病毒基因表達的調節的制作方法

專利名稱：病毒基因表達的調節的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用病毒基因的有義和反義RNA片段改變該基因在細胞、植物或動物中的表達的方法。重要的是，這些有義和反義RNA片段能夠形成雙鏈RNA分子。特別是，本發明涉及賦予細胞、植物或動物病毒抗性或耐受性的方法和組合物。優選地，本發明涉及賦予植物病毒抗性或耐受性的方法。本發明還優選地涉及用這些方法獲得的植物細胞，由這些細胞產生的植物，這些植物的后代和這些植物產生的種子。在這些植物細胞或植物中，特定病毒基因表達的改變比利用本領域已知的現有方法獲得的特定病毒基因表達的改變更有效、更有選擇性且更有可預測性。
因此本發明提供 一種方法，包括向細胞中導入多種亞序列，例如RNA片段或DNA序列，其特征在于至少兩種亞序列含有病毒RNA的有義和反義序列，并且能形成雙鏈RNA分子。優選地，該方法包括向一種細胞中導入由多種亞序列組成的RNA，其特征在于至少兩種亞序列含有病毒RNA的序列。優選地，該RNA含有至少一個位于3’末端亞序列上游的翻譯終止密碼子。在另一個實施方案中，該方法包括向一種細胞中導入編碼該RNA表達的核苷酸序列或DNA分子。
因此本發明提供 一種方法，包括向細胞中導入病毒靶基因的有義RNA片段，和該靶基因的反義RNA片段，其中該有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中該靶基因在該細胞中的表達被改變。在一個優選實施方案中，靶基因含有一種病毒基因組或其部分，細胞優選地對病毒有抗性或耐受性。在一個優選實施方案中，所述病毒選自蕃茄斑萎病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、黃癥病毒、黃瓜花葉病毒、雀麥花葉病毒、長線病毒、番茄叢矮病毒和真菌傳棒狀病毒。在另一個優選實施方案中，RNA片段含有來源于病毒外殼蛋白基因、病毒核殼蛋白基因、病毒復制酶基因、運動蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一個優選實施方案中，細胞是一種植物細胞，如單子葉或雙子葉植物細胞。在另一個優選實施方案中，RNA片段包含于兩種不同的RNA分子中。在另一個優選實施方案中，RNA片段在被導入細胞中之前混合。在另一個優選實施方案中，RNA片段在被導入細胞中之前，在能使其形成雙鏈RNA分子的條件下混合。在另一個優選實施方案中，這些RNA片段被順序導入所述細胞中。在又另一個優選實施方案中，這些RNA片段包含于一種RNA分子中。在這種情況中，該RNA分子優選地能夠折疊，使得其中包含的所述RNA片段形成雙鏈RNA分子。
本發明還提供 一種方法，包括向一種細胞中導入能在該細胞中表達病毒靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中該病毒靶基因在該細胞中的表達被改變。在一個優選實施方案中，靶基因含有一種病毒基因組或其部分，細胞優選地對病毒有抗性或耐受性。在一個優選實施方案中，所述病毒選自蕃茄斑萎病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、黃癥病毒、黃瓜花葉病毒、雀麥花葉病毒、長線病毒、番茄叢矮病毒和真菌傳棒狀病毒。在另一個優選實施方案中，DNA片段含有來源于病毒外殼蛋白基因、病毒核殼蛋白基因、病毒復制酶基因、運動蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一個優選實施方案中，細胞是一種植物細胞，如單子葉或雙子葉植物細胞。在一個優選實施方案中，這些DNA序列穩定地整合于植物細胞的基因組中。在一個優選實施方案中，DNA分子還含有與所述第一種或第二種DNA序列有效連接的啟動子。在另一個優選實施方案中，第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于兩種不同的即分別的DNA分子中。
另外，第一種DNA序列和第二種DNA序列也可包含于一種DNA分子中。在此情況中，第一種DNA序列和第二種DNA序列優選地包含于該DNA分子的同一DNA鏈中，意味著有義RNA片段和反義RNA片段包含于一個RNA分子中。優選地，該RNA分子能夠折疊，使得其中包含的所述RNA片段形成雙鏈區。這種RNA分子的例子包括SEQ IDNO13、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO25或SEQ ID NO28的反向重復序列。在另一個優選實施方案中，有義RNA片段和反義RNA片段包含于或者表達為兩種RNA分子。在此情況中，第一種DNA序列和第二種DNA序列優選地與一種雙向啟動子有效連接，或者另外，第一種DNA序列與第一種啟動子有效連接，而第二種DNA序列與第二種啟動子有效連接，其中第一種啟動子和第二種啟動子是相同的啟動子或不同的啟動子。在另一個優選實施方案中，第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于該DNA分子的互補鏈中。
在另一個優選實施方案中，在所述DNA分子中，第一種DNA序列是第二種DNA序列的互補DNA鏈。在此情況中，該DNA分子另外含有與所述第一種或第二種DNA序列有效連接的第一種啟動子。在一個優選實施方案中，該DNA分子另外在第一種啟動子與第一種或第二種DNA序列之間含有第一個位點特異性重組位點，在第一種DNA序列3’末端含有第二個位點特異性重組位點，其中第一個和第二個位點特異性重組位點能夠在位點特異性重組酶的存在下，翻轉位于第一個和第二個位點特異性重組位點之間的第一種或第二種DNA序列。在另一個優選實施方案中，由于這種翻轉，第一種啟動子能夠表達第二種(或第一種，取決于哪種DNA序列與該啟動子有效連接)DNA序列。植物細胞優選地另外含有一種能夠識別所述位點特異性重組位點的位點特異性重組酶。
在另一個優選實施方案中，該DNA分子另外含有與所述第一種DNA序列有效連接的第一種啟動子，和與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動子，其中第一種啟動子和第二種啟動子包括相同的啟動子或不同的啟動子。
在另一個優選實施方案中，DNA分子中的啟動子包括該細胞的天然啟動子。在另一個優選實施方案中，該啟動子是異源啟動子，例如組織特異性啟動子、發育調節型啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子。任選地，該啟動子是一種能在啟動子任一側起始DNA序列轉錄的趨異(divergent)啟動子或雙向啟動子。
在另一個優選實施方案中，DNA分子在編碼有義和反義RNA片段的DNA序列之間含有一個接頭。該接頭包含，例如，含有功能基因(如選擇性標記基因)或調節序列(如內含子加工信號)的表達盒。
本發明另外還提供 一種細胞，其含有本發明的有義和反義RNA片段，其中所述RNA片段改變了所述病毒靶基因在該細胞中的表達。在一個優選實施方案中，細胞對病毒有抗性或耐受性。在一個優選實施方案中，細胞是一種植物細胞，本發明進一步提供由該植物細胞產生的植物及其后代，和該植物產生的種子。
本發明還提供 含有本發明的DNA序列的DNA構建體。
在一個優選實施方案中，這種DNA構建體包含能在細胞中表達病毒基因組或其部分的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該病毒基因組或其部分的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子。在另一個優選實施方案中，該病毒基因組或其部分在該細胞中的表達改變。在另一個優選實施方案中，該細胞中一種植物細胞。在另一個優選實施方案中，該病毒選自蕃茄斑萎病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、黃癥病毒、黃瓜花葉病毒、雀麥花葉病毒、長線病毒、番茄叢矮病毒和真菌傳棒狀病毒。在另一個優選實施方案中，DNA序列含有來源于病毒外殼蛋白基因、病毒核殼蛋白基因、病毒復制酶基因、運動蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一個優選實施方案中，DNA構建體進一步含有與所述第一種或第二種DNA序列有效連接的啟動子。在另一個優選實施方案中，DNA構建體含有與所述第一種DNA序列有效連接的第一種啟動子，和與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動子。在另一個優選實施方案中，DNA構建體還含有與第一種DNA序列和第二種DNA序列有效連接的雙向啟動子。
本發明還提供 一種DNA構建體，其包含 (a)能在細胞中表達靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中在該DNA構建體中，第一種DNA序列是第二種DNA序列的互補鏈。
(b)一種與所述第一種或第二種DNA序列有效連接的啟動子。
(c)在該啟動子與第一種或第二種DNA序列之間的第一個位點特異性重組位點，和 (d)在第一種或第二種DNA序列3’末端的第二個位點特異性重組位點，其中第一個和第二個位點特異性重組位點能夠在位點特異性重組酶的存在下，翻轉位于第一個和第二個位點特異性重組位點之間的第一種或第二種DNA序列。
在一個優選實施方案中，該靶基因在該細胞中的表達被改變。
本發明還提供 一種DNA構建體，其包含 (a)能在細胞中表達靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中在該DNA構建體中，第一種DNA序列是第二種DNA序列的互補鏈。
(b)與第一種DNA序列有效連接的第一種啟動子。
(c)與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動子。
在一個優選實施方案中，該靶基因在該細胞中的表達被改變。
“雙鏈RNA(dsRNA)”分子包含靶基因的有義RNA片段和同一靶基因的反義RNA片段，兩者都含有彼此互補的核苷酸序列，從而使得有義和反義RNA片段配對，形成雙鏈RNA分子。
“互補的”是指含有反平行核苷酸序列的兩種核苷酸序列，它們能在反平行核苷酸序列的互補堿基殘基之間形成氫鍵后彼此配對。
“反平行的”在此是指在互補堿基殘基之間通過氫鍵配對的兩種核苷酸序列，在一種核苷酸序列中磷酸二酯鍵為5’-3’方向，而在另一種核苷酸序列中為3’-5’方向。
“靶基因”是已知功能的任一病毒基因，或者是功能未知但全部或部分核苷酸序列已知的基因。靶基因是該細胞的天然基因，或者是以前已經優選地通過遺傳轉化或病毒感染細胞而導入細胞中的異源基因。優選地，靶基因是植物細胞中的一種基因。
“天然”基因是指存在于未轉化細胞的基因組中的基因。
“必需”基因是編碼細胞生長或存活所必需的蛋白質如生物合成酶、受體、信號轉導蛋白、結構基因產物或轉運蛋白的基因。
“改變”靶基因在細胞中的表達意思是，在應用本發明的方法后，靶基因在細胞中的表達水平不同于其在應用該方法之前在細胞中的表達。改變基因表達優選地是指，靶基因在細胞中的表達降低，優選地強烈降低，更優選地基因的表達不可檢測，使細胞或由其衍生的植物或動物產生敲除突變表型。
在本發明申請書中“分離的”是一種分離的核酸分子，其通過人工操作與其天然環境分離，因此不是一種天然產物。分離的核酸分子可能以純化的形式存在，或者可能存在于非天然環境中，如轉基因宿主細胞中。
在此使用時，“表達盒”意思是能引導特定核苷酸序列在合適的宿主細胞中表達的DNA序列，包含與目的核苷酸序列有效地連接的啟動子，該核苷酸序列與終止信號有效地連接。它一般還包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。編碼區通常編碼一種目的蛋白，但也可編碼一種目的功能性RNA，例如有義或反義方向的反義RNA或非翻譯RNA。含有目的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，意思是其至少一種成分對于至少另一種成分是異源的。表達盒也可是天然存在，但已經以可用于異源表達的重組形式獲得的。然而一般而言表達盒對于宿主是異源的，即表達盒的特定DNA序列不在宿主細胞中天然存在，必須通過轉化事件被導入宿主細胞或宿主細胞的祖先中。表達盒中核苷酸序列的表達可以受組成型啟動子或誘導型啟動子控制，該啟動子只有在宿主細胞接觸某種特定外部刺激物時才起始轉錄。對于多細胞生物，如植物，啟動子也可能是對特定組織或器官或發育階段特異的。
在此使用時，“異源的”意思是“不同自然來源的”，或者表示一種非自然狀態。例如，如果用從來源于另一種生物尤其是另一個種的核酸序列轉化宿主細胞，該核酸序列對于該宿主細胞是異源的，對于攜帶該核酸序列的該宿主細胞的后代也是異源的。類似地，異源是指來源于和插入相同自然、原始細胞型的核苷酸序列，但它以非自然狀態存在，例如，不同拷貝數，或處于不同調節元件控制之下。
最廣義地來說，當在此對核苷酸序列使用時，術語“基本上類似”意思是一種對應于參照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相應的序列編碼一種與參照核苷酸序列編碼的多肽有基本上相同的結構和功能的多肽，例如，只發生不影響多肽功能的氨基酸改變。希望地，基本上類似的核苷酸序列編碼參照核苷酸序列編碼的多肽。基本上類似的核苷酸序列與參照核苷酸序列之間同一性的百分數(互補序列中的互補堿基數除以互補序列中的堿基總數)希望地為至少80％，更希望地為85％，優選地至少90％，更優選地至少95％，再更優選地至少99％。
“調節元件”是指參與引起核苷酸序列表達的序列。調節元件包含與目的核苷酸序列有效連接的啟動子和終止信號。它們一般還包含該核苷酸序列適當翻譯所需的序列。
“植物”指處于任何發育階段的任何植物或植物的部分。其中也包括插條、細胞或組織培養物和種子。在本發明中使用時，術語“植物組織”包括但不限于，整個植物、植物細胞、植物器官、植物種子、原生質體、愈傷組織、細胞培養物和組織成結構和/或功能單位的任何植物細胞組。
“病毒抗性或耐受性”在此是指，抗性或耐受性細胞、植物或動物不是易感的，與敏感的細胞、植物或動物相比，具有降低的對一種或多種病毒的敏感性。例如，抗性或耐受性是指，病毒感染的普通癥狀缺如或降低，或病毒在細胞中的積累或復制被阻止或降低，或病毒的運動例如從細胞到細胞的運動被阻止或減少。
“病毒基因組或其部分的表達的改變”一般被理解為，病毒或其部分或成分如病毒的RNA、DNA或蛋白質在細胞中的積累、復制或運動受到影響。
本發明涉及調節即改變病毒基因在細胞、植物或動物中的表達的方法。調節基因在細胞、植物或動物中表達的常用方法缺乏可預測性，并且顯示取決于根據所調節的基因的變化性。本方法解決了這些問題，并且為細胞、植物或動物中基因的可重復和有效調節作了準備。
其表達被調節的基因是病毒基因組或其部分。在一個優選實施方案中，細胞是一種真核細胞，更優選地是一種植物細胞，如單子葉或雙子葉植物細胞，或一種動物細胞，如來自哺乳動物如人、牛、綿羊、豬、貓或犬，或來自禽類的細胞。
