專利名稱：：一種通量鑒定小麥高分子量麥谷蛋白亞基的方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物
技術領域：
，涉及小麥品質性狀分子標記的實用檢測方法，特別涉及基于PCR技術的多個小麥優質高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)的快速鑒定。
背景技術：
：蛋白質的數量和質量是影響小麥面粉品質的重要因素。小麥種子儲藏蛋白主要由麥醇溶蛋白(Gliadin)和麥谷蛋白(Glutenin)組成，麥谷蛋白又分為高分子量麥谷蛋白亞基(H麗-GS)和低分子量麥谷蛋白亞(L麗-GS)，亞基間通過二硫鍵結合形成谷蛋白大聚合體，賦予面團獨特的粘彈性和延展性[PaynePI，LawCN，MuddEE.Controlbyhomologousgroup1chromosomesofthehigh_molecular_weightsubunitsofglutenin,amajorproteinofwheatendosperm.TheorApplGenet，1980，58:113—120;WrigleyCW.Giantproteinswithflourpower.Nature,1996，381:738—739;GianibelliMC，Larroque0R，MacRitchieF.Biochemical,genetic,molecularcharacterizationofwheatgluteninanditscomponentsubunits.CerealChem，2001，78:635-646]，可以加工成面包、面條和糕點等多種食品。遺傳和生化研究表明，高分子量谷蛋白的組成和數量與小麥面包力口工品質密切相關[PaynePI，LawCN，MuddEE.Controlbyhomologousgroup1chromosomesofthehigh_molecular_weightsubunitsofglutenin,amajorproteinofwheatendosperm.TheorApplGenet，1980，58:113—120;PaynePI，Geneticsofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlantPhysiol，1987，38:141—153;RadovanovicN，CloutierS，BrownD，etal.Geneticvarianceforglutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem.2002，79:843-849]。高分子麥谷蛋白基因位點Glu-1位于第1同源群染色體長臂，在A、B、D組染色體上含有相應的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl同源基因復合位點，每個Glu-1位點又包含分別編碼x-和y_型高分子麥谷蛋白亞基的2個緊密連鎖基因[PaynePI，LawrenceGJ.Catalogueofallelesforthecomplexloci，Glu-Al，Glu—BlandGlu—Dl，whichcodeforhigh_molecular_weightsubunitsofglutenininhexaploidwheat.CerealResComm，1983，11:29_35;ShewryPR，HalfordNGandTathamAS.Thehigh_molecular_weightsubunitsofwheatglutenin.JournalofCerealScience,1992，15(2):105-120]。Payne首先建立了小麥高分子量谷蛋白亞基(對)對面筋品質貢獻的評分系統，如Axl/Ax2傘和Dx5是目前公認的面包小麥優質亞基[PaynePI，Geneticsofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlantPhysiol，1987，38:141-153]。研究表明，等位基因Glu-Blal編碼的超表達Bx7亞基(Bx7QE)能顯著提高面筋強度[ButowBJ，MaW，GaleKR，etal.MoleculardiscriminationofBx7allelesdemonstratesthatahighlyexpressedhigh_molecular_weightgluteninallelehasamajorimpactonwheatflourdoughstrength.TheorApplGenet，2003，107:31524-1532]，含有Bx7GE的小麥育成品種或地方品種通常都具有更好的面筋強度[VawserMJ，CornishGB.OverexpressionofHMWgluteninsub皿itGlu-Bl7xinhex即loidwheatvarieties(Triticumaestivum).AustralJAgricRes，2004，55:577-588;Lukow0M，ForsythSA，PaynePI.Over—productionofHMWgluteninsubunitscodedonchromosomelBincommonwheat,Triticumaestivum.JGenetBreed,1992，46:187—192;RadovanovicN，CloutierS，BrownD，HumphreysDG，Lukow0M.Geneticvarianceforglutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem，2002，79:843-849]。