵液中的菌 體共制備熒光素酶溶液3.5mL，即每升發酵液中蟲熒光素酶的產量為189嗎。
按照蟲熒光素酶檢測系統(購于promega公司)的說明測定上述實施例3純化 后的蟲熒光素酶的活力。具體步驟如下將每孔裝有上述實施例3純化后樣品 的96孔板放入帶進樣器的Modelus微孔板多功能檢測儀(Turner Biosystems公司) 中。用進樣器向每孔中加入10(Hil螢光素酶檢測試劑，進行讀數，延遲時間為2秒， 光測量時間為10秒。然后將96孔板前進到下一個孔后，用熒光檢測儀重復進樣、 讀數步驟。結果表明，純化后的蟲熒光素酶的發光強度(Luminescence, RUL)為5.9 X 107 RLU (Relative light unit) /孔。序列表
<160〉 1
<210> 1
<211> 1650
<212〉 DNA <213〉人工序列
<400〉 1
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60
3ccgctgg3g 3gca^ctgcEi t3aggct3tg asgeiggLtscg ccctggttcc tggaacaeitt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctxtgga 600tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc geicgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg 1650
權利要求
1、一種制備螢火蟲熒光素酶的方法，是將螢火蟲熒光素酶基因插入原核表達載體的多克隆位點，得到含有螢火蟲熒光素酶基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入大腸桿菌細胞，得到含有該重組表達載體的重組細胞，培養該重組細胞，表達得到螢火蟲熒光素酶。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述原核表達載體為pET系列表達載體。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述螢火蟲熒光素酶基因插入原核表達載體pET28a的MM與^/wl酶切位點間，得到重組表達載體pET28a-luc。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌 BL21(DE3)。
5、 根據權利要求1一4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中用IPTG 誘導螢火蟲熒光素酶基因的表達，其中，IPTG的濃度為lmmol/L，誘導時間為6h， 誘導溫度為22°C ，搖瓶轉速220 r/min (旋轉半徑為30 mm)。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將得到的螢火 蟲熒光素酶進行純化的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種制備螢火蟲熒光素酶的方法。將螢火蟲熒光素酶基因插入原核表達載體的多克隆位點，得到含有螢火蟲熒光素酶基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入大腸桿菌細胞，得到含有該重組表達載體的重組細胞，培養該重組細胞，表達得到螢火蟲熒光素酶。本發明的制備螢火蟲熒光素酶的方法具有過程簡單、生長周期短、成本低廉、易于純化、酶活性高和性能穩定等優點。可緩解蟲熒光素酶主要依賴進口的局面，同時可以促進熒光法微生物快速檢測系統的開發以及蟲熒光素酶在醫學、環境科學等方面的應用，為ATP生物發光微生物的快速檢測以及其它方面的應用提供優質的酶制劑。
文檔編號C12N15/53GK101302502SQ20081011482
公開日2008年11月12日 申請日期2008年6月12日 優先權日2008年6月12日
發明者林金明, 勤 肖 申請人:清華大學