本發明利用病毒靶基因的有義RNA片段和反義RNA片段改變基因在細胞中的表達。在第一個實施方案中，本發明提供了一種方法，包括向細胞中導入靶基因的有義RNA片段，和該靶基因的反義RNA片段，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中靶基因在所述細胞中的表達被改變。通過不同轉化方法(如粒子轟擊或PEG介導的轉化或電穿孔)將RNA片段導入細胞中。在另一個優選實施方案中，使用其他技術，如RNA片段的顯微注射。在一個優選實施方案中，這些RNA片段包含于兩種不同的RNA分子中。在此情況中，RNA片段在被導入所述細胞之前混合，例如在能使其形成雙鏈RNA分子的條件下混合。在另一個優選實施方案中，這些RNA片段被順序導入所述細胞中。優選地，導入每種RNA分子的時間間隔很短，優選地不到1小時。在又另一個實施方案中，這些RNA片段包含于一種單一RNA分子中。利用一種RNA分子，兩種互補的RNA片段緊密接近，引起配對，這是有利的。在這種情況中，RNA分子優選地能夠折疊，使得其中包含的RNA片段形成雙鏈區。在這種情況中，RNA片段的互補部分彼此識別，互相配對，形成雙鏈RNA分子。在一個優選實施方案中，在導入細胞中之前，在能使其形成雙鏈RNA分子的條件下溫育RNA片段。在又另一個實施方案中，RNA分子在有義RNA片段和反義RNA片段之間含有一個接頭。該接頭優選地包含含有功能基因(如選擇性標記基因)的表達盒所編碼的RNA序列。在另一個實施方案中，接頭包含調節序列編碼的RNA序列，例如，含有內含子加工信號。
在另一個優選實施方案中，本發明提供一種改變病毒基因組表達的方法，包括向細胞中導入能在該細胞中表達該病毒基因組的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達病毒基因組的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子。在一個優選實施方案中，第一種DNA序列和第二種DNA序列穩定地整合于細胞的基因組中。在另一個優選實施方案中，DNA序列包含于兩種不同的DNA分子中。在另一個優選實施方案中，DNA序列包含于一個DNA分子中。在這種情況中，該DNA分子優選地編碼一種含有有義和反義RNA片段的單個RNA分子。利用一種單個RNA分子，兩種互補的RNA片段緊密接近，引起配對，這是有利的。該DNA分子編碼兩種不同的RNA分子，例如一種含有有義RNA片段的RNA分子和一種含有反義RNA片段的RNA分子。單個RNA分子或兩種不同的RNA分子優選地能夠折疊，使得包含的RNA片段形成雙鏈區。其中RNA片段的互補部分彼此識別，互相配對，形成雙鏈RNA分子。
在一個實施方案中，一種DNA分子或兩種不同DNA分子的每一種含有與該DNA序列有效連接的啟動子。在一個優選實施方案中，該DNA序列中的啟動子含有一種天然植物啟動子或欲滅活的病毒基因的自然啟動子，以確保雙鏈RNA在相同組織中在發育的相同時間表達為病毒靶基因。在另一個實施方案中，啟動子是一種異源啟動子，例如組織特異性啟動子、發育調節型啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子。
在另一個實施方案中，DNA序列在編碼兩種互補RNA片段的DNA序列之間含有一種接頭。該接頭優選地包含含有功能基因(如選擇性標記基因)的表達盒。在另一個實施方案中，該接頭包含調節序列，例如包含內含子加工信號。
本發明的DNA分子通過本領域周知的和以下所述的方法轉化細胞。本發明也提供了一種含有本發明的DNA序列的DNA構建體，含有這些DNA構建體的重組載體，和含有本發明的DNA序列的組合物。在本發明中，有義與反義RNA片段之間互補區的長度希望地至少15個核苷酸長，更希望地至少50個核苷酸長，優選地至少500bp長。優選地，互補區小于5kb，更優選地小于2kb。在一個具體實施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補區含有靶基因的編碼區。在另一個優選實施方案中，互補區含有靶基因的非翻譯區(UTR)，例如5’UTR或3’UTR。在另一個優選實施方案中，編碼本發明的有義或反義RNA片段的DNA序列來源于一種c-DNA分子，或含有將改變其表達的病毒靶基因的調節元件，如啟動子或終止信號。
在另一個優選實施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補區與表達被改變的基因的相應序列相同。在另一個優選實施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補區基本上類似于表達被改變的基因的相應序列，并且仍能改變該基因的表達。在這種情況中，互補區與表達被改變的基因的相應序列希望地至少50％相同，更希望地至少70％相同，優選地至少90％相同，更優選地至少95％相同。因此，應用一個雙鏈RNA分子可以改變一種基因或多種基因的表達，單個基因包含與雙鏈RNA相同，或基本上類似于雙鏈RNA的序列。
在另一個優選實施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補區在有義和反義RNA片段之間不包含任何錯配。在另一個優選實施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補區在有義與反義RNA片段之間包含至少一個錯配，兩種RNA片段仍能配對，并形成雙鏈RNA分子，從而改變了基因的表達。希望地，在互補區的有義與反義RNA片段之間有低于50％的錯配，更希望地低于30％的錯配，優選地低于20％的錯配，更優選地低于10％的錯配，再更優選地低于5％的錯配。
病毒的抗性或耐受性 本發明產生具有病毒抗性或耐受性的細胞、動物或植物。用本發明防治的病毒包括但不限于dsDNA病毒、dsRNA病毒、正鏈和負鏈ssRNA病毒、雙義RNA病毒和反轉錄病毒。優選防治的是植物病毒，如蕃茄斑萎病毒(例如，蕪菁花葉病毒，縮寫為TuMV；萵苣花葉病毒，縮寫為LMV；西瓜花葉病毒II，縮寫為WMVII；胡瓜黃化花葉病毒，縮寫為ZYMV；馬鈴薯Y病毒，縮寫為PVY；和木瓜環斑病毒，縮寫為PRSV)、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒(例如胡椒淡斑點病毒，縮寫為PMMV，和番茄花葉病毒，縮寫為ToMV)、黃癥病毒(例如甜菜西方黃化病毒，縮寫為BWYV，和甜菜淡黃病毒，縮寫為BWYV)、黃瓜花葉病毒(例如黃瓜花葉病毒，縮寫為CMV)、雙粒病毒(例如番茄黃曲葉病毒，縮寫為TYLCV)、花椰菜病毒(例如花椰菜花葉病毒，縮寫為CaMV)、雀麥花葉病毒、長線病毒、番茄叢矮病毒和真菌傳棒狀病毒(例如甜菜壞死黃葉脈病毒，縮寫為BNYVV)。能用本發明防治的其他類病毒在Zacomer等人(1995)普通病毒學雜志(Jorunal of GeneralVirology)，76231-247和Martelli(1992)植物病害(Plant Disease)，76436-441中有述。為實現病毒防治優選的病毒基因組的DNA序列對應于編碼病毒外殼蛋白、病毒核殼蛋白、病毒復制酶、運動蛋白等的基因區。在WO 95/09920中敘述了用來控制病毒基因組表達的其他核苷酸序列。優選的DNA序列可包括不翻譯為蛋白質的病毒基因組的部分，如5’或3’非翻譯區。
優選地，本發明的方法導致對廣譜病毒的抗性或耐受性。例如，本發明的方法導致對病毒基因組編碼的病毒和相同病毒類、群或屬的其他病毒的抗性或耐受性。此外，本發明的方法也導致對病毒基因組編碼的病毒和同一病毒的其他分離株的抗性或耐受性。本發明的方法也導致對病毒基因組編碼的病毒和相同病毒群或屬的其他病毒的抗性或耐受性，它們屬于不同的種，優選地相關種，優選地存在這些病毒的種。任選地，使用一對以上，即至少兩對能形成dsRNA的有義和反義RNA片段。這些對例如來源于同一病毒基因組，但來源于同一病毒基因組的不同部分。此外，這些對也可來源于不同的病毒基因組。因此，用本發明能獲得對不同病毒類、群或屬的抗性或耐受性。
具有病毒抗性或耐受性的植物細胞和它衍生的植物優選地是雙子葉植物。本發明公開了在甜菜和蕓苔中提供真菌傳棒狀病毒(參見，例如，Rush和Heidel(1995)植物病害79868-875)抗性或耐受性的方法，并在實施例9中對BNYVV——甜菜rhizomania(crazy root)的病因——更詳細描述。提供對“黃化病毒”(參見，例如，《CRC甜菜病害手冊》，第二卷，35-52頁)如分別感染甜菜和油菜的BMYV和甜菜西方黃化病毒(BWYV)的抗性和耐受性的方法在實施例8中詳述。本發明的方法也賦予單子葉植物耐受性和抗性。例如，利用本發明和美國專利5,569,828所述，獲得對玉米褪綠矮縮病毒的耐受性或抗性。類似地，利用本發明和美國專利5,428,144所述，獲得對玉米矮縮花葉病毒的耐受性或抗性。
植物轉化技術 利用常規重組DNA技術將本發明的DNA分子摻入植物或細菌細胞中。通常，本發明的DNA分子包含于一種轉化載體中。可使用大量的這些本領域所知的載體系統，如質粒、噬菌體病毒及其他修飾的病毒。表達系統的成分也可被修飾，例如，用于增強有義和反義RNA片段的表達。例如，可使用截短序列、核苷酸置換或其他修飾。本領域所知的表達系統可用來在適當條件下實際轉化任何作物植物細胞。包含本發明的DNA分子的轉基因優選地穩定轉化到并整合到宿主細胞基因組中。在另一個優選實施方案中，包含本發明的DNA分子的轉基因位于自主復制載體中。自主復制載體的實例是病毒，特別是雙生病毒。轉化細胞優選地再生為整個植物。
按照本發明轉化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、蘿卜、小蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、胡椒、芹菜、筍瓜、南瓜、大麻、夏季南瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、李子、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、菠蘿、鱷梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油籽油菜、三葉草、煙草、胡蘿卜、棉花、苜蓿、稻、馬鈴薯、茄子、黃瓜、擬南芥，和木本植物如松柏類和落葉類樹。希望的核苷酸序列轉化特定植物種后，可以用傳統培育技術在該種中繁殖或轉移到相同種的其他品種中，特別包括商業品種。
A.構建植物表達盒的要求 首先在表達盒中在可在植物中表達的適當啟動子之后裝配欲在轉基因植物中表達的基因序列。這些表達盒也可包含轉基因表達所需或選擇的其他任何序列。這些序列包括但不限于，例如，轉錄終止子、增強表達的外部序列，如內含子、關鍵序列和用于將基因產物導向特定細胞器和細胞區室的序列。然后可將這些表達盒容易地轉移至上述植物轉化載體中。下面是典型表達盒的不同成分的描述。
1.啟動子 在表達盒中使用的啟動子的選擇決定了轉基因植物中轉基因的空間和時間表達模式。選擇的啟動子將在特定的細胞型(如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮細胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達轉基因，此選擇將反映基因產物積累的希望的位置。另外，所選的啟動子可在多種誘導條件下引導基因表達。啟動子在其強度即促進轉錄的能力方面不同。根據使用的宿主細胞系統，可使用本領域所知的多種合適啟動子中的任一種。例如，對于組成型表達，使用CaMV 35S啟動子、稻肌動蛋白啟動子或遍在蛋白啟動子。例如，對于調節型表達，使用來源于煙草或擬南芥的化學誘導型PR-1啟動子(見，例如，美國專利號5,689,044)。
一類優選的啟動子是創傷誘導型啟動子。曾經描述了可在創傷部位表達的多種啟動子。這類優選的啟動子包括Stanford等人，分子普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)215200-208(1989)、Xu等人，植物分子生物學(Plant Molec.Biol.)22573-588(1993)、Logemann等人，植物細胞(Plant Cell)1151-158(1989)、Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學22783-792(1993)、Firek等人，植物分子生物學22129-142(1993)和Warner等人，植物雜志(Plant J.)3191-201(1993)所述的啟動子。
優選的組織特異表達模式包括綠色組織特異、根特異、莖特異及花特異模式。適于在綠色組織中表達的啟動子包括調節參與光合作用的基因的多種啟動子，和已從單子葉植物和雙子葉植物中克隆的多種這類啟動子。一種優選的啟動子是玉米磷酸烯醇羧化酶基因PEPC啟動子(Hudspeth和Grula，植物分子生物學12579-589(1989))。用于根特異表達的一種優選啟動子是de Framond(FEBS 290103-106(1991)；EP 0 452 269)所述的啟動子，另一種優選的根特異啟動子是本發明所述的來自于T-1基因的啟動子。一種優選的莖特異啟動子是美國專利5,625,136所述、能引導玉米trpA基因表達的啟動子。
本發明的優選實施方案是以根特異方式表達核苷酸序列的轉基因植物。其他的優選實施方案是以創傷誘導或病原體感染誘導方式表達核苷酸序列的轉基因植物。
2.轉錄終止子 多種轉錄終止子均可在表達盒中使用。它們負責超出轉基因之外的轉錄終止及其正確的聚腺苷酸化。合適的轉錄終止子是已知在植物中起作用的轉錄終止子，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉及雙子葉植物中。
3.增強或調節表達的序列 已發現許多序列能增強轉錄單位內的基因表達，這些序列可與本發明的基因結合使用而增強其在轉基因植物中的表達。例如，多種內含子序列如玉米Adh1基因的內含子，顯示能增強表達，尤其是在單子葉植物細胞中。另外，已知多種由病毒衍生的非翻譯前導序列也可增強表達，且其在雙子葉植物細胞中特別有效。
4.編碼序列優化 通過改變用于在目的作物種中最佳表達的編碼序列，可以遺傳改造所選基因的編碼序列。修飾編碼序列以實現在特定作物種中最佳表達的方法是眾所周知的(見，例如，Perlak等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)883324(1991)；Koziel等人，生物技術(Bio/technol.)11194(1993))。