發掘和利用Bx7°E已成為進一步改良小麥品質的重要途徑，目前發達國家優質小麥育種計劃正加強利用這一基因。普通小麥中的Bx7^亞基來自南美的一個地方品種，中國小麥品種幾乎不含有這一亞基。通過雜交聚合育種引入Bx7，Dx5等優質亞基，是快速改良我國小麥品質的有效途徑。SDS-PAGE是分離和鑒定HMW-GS的傳統方法，但不能有效鑒別分子量大小和遷移率十分接近的亞基[ShewryPR，HalfordNGandTathamAS.Thehigh_molecular_weightsubunitsofwheatglutenin.JournalofCerealScience,1992,15(2):105-120]，且費工費時。近年來，隨著大量的HMW-GS基因被克隆，主要等位基因的DNA分子標記也相應被建立[AhmadM.Molecularmarker-assistedselectionofHMWgluteninallelesrelatedtowheatbreadqualitybyPCR_generatedDNAmarkers.TheorApplGenet，2000，101:892-896;DeBustosA，RubioP，JouveN.MolecularcharacterisationoftheinactivealleleofthegeneGlu—AlandthedevelopmentofasetofAS—PCRmarkersforHMWgluteninsofwheat.TheorApplGenet，2000，100:1085-1094]，利用連鎖分子標記鑒定亞基組成更加方便、準確、可靠。然而在我國現有育種條件下，相對表型鑒定而言，分子標記輔助選擇技術因成本較高未能真正用于育種實踐。與單個基因分子標記的PCR鑒定方法相比，多重PCR(multiplexPCR)技術體系含有多個基因標記引物，通過一次反應能夠對多個性狀基因進行鑒定，實驗成本明顯降低，工作效率顯著提高[MoczulskiM，SalmanowiczBP(2003)MultiplexPCRidentificationofwheatHMWgluteninsub皿itgenesbyallele—specificmarkers.Theor.Appl.Genet.44(4):459-471]。目前，用于小麥研究的多重PCR技術主要涉及與品質相關的高(低)分子谷蛋白亞基基因、籽粒硬度基因和淀粉酶基因等[MaW，ZhangW，GaleKR.Multiplex—PCRtypingofhighmolecularweightgluteninallelesinwheat.Euphytica，2003，134:51-60;ZhangXK，LiuL，HeZH，SunDJ，HeXY，XuZH，ZhangPP，ChenFandXiaXC.DevelopmentoftwomultiplexPCRassaystargetingimprovementofbread-makingandnoodlequalitiesincommonwheat.PlantBreeding,127(2):109-115;張曉科，夏先春，王忠偉，萬映秀，張平治，何心堯，楊燕，何中虎.小麥品質性狀分子標記多重PCR體系的建立.作物學報，2007，33(10):1703-1710]，能夠同時鑒定3個Glu-l位點上重要優質亞基基因的多重PCR技術還未見報道。
發明內容本發明目的是提供一種通量鑒定幾個高分子量谷蛋白優質亞基的多重PCR實用方法。本發明提供的小麥高分子量谷蛋白優質亞基的分子鑒定技術，是通過選用3個已經報道的AxNull、Bx7°E和Dx5亞基基因的特異分子標記，通過優化PCR反應體系和熱循環條件而建立起來的。由于在Glu-Al位點通常只編碼3種亞基，分別是Axl、Ax2*和Ax皿ll[Thompson,RD，D.Bartels，NP.Harberd&RB.Flavell.Characterisationofthemultigenef咖ilycodingforHMWgluteninsub皿itsinwheatusingcDNAclones.TheorA卯lGenet，1983，67:87-96]，通過鑒定Ax皿ll可以間接判斷優質亞基Axl/Ax2氺存在與否，因此該方法經一次PCR和普通瓊脂糖凝膠電泳檢測，可鑒定4種優質亞基的有無。經品種和群體驗證，利用本發明檢測品種(系)的結果可靠、重復性好，為小麥品質改良過程中，育種材料和雜交后代高分子量谷蛋白優質亞基的有效鑒定和選擇，提供了一種簡單、準確的實用檢測方法。用于通量檢測上述分子標記的多重PCR技術屬于本發明的保護范圍。圖1.AxNull、Bx7°E、Dx5亞基組合不同的小麥品系多重PCR凝膠電泳圖。1是分子Marker(D2000)，2是CJ02(AxNull)，3是CJ05(7°E)，4是CJ12(Dx5)，5是CJ54(AxNull+Bx70E)，6是CJ17(AxNull+Dx5)，7是CJ25(Bx70E+Dx5)，8是CJ31(AxNull+Bx70E+Dx5)圖2.部分西藏小麥品種(系)優質亞基組成的多重PCR鑒定。