在另一個優選實施方案中，本發明的DNA分子被直接轉化到質體基因組中。質體轉化技術在美國專利號5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申請號WO 95/16783中，和McBride等人(1994)美國國家科學院院報91，7301-7305中有廣泛描述。葉綠體轉化的基本技術包括，例如使用biolistics或原生質體轉化(如氯化鈣或PEG介導的轉化)，將側翼為選擇性標記的克隆的質體DNA區與目的基因一起導入合適的靶組織中。1-1.5kb的側翼區，稱為導向序列，可促進與質體基因組的同源重組，從而允許原質體系特定區域的替換或修飾。最初，葉綠體16SrRNA和賦予壯觀霉素和/或鏈霉素抗性的rps12基因中的點突變被用作轉化的選擇性標記(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)美國國家科學院院報87，8526-8530；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物細胞4，39-45)。這些標記間存在克隆位點使得能產生用于導入外源DNA分子的質體導向載體(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBOJ.12，601-606)。通過將隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替換為一種顯性選擇標記——編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷轉移酶的細菌aadA基因，可獲得轉化率的大大提高(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)美國國家科學院院報90，913-917)。以前，該標記已成功用于綠藻萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)質體基因組的高頻轉化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.)194083-4089)。用于質體轉化的其他選擇性標記在本領域中公知，并包括于本發明的范圍之中。
質體表達，其中通過同源重組將基因插入每個植物細胞存在的幾千個拷貝的環形質體基因組中。在一個優選實施方案中，本發明的DNA插入質體導向載體中或轉化到希望的植物宿主的質體基因組中。獲得對含有本發明的DNA分子的質體基因組來說同質的植物，它們優先地能高表達該DNA分子。優選地，該DNA分子編碼的有義和反義RNA片段能夠配對，并能在植物質體中形成雙鏈RNA分子，從而改變質體基因的表達。在一個優選實施方案中，有義和反義片段在互補區中不包含任何錯配。在另一個優選實施方案中，有義和反義片段在互補區中包含至少一個錯配。在該情況中，編碼RNA片段的DNA分子的DNA序列不能互相重組。
B.植物轉化載體的構建 可用于植物轉化的多種轉化載體為植物轉化領域的技術人員所公知，并且與本發明有關的基因可與任何這些載體結合使用。載體的選擇取決于優選的轉化技術和用于轉化的目標種。對于某些目標物種，優選不同的抗生素或除草劑選擇標記。轉化中常規使用的選擇標記包括賦予卡那霉素及相關抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304184-187(1983))、賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究181062(1990)，Spencer等人，理論與應用遺傳學(Theor.Appl.Genet.)79625-631(1990))、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細胞生物學42929-2931)，和賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))，和賦予草甘膦抗性的EPSPS基因(美國專利號4,940,935和5,188,642)。
1.適用于農桿菌(Agrobacterium)轉化的載體 許多載體可用于應用根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉化。它們一般帶有至少一個T-DNA邊界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ的載體。適用于農桿菌轉化的典型載體包括二元載體pCIB200和pCIB2001，以及二元載體pCIB10及其潮霉素選擇衍生物。(見，例如，美國專利號5,639,949)。
2.適用于非農桿菌轉化的載體 不使用根瘤農桿菌的轉化避免了對所選的轉化載體中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的載體外，也可應用缺少這些序列的載體。不依賴于農桿菌的轉化技術包括通過粒子轟擊、原生質體攝取(如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉化。載體的選擇主要取決于待轉化的物種的優選。適用于非農桿菌轉化的典型載體包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(見，例如，美國專利號5,639,949)。
C.轉化技術 目的DNA序列被克隆到表達系統中后，即轉化植物細胞。植物轉化和再生的方法在本領域中眾所周知。例如，Ti質粒載體已用于外源DNA的送遞，以及直接DNA攝取、脂質體、電穿孔、顯微注射和微粒轟擊。另外，也可用農桿菌屬的細胞轉化植物細胞。
用于雙子葉植物的轉化技術在本領域中眾所周知，包括基于農桿菌的技術和不需要農桿菌的技術。非農桿菌的技術包括原生質體或細胞對外源遺傳物質的直接攝取。這可通過PEG或電穿孔介導的攝取、粒子轟擊介導的送遞、或顯微注射來完成。在所有情況中，都用本領域公知的標準技術使轉化的細胞再生為整個植物。大多數單子葉植物種的轉化現也已成為常規。優選的技術包括使用PEG或電穿孔技術向原生質體中直接轉移基因，對愈傷組織的粒子轟擊，以及農桿菌介導的轉化。
將參照下列詳細實施例進一步描述本發明。提供這些實施例只是為了說明目的，除非另外指明而不意在限制。
實施例 在此使用的標準重組DNA和分子克隆技術在本領域中公知，并由Sambrook等人的《分子克隆》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY(1989)，和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist的《基因融合實驗》，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1984)，和Ausubel，F.M.等人的《現代分子生物學方法》，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)描述。
實施例1螢光素酶基因表達的調節 編碼螢光素酶RNA雙鏈體的嵌合DNA分子的構建 使用寡核苷酸引物ds_Luc1(5’-CGC GGA TCC TGG AAG ACGCCA AAA ACA-3’，SEQ ID NO1；BamHI限制位點以下劃線標出)和ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TATCCG GAA TG-3’，SEQ ID NO2；HindIII限制位點以下劃線標出)，從pPH108質粒DNA中擴增來源于質粒pLuc+(Promega)的螢火蟲螢光素酶基因的738bp“有義”方向片段。按照使用手冊在50μl反應體積中使用TurboPfu熱穩定DNA聚合酶(Stratagene)，95℃/1分鐘、55℃/1.5分鐘、72℃/2分鐘5個循環，隨后95℃/1分鐘、72℃/3.5分鐘25個循環。用類似的方法，使用寡核苷酸引物ds_Luc3(5’-CGG TCT AGAGGA AGA CGC CAA AAA CAT A-3’，SEQ ID NO3；XbaI限制位點以下劃線標出)和ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAATCG CAG TAT CCG GAA TG-3’，SEQ ID NO4；HindIII限制位點以下劃線標出)，從pPH108質粒DNA中PCR擴增來源于質粒pLuc+的螢火蟲螢光素酶基因的737bp“反義”方向片段。通過由低熔點瓊脂糖(FMC)制備的1％Tris-乙酸鹽凝膠電泳，隨后酚-氯仿抽提切下的含有PCR產物的凝膠片，純化得到的DNA片段。按照標準方法，用BamHI和HindIII消化有義產物(ds_Luc1/2)的DNA，用XbaI和HindIII消化反義產物(ds_Luc3/2)的DNA(限制酶從New England Biolabs獲得)。得到的粘末端DNA片段如上所述凝膠純化。通過用BamHI和HincII消化質粒CSA104并純化564bp DNA片段，獲得含有mas 1’啟動子的DNA片段(Velten等人(1984)EMBO J.32723-2730)。該片段再用BamHI消化，分離并凝膠純化含有mas 1’啟動子的484bp EcoRI-BamHI亞片段。為了構建質粒pPH169，用EcoRI和XbaI消化克隆載體pLitmus29(New England Biolabs)的DNA，并以四路反應用T4DNA連接酶(New England Biolabs)將分離的片段與mas 1’啟動子EcoRI-BamHI片段和有義(BamHI-HindIII)及反義(HindIII-XbaI)ds_Luc螢光素酶基因片段連接。
為了構建二元載體pPH170，以用于應用ds_Luc1/2/3雙鏈構建體的農桿菌介導的植物轉化，用EcoRI和XbaI消化帶有用于細菌篩選的卡那霉素抗性基因和用于轉基因植物篩選的潮霉素抗性基因的二元質粒pSGCHC1的DNA。以四路反應用T4DNA連接酶(New EnglandBiolabs)將得到的自pSGCHC1分離的11.6kb片段與mas 1’啟動子EcoRI-BamHI片段和有義(BamHI-HindIII)及反義(HindIII-XbaI)ds_Luc螢光素酶基因片段連接。
農桿菌的轉化和擬南芥植物的真空滲入 通過電穿孔將質粒pPH170導入根瘤農桿菌GV3101中，篩選并擴增轉化的菌落。用帶有pPH170二元T-DNA載體的農桿菌克隆真空滲入組成型(UBQ3啟動子(Norris等人(1993)PMB 21895-906)/UBQ3+CaMV 35S 5’UTR/luc+；pPH108)或誘導型(擬南芥PR-1啟動子/luc+；pPH135，6E系)表達螢光素酶的四至五周齡擬南芥突變系植物。在潮霉素和卡那霉素上共篩選轉化植物，并在控制的人工氣候室條件下生長，以測定螢光素酶活性。另外，在BTH誘導48小時后(BTH處理基本如Lawton等人，植物雜志1071-82所述)，估測pPH135-6E背景的螢光素酶活性。在加入螢光素底物后，用基于發光的測定法定量組織提取物中的螢光素酶活性。也可用CCD-冷成像系統(Hamamatsu)監測植物中的螢光素酶活性。
實施例2擬南芥GL1基因表達的調節 GL1基因編碼起始正常毛狀體(葉毛)形成所需的myb樣轉錄因子(Oppenheimer等人(1991)細胞67483-493)。發育早期GL1表達的敲除產生缺乏毛狀體的植物。敲除表型在幼苗中易于鑒定，并且不是致死的。構建了用于組成型表達的三種載體和用于Gal4/C1調節表達的三種載體。檢測每種啟動子的三種不同載體是GL1基因片段的有義(+)表達、反義(-)表達和雙鏈(+/-)RNA表達。(+)和(-)載體是用于比較其對GL1表達的影響的對照。在每種情況中，用GL1序列(GenBank保藏M79448)從堿基#739-#1781的5’片段進行載體構建。
Gal4C1調節的表達 將GL1基因片段作為NcoI-SacI片段克隆到雜交誘導型載體構建體pJG304-1中。質粒pJG304由pBSSK+衍生。質粒pBS SK+(Stratagene，LaJolla，CA)用SacI線性化，用綠豆核酸酶處理除去SacI位點，并用T4連接酶再連接形成pJG201。用KpnI從pAT71中除去10XGAL4共有結合位點/CaMV 35S最小啟動子/GUS基因/CaMV終止子盒，并克隆到pJG201的KpnI位點，形成pJG304。質粒pJG304用限制性內切核酸酶Asp718部分消化，分離全長線性片段。該片段與摩爾過量的22堿基寡核苷酸JG-L(5’-GTA CCT CGA GTC TAG ACT CGA G-3’，SEQ ID NO4)連接。用限制性分析鑒定該接頭插入GAL4 DNA結合位點5’的克隆，該質粒被命名為pJG304DXhoI。
通過合成5’端含有合適限制位點的PCR引物，向(+)和(-)片段的末端添加NcoI和SacI位點。通過首先產生以下兩個片段來產生(+/-)GL1片段在5’端含有NcoI位點，在3’端含有HindIII位點的a(+)片段，在5’端含有HindIII位點，在3’端含有SacI位點的a(-)片段。通過在EcoRI位點處連接得到的片段產生雙鏈單位。該表達單位含有Gal4 DNA結合域，隨后是最小TATA序列，和方向為(+)、(-)或(+/-)的GL1基因片段。
組成型表達 使用在雙子葉植物中相對較強且為組成型的農桿菌甘露氨酸合酶mas 1’啟動子。如上所述，將GL1(+)、(-)和(+/-)片段連接在pBluescript中的1’啟動子之后。三種不同的表達盒作為EcoRI/SalI片段連接于pCIB200中(Uknes等人(1993)植物細胞5159-169)。
實施例3胱硫醚β-裂合酶基因表達的調節 胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因編碼甲硫氨酸生物合成途徑中的一個步驟。調節其在植物中的表達的作用用有義和反義構建體和雙鏈RNA構建體檢測。
反義構建體使用二元BASTA載體pJG261，其含有pJG304DXhoI載體的片段，并以反義方向插入CBL基因的部分(核苷酸#13-1159，GenBank保藏#L40511)。
有義構建體除了CBL片段為相反方向外，與反義構建體相同。該構建體含有ATG起始密碼子和大多數CBL ORF，用作CBL基因表達調節的對照。
雙鏈構建體將有義方向的CBL基因片段(#13-1159)插入載體pJG304-1中反義方向形式CBL基因下游的SalI位點。兩個拷貝的CBL之間有一個大約10bp的接頭。
實施例4植物表達盒構建的要求 準備在轉基因植物中表達的基因序列首先裝配在位于合適的啟動子之后和合適的轉錄終止子上游的表達盒中。植物表達盒構建的所有要求適用于本發明的DNA分子，并可用本領域公知的技術進行。
啟動子選擇 在表達盒中使用的啟動子的選擇決定轉基因植物中DNA分子的空間和時間表達模式。選擇的啟動子將在特定的細胞型(如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮細胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達DNA分子，這種選擇反映該DNA分子編碼的RNA片段生物合成的希望的位置。另外，所選的啟動子可引導DNA分子在光誘導型或其他時間調節啟動子之下的表達。另一個選擇是，選擇的啟動子是化學調節型的。這將提供僅當希望時和用化學誘導劑處理時才誘導DNA分子表達的可能性。
轉錄終止子 多種轉錄終止子均可在表達盒中使用。它們負責轉錄的終止，和優選地正確的聚腺苷酸化。合適的轉錄終止子是已知在植物中起作用的轉錄終止子，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子、豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉植物和雙子葉植物。
增強或調節表達的序列 已發現許多序列能增強轉錄單位內的基因表達，這些序列可與本發明的DNA分子結合使用以增強其在轉基因植物中的表達。
多種內含子序列顯示能增強表達，尤其在單子葉植物細胞中。例如，發現當被導入玉米細胞時，玉米Adh1基因的內含子顯著增強位于同源啟動子之下的野生型基因的表達。發現內含子1在與氯霉素乙酰轉移酶基因的融合構建體中特別有效且增強表達(Callis等人，基因發育(GenesDevelep)11183-1200(1987))。在同一實驗系統中，玉米bronze1基因的內含子具有類似的增強表達的作用(Callis等人，同上文)。內含子序列已被常規摻入植物轉化載體，一般在非翻譯前導區內。
已知來源于病毒的多種非翻譯前導序列也可增強表達，它們在雙子葉植物細胞中特別有效。具體而言，煙草花葉病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米萎黃病斑點病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的前導序列顯示在增強表達方面有效(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等人，植物分子生物學1565-79(1990))。
實施例5表達盒構建的實例 本發明包括本發明的DNA分子在可在植物中表達的任何啟動子調節下的表達，而不論該啟動子的來源如何。因此，用本領域公知的技術將DNA分子插入任何表達盒中。然后可將這些表達盒容易地轉移到以下所述的植物轉化載體中。
此外，本發明還包括任何可植物表達的啟動子與DNA分子表達所需或所選的其他任何序列的聯合使用。這些序列包括但不限于轉錄終止子、增強表達的外來序列(如內含子[如Adh內含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])。
組成型表達CaMV 35S啟動子 質粒pCGN1761的構建如公開專利申請EP 0 392 225所述。pCGN1761含有“雙”35S啟動子和tml轉錄終止子，在啟動子與終止子之間含有唯一的EcoRI位點，并且具有pUC型骨架。構建了pCGN1761的一種衍生物，它含有一個除已有的EcoRI位點外還包含NotI和XhoI位點的修飾過的多接頭。該衍生物被命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于其多接頭內cDNA序列或基因序列(包括微生物開放閱讀框序列)的克隆，其目的是在35S啟動子控制下在轉基因植物中表達。該結構的完整的35S啟動子-基因序列-tml終止子盒可切下啟動子5’側的HindIII、SphI、SalI和XbaI位點以及終止子3’側的XbaI、BamHI和BglI位點，向轉化載體轉移。此外，通過用HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI進行5′切割，并用任何多接頭限制位點(EcoRI、NotI或XhoI)進行3′切割，可切下雙35S啟動子片段，而替換為另一種啟動子。
因此，本發明的DNA分子插入pCGN1761ENX中，用于在CaMV 35S啟動子控制下組成型表達。
化學調節型啟動子下的表達 本章節描述了用所選的任何啟動子替換pCGN1761ENX中的雙35S啟動子；用實施例的形式描述了化學調節型PR-1a啟動子。選擇的啟動子優選地用限制酶從其來源切下，但另外也可用帶有合適的末端限制位點的引物進行PCR擴增。如果進行PCR擴增，則應在克隆靶載體中的擴增啟動子之后，對啟動子重新測序以檢查擴增錯誤。從質粒pCIB1004(見EP 0 332 104)上切下化學調節型煙草PR-1a啟動子，轉移至質粒pCGN1761ENX。用NcoI酶切pCIB1004，得到的線性片段的3′突出端通過T4DNA聚合酶處理成為平端。然后用HindIII酶切該片段，凝膠純化得到的包含PR-1a啟動子的片段，并克隆至已去除雙35S啟動子的pCGN1761ENX中。實現方法是用XhoI酶切，用T4聚合酶產生平端，隨后用HindIII酶切，并分離較大的其中克隆有pCIB1004啟動子片段的含載體-終止子片段。這產生一種pCGN1761ENX衍生物，其含有PR-1a啟動子和tml終止子以及一個具有唯一EcoRI和NotI位點的間插多接頭。
向該載體中插入本發明的DNA分子，隨后將融合產物(即啟動子-基因-終止子)轉移至選擇的任何轉化載體中，包括本申請所述的轉化載體，從而引起DNA分子的化學誘導型表達。
組成型表達肌動蛋白啟動子 已知肌動蛋白的幾個同種型可在大多數細胞型中表達，因此肌動蛋白啟動子是組成型啟動子的一種良好選擇。尤其是，稻Act1基因的啟動子已被克隆和表征(McElroy等人，植物細胞2163-171(1990))。發現該啟動子的1.3kb片段含有在水稻原生質體中表達所需的所有調節元件。此外，已構建了多種基于Act1啟動子的表達載體，特別用于單子葉植物(McElroy等人，分子普通遺傳學231150-160(1991))。其中摻入了Act1-內含子1、Adhl 5′側翼序列和(玉米乙醇脫氫酶基因的)Adh1-內含子1和CaMV 35S啟動子的序列。顯示最高表達的載體是35S和Act1內含子或Act1 5′側翼序列和Act1內含子的融合體。McElroy等人(分子普通遺傳學231150-160(1991))所述的啟動子表達盒易于為了本發明DNA分子的表達而修飾，且特別適于在單子葉植物宿主中使用。例如，可從McElroy構建體中切下含啟動子片段，用它來替換pCGN1761ENX中的雙35S啟動子，然后該載體可用于特定基因序列的插入。將這樣構建的融合基因轉移至合適的轉化載體。在個別報道中，也發現含有第一種內含子的水稻Act1啟動子可引導在培養的大麥細胞中的高表達(Chibbar等人，植物細胞報道(Plant Cell Rep.)12506-509(1993))。
將本發明的DNA分子插入該啟動子下游，隨后將融合產物(即啟動子-基因-終止子)轉移到選擇的任何轉化載體中，包括本申請書中所述的載體。
組成型表達遍在蛋白啟動子 遍在蛋白是已知可在多種細胞型中積累的另一種基因產物，其啟動子已從幾個種中克隆，用于轉基因植物(如向日葵-Binet等人，植物科學7987-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物學12619-632(1989))。已在轉基因單子葉系統中研究了玉米遍在蛋白，并且其序列和為單子葉植物轉化構建的載體公開于專利公開文本EP 0342 926中。另外，Taylor等人(植物細胞報道12491-495(1993))描述了一種載體(pAHC25)，其包含玉米遍在蛋白啟動子和第一種內含子，經微粒轟擊導入時在多種單子葉植物細胞懸液中具有高活性。遍在蛋白啟動子適于在轉基因植物尤其單子葉植物中表達本發明的DNA分子。合適的載體是通過導入適當遍在蛋白啟動子和/或內含子序列修飾的pAHC25衍生物或本申請所述的任何轉化載體。
因此將本發明的DNA分子插入這類啟動子中，融合產物(即啟動子-基因-終止子)用于植物轉化，引起DNA分子的組成型表達。
根特異的表達 本發明的DNA分子的一種優選表達模式是根表達。只在根組織中表達核苷酸序列具有只改變根中靶基因的表達而不同時改變葉和花組織及種子中的表達的優點。一種合適的根啟動子是由de Framond(FEBS290103-106(1991))并在公開的專利申請EP 0 452 269中描述的啟動子。該啟動子被轉移至合適的載體如pCGN1761ENX中，并向該載體中插入該DNA分子。隨后將完整的啟動子-基因-終止子盒轉移至目的轉化載體中。
創傷誘導型啟動子 已描述了許多這類啟動子(例如，Xu等人，植物分子生物學22573-588(1993)，Logemann等人，植物細胞1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學22783-792(1993)，Firek等人，植物分子生物學22129-142(1993)，Warner等人，植物雜志3191-201(1993))，且均都適用于本發明。Logemann等人(同上文)描述了雙子葉植物馬鈴薯wun1基因的5′上游序列。Xu等人(同上文)證明雙子葉植物馬鈴薯的創傷誘導型啟動子(pin2)在單子葉植物水稻中有活性。此外，Rohrmeier和Lehle(同上文)描述了玉米Wipl cDNA的克隆，其為創傷誘導型，并可用來使用標準技術分離同源啟動子。類似地，Firek等人(同上文)和Warner等人(同上文)描述了單子葉植物藥用蘆筍(Asparagus officinalis)的創傷誘導基因，它在局部創傷和病原體侵入部位表達。使用本領域公知的克隆技術，可將這些啟動子轉移至合適的載體中，與本發明的DNA分子融合，并用來在害蟲侵害部位表達這些基因。
木髓偏好的表達 專利申請WO 93/07278描述了玉米trpA基因的分離，該基因優先在木髓細胞中表達。利用標準分子生物學技術，可將該啟動子或其部分轉移至如pCGN1761的載體中，可替換35S啟動子，并用來以木髓偏好的方式引導本發明的DNA分子的表達。實際上，包含木髓偏好啟動子或其部分的片段可被轉移至任何載體中，并可為用于轉基因植物而修飾。DNA分子的木髓偏好的表達通過向該載體中插入DNA分子而實現。
花粉特異的表達 專利申請WO 93/07278另外描述了在花粉細胞中表達的玉米鈣依賴的蛋白激酶(CDPK)基因的分離。該基因序列和啟動子從轉錄起點延伸可達1400bp。利用標準分子生物學技術，可將該啟動子或其部分轉移至如pCGN1761的載體中，替換35S啟動子，并用來以花粉特異的方式引導本發明的DNA分子的表達。實際上，包含花粉特異的啟動子或其部分的片段可被轉移至任何載體中，并可為用于轉基因植物而修飾。
葉特異的表達 Hudspeth和Grula(植物分子生物學12579-589(1989))描述了一種編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。應用標準分子生物學技術，該基因的啟動子可用來以葉特異的方式引導本發明的DNA分子在轉基因植物中的表達。
實施例6植物轉化載體的構建 許多轉化載體可用于植物轉化，本發明的DNA分子可插入上述任何表達盒中，使其能在適當條件下在希望的細胞中表達該DNA分子。然后將含核苷酸序列的表達盒摻入以下所述的任一合適的轉化載體中。
所用載體的選擇取決于優選的轉化技術和將轉化的目標物種。對于某些目標物種，優選不同的抗生素或除草劑選擇標記。轉化中常規使用的選擇標記包括賦予卡那霉素和相關抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304184-187(1983))、賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究181062(1990)，Spencer等人，理論與應用遺傳學79625-631(1990))、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細胞生物學42929-2931)和賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))。
適于農桿菌轉化的載體 許多載體可用于應用根瘤農桿菌的轉化。它們一般具有至少一個T-DNA邊界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pVietorHINK(SEQ ID NO5)的載體。以下描述了兩種典型載體的構建。
pCIB200和pCIB2001的構建 二元載體pCIB200和pCIB2001用于構建農桿菌使用的重組載體，按以下方法構建。通過用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，細菌學雜志164446-455(1985))切下四環素抗性基因，隨后插入一個來自pUC4K的帶有NPTII的AccI片段(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等人，自然304184-187(1983)；McBride等人，植物分子生物學14266-276(1990))，產生pTJS75kan。使XhoI接頭與pCIB7的EcoRV片段連接，該片段包含左和右T-DNA邊界、植物選擇性nos/nptII嵌合基因和pUC多接頭(Rothstein等人，基因53153-161(1987))，并將XhoI消化片段克隆入SalI消化的pTJS75kan中產生pCIB200(參見EP 0 332 104)。pCIB200含有下列單一多接頭限制位點EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，它是通過向多接頭中插入其他限制位點而產生的。pCIB2001多接頭的單一限制位點是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除包含這些單一限制位點外，pCIB2001還有植物和細菌卡那霉素的選擇性、用于農桿菌介導的轉化的左和右T-DNA邊界、在大腸桿菌和其他宿主之間轉移的RK2衍生的trfA功能，以及也源自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適用于含有其自身調節信號的植物表達盒的克隆。
優選地使用多接頭，將含本發明的DNA分子的上述任一種植物表達盒插入pCIB2001中。
DCIB10及其潮霉素選擇衍生物的構建 二元載體pCIB10含有編碼植物中篩選所需卡那霉素抗性的基因、T-DNA右和左邊界序列，并且摻入寬宿主范圍的質粒pRK252的序列，使其在大腸桿菌和農桿菌中均可復制。其構建由Rothstein等人描述(基因53153-161(1987))。已構建了pCIB10的多種衍生物，其中摻入了Gritz等人(基因25179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸轉移酶基因。這些衍生物能使在僅有潮霉素(pCIB743)或同時有潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)時篩選轉基因植物細胞。該載體用來轉化含有本發明的DNA分子的表達盒。
適于非農桿菌轉化的載體 不使用根瘤農桿菌的轉化避免了對所選的轉化載體中T-DNA序列的需要，所以除如上所述包含T-DNA序列的載體外，還可使用缺少這些序列的載體。不依賴于農桿菌的轉化技術包括通過粒子轟擊、原生質體攝取(如PEG和電穿孔)、顯微注射的轉化或花粉轉化(美國專利5,629,183)。載體的選擇主要取決于待轉化種的優選。下面，描述了某些典型載體的構建。
pCIB3064的構建 pCIB3064是一種pUC衍生載體，適用于與除草劑basta(或膦絲菌素)篩選結合的直接基因轉移技術。質粒pCIB246包含與大腸桿菌GUS基因有效地融合的CaMV 35S啟動子和CaMV 35S轉錄終止子，在PCT公開申請WO 93/07278中有述。該載體的35S啟動子在起始位點5′端包含兩個ATG序列。用標準PCR技術突變這些位點以去除ATG，產生限制位點SspI和PvuII。新限制位點距唯一的SalI位點96bp和37bp，距實際起始位點101bp和42bp。產生的pCIB246的衍生物命名為pCIB3025。然后通過SalI和SacI消化從pCIB3025上切下GUS基因，使末端變為平端，并再連接，產生質粒pCIB3060。質粒pJIT82從John Innes Centre，Norwich獲得，切下含有產綠色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)bar基因的400bp的SmaI片段，將其插入pCIB3060的HpaI位點(Thompson等人，EMBO J.62519-2523(1987))。這產生了pCIB3064，其含有位于CaMV 35S啟動子和終止子控制下的用于除草劑篩選的bar基因、氨芐青霉素抗性基因(用于在大腸桿菌中篩選)和具有單一SphI、PstI、HindIII、BamHI位點的多接頭。該載體適用于含有自身調節信號的植物表達盒的克隆，用來引導本發明的DNA分子的表達。