l是分子Marker(D2000)，2-4是XZ10，XZ35，XZ37(AxNull)，5是XZ69(Dx5)，6-7是XZ19，XZ14(AxNull)，8是XZ37(Dx5)，9是XZ84(AxNull)，10是XZ47(AxNull+Dx5)，11-15是XZ28，XZ13，XZ54，XZ61，XZ57(AxNull)，16是XZ42(AxNull+Dx5)，17是XZ72(AxNull)具體實施方法下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例一所需材料DNA的提取和檢測以及PCR引物的選取l.DNA的提取及檢測CTAB法從種子中提取小麥總DNA，利用紫外分光光度計檢測總DNA的質量和濃度。PCR引物序列各分子標記的引物序列、目的片段大小等見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例二多重PCR體系的建立多重PCR反應體系總體積為25ul，包括PCRBuffer(Mg2+Free)、1.5mMMgCI2、200uMdNTP、1.5U的Taq酶和150ng的模板DNA，亞基Bx7°E、Dx5和AxNull特異分子標記的上下游引物分別為5/5/8pmo1。由于3對引物其中一對的退火溫度較高，所以采用一種類似降落PCR的方法來優化擴增條件，最佳熱循環條件為95t:預變性5min，94"C變性30S，62°C退火30S，72。C延伸lmin，8個循環；然后94。C變性30S，58。C退火30S，72。C延伸lmin，27個循環；最后72t:延伸10min。采用該擴增程序可以富集引物與模板正確配對的產物，使每對引物都能合成特異的擴增產物。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后用凝膠成像系統觀察并照相。利用HMW-GS組成已知的7個小麥品種(系)驗證Bx7°E、Dx5和AxNull分子標記多重PCR技術體系的準確性。結果表明，Glu-Al位點為Null的材料均能產生920bp的擴增條帶，Glu-Bl位點為Bx7°E的材料均能產生844bp擴增條帶，Glu-Dl位點為Dx5的材料均能產生476bp的擴增條帶，以上條帶與相應的單一PCR擴增產物大小一致。圖1示Bx7°E、Dx5和AxNul1不同亞基組合材料的多重PCR擴增帶型，含有AxNul1和Bx7°E兩個亞基的品種中，同時擴增出920bp和844bp的2個條帶，含有AxNull和Dx5的品種擴增出920bp和476bp的2個條帶，含有Bx7°E和Dx5的品種擴增出了844bp和476bp的2個條帶，含有lAxNull、1Bx7。e和1Dx5三個亞基的品種，則同時產生920bp、844bp和476bp的3個條帶。實施例三對西藏小麥進行多重PCR鑒定利用本實驗建立的多重PCR體系鑒定89份西藏小麥HMW優質亞基的組成，結果表明在Glu-Al位點，Axl或Ax2承亞基的分布頻率為12.36%，Null劣質亞基出現頻率較高；Dx5亞基的分布頻率為12.36%;在Glu-Bl位點沒有檢測到Bx7°E亞基。有10.11%的供試品種(系)同時具有Axl/Ax2*和Dx5亞基(見圖2)。權利要求一種通量鑒定小麥高分子量麥谷蛋白亞基的方法，其特征在于PCR體系同時含有Glu-A1位點的NullAx、Glu-B1位點的Bx7OE和Glu-D1位點的Dx5亞基基因分子標記引物，經反應體系、擴增程序優化以及普通瓊脂糖電泳分離特異擴增產物，一次反應能同時鑒定上述3個Glu-1位點上的優質亞基。2.權利要求l所述的通量鑒定小麥高分子量麥谷蛋白亞基的方法，其特征在于PCR反應體系中的引物具有如下核苷酸序列，彼此之間不會形成引物二聚體。AxNullForward:ACGTTCCCCTACAGGTACTAReverse:TATCACTGGCTAGCCGACAABx70EForward:CCACTTCCAAGGTGGGACTAReverse:TGCCAACACAAAAGAAGCTGDx5Forward:CGTCCCTATAAAAGCCTAGCReverse:AGTATGAAACCTGCTGCGGAC3.權利要求l所述的通量鑒定小麥高分子量麥谷蛋白亞基的方法，其擴增程序為95。C預變性5min，94。C變性30S，62。C退火30S，72°C延伸lmin，8個循環；然后94。C變性30S，58。C退火30S，72。C延伸lmin，27個循環；最后72。C延伸10min。4.權利要求1所述的通量鑒定小麥高分子量麥谷蛋白亞基的方法在小麥品種改良中的應用。全文摘要本發明屬于分子生物
技術領域：
，涉及基于PCR的小麥品質性狀分子標記的通量實用檢測方法。該方法選用NullAx(Glu-A1位點)、Bx7OE(Glu-B1位點)和Dx5(Glu-D1位點)亞基基因的特異分子標記，通過優化PCR反應體系和熱循環條件，建立起一次反應能同時鑒定Glu-1位點上重要優質亞基的多重PCR體系，且普通瓊脂糖電泳能有效分離特異擴增產物。較之單一PCR反應，該方法檢測效率大大提高，經品種和群體驗證，鑒定結果可靠、重復性好，為育種材料評價和雜交后代高分子量谷蛋白優質亞基的有效鑒定和選擇，提供了一種簡單、準確、快速的實用方法。文檔編號C12Q1/68GK101760507SQ20081014803公開日2010年6月30日申請日期2008年12月25日優先權日2008年12月25日發明者付體華,鄭寒,陳靜申請人:中國科學院成都生物研究所