pSOG19和pSOG35的構建 pSOG35是一種應用大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DHFR)作為選擇性標記提供氨甲喋呤抗性的轉化載體。用PCR擴增35S啟動子(～800bp)、玉米Adh1基因的內含子6(～550bp)和pSOG10的18bp的GUS非翻譯前導序列。也PCR擴增編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II型基因的250bp片段，將這兩個PCR片段與包含pUC19載體骨架和胭脂氨酸合酶終止子的pBI221(Clontech)SacI-PstI片段裝配。這些片段的裝配產生pSOG19，它含有與內含子6序列、GUS前導序列、DHFR基因和胭脂氨酸合酶終止子融合的35S啟動子。pSOG19中的GUS前導序列替換為玉米萎黃病斑點病毒(MCMV)的前導序列產生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶氨芐青霉素抗性的pUC基因，并且具有可用于克隆外源序列尤其是本發明的DNA分子的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位點。
實施例7葉綠體轉化 轉化載體 為了在植物質體中表達本發明的DNA分子，使用質體轉化載體pPH143(WO 97/32011，實施例36)。將DNA分子插入pPH143中，從而替換PROTOX編碼序列。該載體然后用于質體轉化和根據壯觀霉素抗性的轉化子篩選。另外，將DNA分子插入pPH143中，使其替換aadH基因。在這種情況中，根據對PROTOX抑制劑的抗性篩選轉化子。
葉綠體轉化 每板七個，按1″環形排列于T瓊脂培養基上，使煙草c.v.′Xanthi nc′的種子萌發，播種12-14天后，基本如所述(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)，用質粒pPH143和pPH145的DNA包被的1μm鎢顆粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轟擊。將轟擊的秧苗在T培養基上溫育兩天，之后切下葉子，遠軸側朝上置于亮光下(350-500μmol光子/m2/s)，置于含有500μg/ml壯觀霉素二鹽酸鹽(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培養基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)。轟擊三至八周后在漂白葉下出現的抗性苗被亞克隆至相同的選擇培養基上，使之形成愈傷組織，分離并亞克隆第二批苗。用Southern印跡標準技術(Sambrook等人(1989)《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，冷泉港)評價獨立亞克隆中轉化的質體基因組拷貝的完全分離(同質體狀態)。BamHI/EcoRI消化的總細胞DNA(MettIer，I.J.(1987)植物分子生物學報道5，346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠上分離，轉移至尼龍膜上(Amersham)，用32P-標記的隨機引物DNA序列探查，該序列對應于pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，包含一部分rps7/12質體導向序列。同質的苗在含壯觀霉素的MS/IBA培養基(McBride，K.E.等人(1994)PNAS 91，7301-7305)上無菌生根，將其轉移到溫室中。
實施例8由RolC啟動子引導的、編碼BWYV外殼蛋白的有義和反義(雙鏈)RNA片段的嵌合基因盒的構建 使用引物HiNK025bis(5’-CAA TTA CCA TGG ACA CGG TCGTGG-3’，SEQ ID NO6；NcoI限制位點以下劃線標出)和HiNK226(5’-GCC AAA TGT TTG AAC GCT GCA GCC TAT TTG-3’；SEQ IDNO7；PstI限制位點以下劃線標出)，從質粒pZU046中擴增甜菜西方黃化病毒(BWYV)的0.6kb“有義”方向片段，一種所謂的病毒黃化外殼蛋白(CP)基因。此外，使用引物HiNK025bis2(5’-AAT CGT CCATGG ATA CGG TCG TGG-3’，SEQ ID NO8；核苷酸3475-3498，NcoI限制位點以下劃線標出)和HiNK226bis(5’-CTA GGG CCG GGT TCCTCT GCA GCC TAT TTG-3’；SEQ ID NO9；核苷酸4114-4085，PstI限制位點以下劃線標出)，從質粒pBW17(Veidt等人，核酸研究169917-9932，1988；保藏號X13063)中擴增該片段。按照使用說明在50μl反應體積中使用Taq DNA聚合酶(Life Technologies)，94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/90秒的30個循環(+2秒/循環)。通過由Seakem GTG瓊脂糖(FMC)制備的1％ Tris-乙酸鹽凝膠電泳，隨后用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)抽提含有PCR產物的凝膠片，純化得到的DNA片段。隨后按照標準方法，用NcoI和PstI消化PCR產物(所有限制酶均從Life Technologies獲得)，并再次凝膠純化。用T4 DNA連接酶(Life Technologies)將純化的片段連接到RolC啟動子和Nos終止子之間。得到的克隆命名為pHiNK138。
以與上所述類似的方法，使用引物HiNK251(5’-CTC CCA GGTTGA GAC TGC CCT GCA GTG CCC A-3’，SEQ ID NO10；PstI限制位點以下劃線標出)和HiNK228(5’-TTA CCA TGC ATA CGG TCGTGG GTA-3’；SEQ ID NO11；NsiI限制位點以下劃線標出)，從質粒Pzu174A中，或使用引物HiNK251(核苷酸4844-4814)和HiNK228bis(5’-CGT TAA TGC ATA CGG TCG TGG GTA-3’；SEQ ID NO12；核苷酸3478-3503，NsiI限制位點以下劃線標出)，從質粒pBW17中，擴增1.4kb“反義”方向BWYV CP片段。待凝膠純化后，用NsiI和PstI消化PCR產物。4.9kb質粒pHiNK138用PstI線性化，并用熱敏感的堿性磷酸酶(Life Technologies)去磷酸化。凝膠純化這兩種載體和PCR片段，隨后雙向連接PCR片段與pHiNK138。通過限制位點分析確定產生CP基因(SEQ ID NO13)雙鏈RNA的方向，產生質粒pHiNK152，其中反向重復由0.6kb CP基因組成，該基因被CP基因下游的來源于BWYV基因組的0.7kb間隔序列分開，稱為ORF6。該間隔序列為反向方向。最后，將所述基因盒轉移到攜帶磷酸甘露糖異構酶作為選擇標記基因的專利二元載體pVictorHiNK(WO 94/20627)中，產生pHiNK179。
實施例9.1由擬南芥Ubi3int啟動子引導的，編碼BNYVV復制酶基因的有義和反義(雙鏈)RNA片段的嵌合基因盒的構建 用QIAGEN的RNAeasy Plant mini試劑盒從甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)感染的甜菜根中提取總RNA。為了擴增BNYVV復制酶基因的3’端(RNA1)，用SuperscriptTM II RNAse H-反轉錄酶(RT)(LifeTechnologies)和反向引物HiNK285(5’-TCG TAG AAG AGA ATT CACCCA AAC TAT CC-3’，SEQ ID NO14)反轉錄RNA，產生cDNA。引物HiNK285位于BNYVV RNA1序列(保藏號D00115)的核苷酸6378與6405之間，用來導入一個EcoRI位點。隨后用RT反應作為模板用于兩次PCR反應 -反應A使用位于BNYVV RNA1核苷酸5168bp與5178bp之間，用來引入一個BamHI位點的引物HiNK283(5’-AAG AAT TGCAGG ATC CAC AGG CTC GGT AC-3’，SEQ ID NO15)，和位于BNYVV RNA1核苷酸5597bp與5620之間，用來引入一個EcoRI位點的引物HiNK284(5’-TTC CAA CGA ATT CGG TCTCAG ACA-3’，SEQ ID NO16)。
-反應B使用引物HiNK283與引物HiNK285，均如上所述。這樣獲得的RT-PCR產物在組成將來的RNA雙鏈體的核苷酸5168-5620之間具有BNYVV RNA1序列。未來的間隔序列對應于用引物HiNK283和HiNK285獲得的RT-PCR產物中存在的BNYVV RNA1的核苷酸5621-6405bp。
按照使用說明在25μl反應體積中使用Taq DNA聚合酶(LifeTechnologies)，94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/90秒的30個循環(+2秒/循環)。通過由Seakem GTG瓊脂糖(FMC)制備的1％ Tris-乙酸鹽凝膠電泳，隨后用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)抽提含有PCR產物的凝膠片，純化得到的DNA片段。待凝膠純化后，按照標準方法用限制酶BamHI和EcoRI(Life Technologies)消化RT-PCR產物，并如上所述純化。
最后，使用T4DNA連接酶(Life Technologies)，利用三路連接反應，將RT-PCR產物克隆到擬南芥遍在蛋白3(Ubi3int)啟動子與Nos終止子之間。得到的兩個克隆被命名為pHiNK181(反義方向的間隔區，見SEQ ID NO17)和pHiNK184(有義方向的間隔區，見SEQ IDNO18)。
為了構建用于農桿菌介導的甜菜轉化的二元載體，用AscI和PacI(New England Biolabs)消化含有磷酸甘露糖異構酶基因作為選擇性標記(WO 94/20627)的二元載體pVictorHiNK以及質粒pHiNK181和pHiNK184的DNA，載體和插入片段如上所述通過電泳純化。用T4DNA連接酶(Life Technologies)將得到的7.7kb pVictorHiNK載體片段與編碼BNYVV復制酶基因雙鏈RNA的基因盒連接，分別產生pHiNK187(反義間隔區)和pHiNK188(有義間隔區)。
實施例9.2農桿菌介導的甜菜轉化 農桿菌介導轉化植物物種的方法已經建立，并為本領域技術人員所公知，并可因外植體類型、農桿菌株或選擇性標記和使用的再生系統而不同。以下的方法敘述了利用子葉作為外植體來源，用甘露糖-6-磷酸異構酶作為選擇性標記基因對甜菜的農桿菌介導的轉化(Joersbo等人，分子栽培(Molecular Breeding)4111-117，1998)。表面消毒后，甜菜籽在水瓊脂上并在約12℃下在微光下萌芽。橫向切割結節區以下，從幼苗中切下完全發育的子葉，并通過輕輕拉開切割切下子葉。通過將子葉外植體浸于含有適當轉化載體的農桿菌株EHA101的懸液中接種子葉外植體，該懸液用補充有20g/l蔗糖、0.25mg/l BA、0.05mg/l NAA、500μM乙酰丁香酮的MS培養基pH5.2稀釋，將光密度(OD600)由0.1稀釋為0.3。經5分鐘的溫育后，從農桿菌懸液中取出外植體，在無菌濾紙上蘸一下，除去過量的接種懸液，轉移到共培育平板中。共培育平板包括含有1/10MS培養基ph5.7、30g/l蔗糖、200μM乙酰丁香酮的平皿，用4.7g/l瓊脂糖固化，并在固化培養基頂部覆蓋用1.5ml TXD培養基(補充有PGO維生素、0.005mg/l細胞分裂素、4mg/l CPA(對氯苯氧乙酸)、30g/l蔗糖的MS鹽，pH5.7)濕潤的濾紙。在21℃和弱光下共培育外植體4天，隨后轉移到選擇性再生培養基中，該培養基由pH5.9的MS培養基組成，其中補充有20g/l蔗糖、1.25g/l甘露糖、0.25mg/l BA、0.05mg/lNAA、500mg/l羧芐青霉素，并用9g/l瓊脂固化。每到第三周將外植體亞培養到含有逐漸提高的濃度、最大可達15g/l的甘露糖的新鮮培養基中。篩選并在21℃下再生12周后，收獲再生的幼苗，生根，基本按照Feramisco和同事(Feramisco等人，生物化學與生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)55636-641，1973)所述的偶聯酶測定法分析PMI活性。陽性植物埋于土壤中，最后轉移到溫室中。
實施例9.3rhizomania抗性的篩選 在播種并埋入土壤中后，首先用幼苗或T0轉化子建立完全發育的根系統約4周，之后轉移到遭攜帶BNYVV的Polymyxa betae侵襲的土壤中。從德國rhizomania感染的田間收集遭侵襲的土壤。在抗性測定中，植物在12cm區域中在約21℃和16小時的光照期中生長。轉移到遭侵襲土壤中4周后，從土壤中拔出植物，通過用水漂洗去除根系統底部附著的任何泥土。利用Pollahne壓力收集0.5g根組織的隨機樣品的汁液，加到10ml抽提緩沖液中，該緩沖液包含補充有2％PVP和0.2％卵白蛋白的磷酸緩沖液，pH7.2。基本按照使用說明書，利用英國蘇格蘭Adgen Ltd商品化的BNYVV三抗體夾心(TAS)ELISA測定樣品(通過體外繁殖獲得的克隆)中存在的病毒量。對每種植物制作標準曲線，由測量的吸光度值計算根系統的病毒含量。未轉化的敏感性甜菜植物用作陰性對照，攜帶自然rhizomania抗性的C28基因的植物用作陽性對照。表1總結了用質粒pNIHK188獲得的轉化事件的結果。
表1 實施例10甜瓜中胡瓜黃化花葉馬鈴薯Y病毒(ZYMV)和木瓜環斑馬鈴薯Y病毒(PRSV)抗性的植物轉化載體的構建 NOS終止子(Bevan，M.等人，1983核酸研究11(2)，369-385)作為260bp HindIII/PstI片段克隆到HindIII/PstI消化的質粒pZO1560中。pZO1560是一種pUC衍生的質粒，其中多克隆位點已被替換為更通用的位點。在插入NOS終止子后獲得的新構建體被命名為pZU533。
通過BamHI消化，隨后T4 DNA聚合酶處理和KpnI消化，分離1728bp Ubi3啟動子/內含子片段(Callis，J.等人，(1995遺傳學139(2)，921-939))。將該片段克隆到SmaI消化的pZU533中。新構建體被命名為pZU615。
首先用Pfx DNA聚合酶PCR擴增將插入pZU615中的其他DNA片段，并將獲得的PCR片段克隆到pBluescript SK+中。為了擴增513bpActin2 IntronL(前導內含子)片段，根據An等人，植物雜志，10107-121，1996的序列設計兩條引物。5’引物(ZUP15635’-GGGCGGATCCGCTAGCCCGCGGCCGCTCTTTCTTTCCAAGG-3’，SEQ ID NO19)直接在5’剪切位點下游退火，并向將擴增的Actin2IntronL片段5’端添加一個BamHI、一個NheI和一個SacII限制位點。3’引物(ZUP15645’-CCCGCCATGGGTCGACGCCATTTTTTATGAGCTGC-3’，EQ ID NO20)直接在3’剪切位點下游退火，并向將擴增的Actin2 IntronL片段3’端添加一個SalI和一個NcoI限制位點。將用ZUP1563和ZUP1564擴增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位點中。新質粒被命名為pZU611。為了提供含Act2 IntronL的質粒pZU615，從pZU611中分離499bp BamHI/NcoI Act2 IntronL片段，并克隆到BamHI和NcoI消化的pZU615中Ubi3啟動子/內含子的下游，和NOS終止子的上游。新構建體被命名為pZU616。該片段的插入同時為下三個克隆步驟提供了含有5個另外限制位點的盒。
為了擴增非翻譯(nt)739bp PRSV CP片段(Shyi-Dong，Y.等人，(1992)普通病毒學雜志73，2531-2541)，根據Shyi-Dong Yeh的法國田間分離株的序列設計兩條引物。5’引物(ZUP15655’-CCCGCCATGGGAGCCGATGATTTCTACCGAGAATTAAGGG-3’，SEQ ID NO21)在PRSV CP起始密碼子285bp下游退火，并向非翻譯PRSV CP片段的5’端添加一個NcoI和一個BamHI限制位點。3’引物(ZUP15665’-GGGCGCTAGCCTAATGCTTATATAGTACC-3’，EQID NO22)在PRSV CP終止密碼子55bp下游退火，并向非翻譯PRSVCP片段添加一個NheI限制位點。將擴增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位點中。新質粒被命名為pZU612。
為了擴增735bp非翻譯ZYMV CP片段(Gal-On，A.等人，(1990)基因87，273-277)，根據Gal-On，A.的法國田間分離株的序列設計兩條引物。5’引物(ZUP15675’-GGGCGCTAGCCTTGCTGGAGTATAAGCCGG-3’，SEQ ID NO23)在ZYMV CP起始密碼子253bp下游退火，在ZYMV CP非翻譯片段的5’端含有一個NheI限制位點。3’引物(ZUP15685’-GGGCGTCGACCGCGGGCTTTAAAGGTGGGAGGCCC-3’，EQ ID NO24)在ZYMV CP終止密碼子89bp下游退火，在非翻譯ZYMV CP片段3’端含有一個SacII和SalI限制位點。將擴增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位點中。新質粒被命名為pZU613。隨后將ZYMV CP非翻譯片段克隆到pZU616中Ubi3啟動子/內含子下游和Act2 IntronL上游。為此，從pZU613中分離719bpNheI/SacII ZYMV CP非翻譯片段，并克隆到pZU616的NheI和SacII位點。該構建體被命名為pZU617。隨后將PRSV CP非翻譯片段克隆到pZU617中Ubi3啟動子/內含子下游和ZYMV CP非翻譯片段上游。為此，從pZU612中分離720bp BamHI/NheI PRSV CP非翻譯片段，并克隆到pZU617的BamHI和NheI位點。該新構建體被命名為pZU618。
將克隆完成基因盒的最終片段含有PRSV CP非翻譯片段，在其下游以相同方向含有一個ZYMV CP非翻譯片段。用Pfx PCR和引物ZUP1565和ZUP1568，由pZU618作為模板擴增相應的片段。將PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位點中，得到的質粒被命名為pZU619。
為了產生反向重復基因盒，將PRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段以與pZU618質粒中已經存在的PRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段相反的方向插入pZU618中。為此，從pZU619中分離1445bp SalI/NcoIPRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段，并克隆到SalI和NcoI消化的pZU618中Act2 IntronL下游和NOS終止子上游。得到的質粒被命名為pZU622。將該盒插入二元載體pZU547中，它是一種來源于另外含有SMAS啟動子/PMI/NOS終止子選擇盒的質粒pVictorHink二元載體。為此，從pZU622中分離含有反向重復基因盒的5414bp AscI/PacIDNA片段，并以串聯方向克隆到pZU547的AscI和PacI位點，和選擇盒上游。終構建體被命名為pZU623(SEQ ID NO25)。
實施例11在番茄中馬鈴薯Y病毒(PVY)抗性的植物轉化載體的構建 根據R.A.A.van der Vlugt(1993)的論文“對馬鈴薯Y病毒的工程抗性”中公開的PVYn(PVY的一種法國田間分離株)的序列，利用兩條引物(ZUP15985’-CATGCCATGGATCCAATGGCCACGAATTAAAGCTATCACGTC-3’，SEQ ID NO26，和ZUP15905’-ACGCGTCGACCGCGGATTCAAACGATTATTAATTACGATAAAAG-3’，SEQ IDNO27)，使用來自Life Technologies的Platinum Pfx DNA聚合酶，通過標準PCR技術擴增含有外殼蛋白順反子序列和3’端非翻譯區的99個核苷酸的804bp片段。擴增的PCR片段作為平端片段克隆到pBluescriptSK+的EcoRV位點中，該質粒被命名為pZUA。擴增的PVY特異插入片段作為BamHI/SacI片段切下，克隆到pZU616(參見實施例10)的BamHI/SacI位點中，產生pZUB。pZUB和pZUA都用NcoI和SalI消化。來自pZUA的PVY特異性片段從瓊脂糖凝膠中純化，并與NcoI和SalI消化的pZUB連接，產生含有下列元件的pZUC 含內含子的UBI3啟動子之后是有義方向的PVY PCR產物作為BamHI/SacI片段，之后是SacII/SalI ACT2內含子，之后是反義方向的PVY PCR產物作為SalI/NcoI片段，最后是nos終止子作為NcoI/HindIII片段。最后，將pZUC克隆到含有來自pHiNK085二元載體的SMAS啟動子/PMI/NOS終止子選擇盒的二元載體pZU547中。最終的構建體被命名為pZU634(SEQ ID NO28)。
實施例12二元載體對甜瓜和番茄植物材料的轉化 向植物材料轉移二元載體的方法已經建立，并為本領域技術人員所公知。該方法的變化是由于，例如，所使用的農桿菌株的差異，外植體材料的不同來源，再生系統的不同，以及欲轉化的植物種的不同栽培品種。按照下列方法在轉化實驗中使用以上實施例10和11中所述的二元植物轉化載體。通過電穿孔將二元載體轉移到根瘤農桿菌中，隨后用轉化的農桿菌株接種并與植物外植體材料共培育，用合適的抗生素選擇性殺傷農桿菌株，通過在含甘露糖的選擇性培養基上生長篩選轉化的細胞，向誘導萌發培養基中轉移組織，向誘發生根培養基中轉移選擇的幼芽，并向土壤中轉移小植物。為了證實以上實施例10和11中所述的基因盒的存在，用眾所周知的Sourthern印跡分析技術表征來源于轉基因植物的總DNA。
實施例13為ZYMV和PRSV抗性篩選轉基因甜瓜植物 轉化的植物在標準檢疫條件下在溫室中生長，以防止病原體的任何感染。初級轉化子自體受粉，并收獲種子。
分析初級轉化子的S1后代的100株植物，分析插入基因的分離和隨后通過機械接種感染ZYMV。系統感染ZYMV的宿主植物的組織在5倍體積的冰預冷的接種緩沖液(10mM磷酸緩沖液)中研磨，并在碳化硅粉存在下在1周齡幼苗的子葉和第一只葉子上摩擦。在接種后3周內監視接種的植物的癥狀發展。與未轉化的對照植物相比——它們在接種7天后顯示嚴重的系統ZYMV癥狀，含有ZYMV序列的植物顯示對ZYMV感染的敏感性降低。ZYMV耐受植物自體受粉，并收獲種子。按照上述方法用PRSV機械接種轉基因ZYMV抗性植物。與未轉化的對照植物相比——它們在接種7天后顯示嚴重的系統PRSV癥狀，已有ZYMV抗性的植物也顯示對PRSV感染的敏感性降低。
實施例14為PVY抗性對轉基因番茄植物的篩選 轉化的植物在標準檢疫條件下在溫室中生長，以防止病原體的任何感染。初級轉化子自體受粉，并收獲種子。
分析初級轉化子的S1后代的50株植物，分析插入基因的分離和隨后通過機械接種感染PVY。系統感染PVY的宿主植物的組織在5倍體積的冰預冷的接種緩沖液(10mM磷酸緩沖液)中研磨，并在碳化硅粉存在下在5周齡幼苗的前兩個完全展開的葉子上摩擦。在接種后3周內監視接種的植物的癥狀發展。與未轉化的對照植物相比——它們在接種7天后顯示嚴重的系統PVY癥狀，含有PVY序列的植物顯示對PVY感染的敏感性降低。
以上公開的實施方案是說明性的。本發明的公開內容將使本領域技術人員了解本發明的許多變化。所有這些明顯且可預知的變化均為附加權利要求所包括。
本發明的優選實施方案如下 1.一種改變病毒基因組的表達的方法，包括向一種細胞中導入能在該細胞中表達該病毒基因組的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該病毒基因組的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA。
2.項目1的方法，其能使該細胞具有病毒抗性或耐受性。
3.項目1的方法，其中該細胞是一種植物細胞。
4.項目1的方法，其中所述病毒選自蕃茄斑萎病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、黃癥病毒、黃瓜花葉病毒、雀麥花葉病毒、長線病毒、番茄叢矮病毒和真菌傳棒狀病毒。
5.項目1的方法，其中所述DNA序列含有一種來源于病毒外殼蛋白基因、病毒核殼蛋白基因、病毒復制酶基因或病毒運動蛋白基因的核苷酸序列。
6.項目1的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列穩定整合于所述細胞的基因組中。
7.項目1的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于兩種不同的DNA分子中。
8.項目1的方法，其中將第一種和第二種DNA序列的至少兩對導入細胞中。
9.項目8的方法，其中每一對DNA序列編碼不同病毒種或分離株的有義和反義RNA片段。
10.項目1的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于一種DNA分子中。
11.項目10的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于該DNA分子的同一DNA鏈中。
12.項目11的方法，其中有義RNA片段和反義RNA片段包含于一種RNA分子中。
13.項目12的方法，其中所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA片段形成雙鏈區。
14.項目1的方法，其中表達的RNA分子包含SEQ ID NO13、SEQID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO25或SEQ ID NO28的反向重復序列。
15.項目24的方法，其中所述RNA分子的表達由異源的啟動子、組織特異性啟動子、發育調節型啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子驅動。
16.項目15的方法，其中所述DNA分子的表達由一種遍在蛋白啟動子如擬南芥Ubi3啟動子驅動。
17.項目15的方法，其中所述DNA分子的表達由農桿菌rolC啟動子驅動。
18.項目12的方法，其中所述DNA分子在編碼有義RNA片段和反義RNA片段的DNA序列之間含有一個接頭。
19.項目18的方法，其中所述接頭由擬南芥肌動蛋白2基因的前導內含子的核苷酸序列確定。
20.項目18的方法，其中所述接頭由側翼為有義或反義RNA片段的病毒區的核苷酸序列確定。
21.項目18的方法，其中所述接頭包含功能基因如選擇性標記基因的表達盒。
22.項目21的方法，其中所述接頭包含調節序列如內含子加工信號。
23.項目11的方法，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段包含于兩種不同的RNA分子中。
24.項目23的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列與一種雙向啟動子有效連接。
25.項目11的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于所述DNA分子的互補鏈中。
26.項目25的方法，其中在所述DNA分子中，第一種DNA序列是第二種DNA序列的互補DNA鏈。
27.一種可改變病毒基因組的表達的DNA構建體，其包含能在一種細胞中表達該病毒基因組的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該病毒基因組的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子。
28.項目27的DNA構建體，其中該DNA構建體含有與所述第一種DNA序列有效連接的第一種啟動子，和與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動子。
29.項目27的DNA構建體，其中該DNA構建體含有與第一種DNA序列和第二種DNA序列有效連接的雙向啟動子。
30.一種顯示改變的病毒基因組表達的細胞，其包含能在該細胞中表達該病毒基因組的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該病毒基因組的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA。
31.一種顯示改變的病毒基因組表達的植物及由其產生的后代，其含有能在該細胞中表達該病毒基因組的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細胞中表達該病毒基因組的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA。
32.項目31的植物，其中該植物是病毒抗性或耐受的。
33.由項目31的植物產生的種子。
<110>Novartis AG
<120>病毒基因表達的調節
<130>S-30959A
<140>
<141>
<150>US 09/309038
<151>1999-05-10
<160>28
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ds_Luc1
<400>1
cgcggatcct ggaagacgcc aaaaaca27
<210>2
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ds_Luc2
<400>2
cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg38
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ds_Luc3
<400>3
cggtctagag gaagacgcca aaaacata 28
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述JG-L
<400>4
gtacctcgag tctagactcg ag 22
<210>5
<211>4732
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pvictorHINK
<400>5
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 60
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 120
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 180
tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 240
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcae 300
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 360
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 420
aaggatcttc acctagatcc ttttgatccg gaattaattc ctgtggttgg catgcacata 480
caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa 540
cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact 600
gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc 660
ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgctgca 720
ggaattggcc gcagcggcca tttaaatcaa ttgggcgcgc cgaattcgag ctcggtaccc 780
ggggatcctc tagagtcgac catggtgatc actgcaggca tgcaagcttc gtacgttaat 840
taattcgaat ccggagcggc cgcacgcgtg ggcccgttta aacctcgaga gatctgctag 900
ccctgcagga aatttaccgg tgcccgggcg gccagcatgg ccgtatccgc aatgtgttat 960
taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac 1020
agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagaat 1080
taattctcat gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca 1140
ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt 1200
cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg 1260
gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt 1320
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcggtg atcgccgaag 1380
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 1440
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 1500
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 1560
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 1620
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 1680
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 1740
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 1800
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 1860
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 1920
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 1980
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 2040
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 2100
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataaagctct agtggatccc 2160
cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg 2220
gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg 2280
cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc 2340
ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac 2400
cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg 2460
acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg 2520
agcttccaga cgggcacgta gaggtttcag cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg 2580
attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg 2640
aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt 2700
tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt 2760
taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga 2820
cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc 2880
ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca 2940
agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc 3000
gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca 3060
agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc 3120
gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg 3180
ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt 3240
cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag 3300
gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga 3360
acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg 3420
atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc 3480
ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa 3540
aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg 3600
cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac 3660
aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gctgaggtct gcctcgtgaa gaaggtgttg 3720
ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca gaaagtgagg gagccacggt 3780
tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt gaacttttgc tttgccacgg 3840
aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt caactcagca aaagttcgat 3900
ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg ctctgccagt gttacaacca 3960
attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat 4020
atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc 4080
accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc 4140
aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc 4200
accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc tctgcattaa tgaatcggcc 4260
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 4320
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 4380
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 4440
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 4500
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 4560
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4620
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac 4680
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gt 4732
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK025bis
<400>6
caattaccat ggacacggtc gtgg24
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK226
<400>7
gccaaatgtt tgaacgctgc agcctatttg 30
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK025bis2
<400>8
aatcgtccat ggatacggtc gtgg24
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK226bis
<400>9
ctagggccgg gttcctctgc agcctatttg 30
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK251
<400>10
ctcccaggtt gagactgccc tgcagtgccc a31
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK228
<400>11
ttaccatgca tacggtcgtg ggtagg26
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK228bis
<400>12
cgttaatgca tacggtcgtg ggtagg26
<210>13
<211>3338
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述BWYV duplex
RNA gene
<220>
<221>啟動子
<222>(1)..(1131)
<223>RolC啟動子
<220>
<221>重復單元
<222>(1132)..(1737)
<223>BWYV CP反向重復片段
<220>
<221>莖-環
<222>(1738)..(2470)
<223>BWYV CP基因下游0.7kb間隔基片段
<220>
<221>重復單元
<222>(2471)..(3074)
<223>BWYV CP反向重復片段
<220>
<221>終止子
<222>(3076)..(3338)
<223>NOS終止子
<400>13
ggatccggcg tcggaaactg gcgccaatca gacacagtct ctggtcggga aagccagagg 60
tagtttggca acaatcacat caagatcgat gcgcaagaca cgggaggcct taaaatctgg 120
atcaagcgaa aatactgcat gcgtgatcgt tcatgggttc atagtactgg gtttgctttt 180
tcttgtcgtg ttgtttggcc ttagcgaaag gatgtcaaaa aaggatgccc ataattggga 240
ggagtggggt aaagcttaaa gttggcccgc tattggattt cgcgaaagcg cattggcaaa 300
cgtgaagatt gctgcattca agatactttt tctattttct ggttaagatg taaagtattg 360
ccacaatcat attaattact aacattgtat atgtaatata gtgcggaaat tatctatgcc 420
aaaatgatgt attaataata gcaataataa tatgtgttaa tctttttcaa tcgggaatac 480
gtttaagcga ttatcgtgtt gaataaatta ttccaaaagg aaatacatgg ttttggagaa 540
cctgctatag atatatgcca aatttacact agtttagtgg gtgcaaaact attatctctg 600
tttctgagtt taataaaaaa taaataagca gggcgaatag cagttagcct aagaaggaat 660
ggtggccatg tacgtgcttt taagagaccc tataataaat tgccagctgt gttgctttgg 720
tgccgacagg cctaacgtgg ggtttagctt gacaaagtag cgcctttccg cagcataaat 780
aaaggtaggc gggtgcgtcc cattattaaa ggaaaaagca aaagctgaga ttccatagac 840
cacaaaccac cattattgga ggacagaacc tattccctca cgtgggtcgc tgagctttaa 900
acctaataag taaaaacaat taaaagcagg caggtgtccc ttctatattc gcacaacgag 960
gcgacgtgga gcatcgacag ccgcatccat taattaataa atttgtggac ctatacctaa 1020
ctcaaatatt tttattattt gctccaatac gctaagagct ctggattata aatagtttgg 1080
atgcttcgag ttatgggtac aagcaacctg tttcctactt tgttaccatg gacacggtcg 1140
tgggtaggag aattatcaat ggaagaagac gaccacgcag gcaaacacga cgcgctcagc 1200
gccctcagcc agtggttgtg gtccaaacct ctcgggcaac acaacgccga cctagacgac 1260
gacgaagagg taacaaccgg acaggaagaa ctgttcctac cagaggagca ggttcgagcg 1320
agacatttgt tttctcaaaa gacaatctcg cgggaagttc cagcggagca atcacgttcg 1380
ggccgagtct atcagactgc ccggcattct ctaatggaat gctcaaggcc taccatgagt 1440
ataaaatctc aatggtcatt ttggagttcg tctccgaagc ctcttcccaa aattccggtt 1500
ccatcgctta cgagctggac ccacactgta aactcaactc cctttcctca actatcaaca 1560
agttcgggat cacaaagccc gggaaaaggg cgtttacagc gtcttacatc aacggaacgg 1620
aatggcacga cgttgccgag gaccaattca ggatcctcta caaaggcaat ggttcttcat 1680
cgatagctgg ttctttcaga atcaccatta agtgtcaatt ccacaacccc aaataggctg 1740
cagtgcccaa ctctctttgg tctttctgtc tttacggaac cggatgagcc ttgttcatca 1800
agtgctatgg cgatcatccc tatctccatc atccgatctg tccaggctcc gtacgaaacg 1860
gcgtaattat atttagattg cttctggaca gcgggtccaa caacaaagaa ggaggcattg 1920
tcaccagtcg tcttgatatg acaagtcaaa tctccatctc tttccagaca ctgtccttga 1980
ttgaaatgac agccattgag ttccatgtct gggtggccat acttcaaagt attatcggcc 2040
ttgttgttgg ttatctccac attattgtaa atccccacgt tccaaccttc actaagatca 2100
tcgttgtagg cgatgagacc atcttgtttg tccttgttag gatctgtggt gcttgaggtt 2160
ggttgatacc cctccatcga tatttccacg gtccactcac cttgagggac tggcactatt 2220
atcatcggga tggctttcaa agaattctgg gaataccatc gagaatcgag gttcgtccag 2280
ttcatgttct cgtcctctat gtagcgaaac cgttgggacg gcatatcata caaagagatg 2340
gcatcatccg tagattgagc cattatacga gtcacgggga ctccagtata gacgataaaa 2400
cgatatttct tttggggtgt gggttgtgga gagggagaag gccctgggct agggccgggt 2460
tcctcgtcta cctatttggg gttgtggaat tgacacttaa tggtgattct gaaagaacca 2520
gctatcgatg aagaaccatt gcctttgtag aggatcctga attggtcctc ggcaacgtcg 2580
tgccattccg ttccgttgat gtaagacgct gtaaacgccc ttttcccggg ctttgtgatc 2640
ccgaacttgt tgatagttga ggaaagggag ttgagtttac agtgtgggtc cagctcgtaa 2700
gcgatggaac cggaattttg ggaagaggct tcggagacga actccaaaat gaccattgag 2760
attttatact catggtaggc cttgagcatt ccattagaga atgccgggca gtctgataga 2820
ctcggcccga acgtgattgc tccgctggaa cttcccgcga gattgtcttt tgagaaaaca 2880
aatgtctcgc tcgaacctgc tcctctggta ggaacagttc ttcctgtccg gttgttacct 2940
cttcgtcgtc gtctaggtcg gcgttgtgtt gcccgagagg tttggaccac aaccactggc 3000
tgagggcgct gagcgcgtcg tgtttgcctg cgtggtcgtc ttcttccatt gataattctc 3060
ctacccacga ccgtatgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 3120
tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 3180
aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 3240
gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaacct aggataaatt 3300
atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctctaga 3338
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK285
<400>14
tcgtagaaga gaattcaccc aaactatcc29
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK283
<400>15
aagaattgca ggatccacag gctcggtac29
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK284
<400>16
ttccaacgaa ttcggtctca gaca 24
<210>17
<211>3648
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pHiNK181
<220>
<221>啟動子
<222>(1)..(1738)
<223>遍在蛋白3啟動子加內含子
<220>
<221>重復單元
<222>(1739)..(2166)
<223>BNYVV RNA1重復片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(2167)..(2946)
<223>間隔基片段
<220>
<221>重復單元
<222>(2947)..(3375)
<223>BNYVV RNA1重復片段
<220>
<221>莖-環
<222>(1739)..(3375)
<223>由間隔基分隔的BNYVV RNA1片段的反向重復
<220>
<221>終止子
<222>(3376)..(3648)
<223>NOS終止子
<400>17
ggtaccggat ttggagccaa gtctcataaa cgccattgtg gaagaaagtc ttgagttggt 60
ggtaatgtaa cagagtagta agaacagaga agagagagag tgtgagatac atgaattgtc 120
gggcaacaaa aatcctgaac atcttatttt agcaaagaga aagagttccg agtctgtagc 180
agaagagtga ggagaaattt aagctcttgg acttgtgaat tgttccgcct cttgaatact 240
tcttcaatcc tcatatattc ttcttctatg ttacctgaaa accggcattt aatctcgcgg 300
gtttattccg gttcaacatt ttttttgttt tgagttatta tctgggctta ataacgcagg 360
cctgaaataa attcaaggcc caactgtttt tttttttaag aagttgctgt taaaaaaaaa 420
aaaagggaat taacaacaac aacaaaaaaa gataaagaaa ataataacaa ttactttaat 480
tgtagactaa aaaaacatag attttatcat gaaaaaaaga gaaaagaaat aaaaacttgg 540
atcaaaaaaa aaaacataca gatcttctaa ttattaactt ttcttaaaaa ttaggtcctt 600
tttcccaaca attaggttta gagttttgga attaaaccaa aaagattgtt ctaaaaaata 660
ctcaaatttg gtagataagt ttccttattt taattagtca atggtagata cttttttttc 720
ttttctttat tagagtagat tagaatcttt tatgccaagt tttgataaat taaatcaaga 780
agataaacta tcataatcaa catgaaatta aaagaaaaat ctcatatata gtattagtat 840
tctctatata tattatgatt gcttattctt aatgggttgg gttaaccaag acatagtctt 900
aatggaaaga atcttttttg aactttttcc ttattgatta aattcttcta tagaaaagaa 960
agaaattatt tgaggaaaag tatatacaaa aagaaaaata gaaaaatgtc agtgaagcag 1020
atgtaatgga tgacctaatc caaccaccac cataggatgt ttctacttga gtcggtcttt 1080
taaaaacgca cggtggaaaa tatgacacgt atcatatgat tccttccttt agtttcgtga 1140
taataatcct caactgatat cttccttttt ttgttttggc taaagatatt ttattctcat 1200
taatagaaaa gacggttttg ggcttttggt ttgcgatata aagaagacct tcgtgtggaa 1260
gataataatt catcctttcg tctttttctg actcttcaat ctctcccaaa gcctaaagcg 1320
atctctgcaa atctctcgcg actctctctt tcaaggtata ttttctgatt ctttttgttt 1380
ttgattcgta tctgatctcc aatttttgtt atgtggatta ttgaatcttt tgtataaatt 1440
gcttttgaca atattgttcg tttcgtcaat ccagcttcta aattttgtcc tgattactaa 1500
gatatcgatt cgtagtgttt acatctgtgt aatttcttgc ttgattgtga aattaggatt 1560
ttcaaggacg atctattcaa tttttgtgtt ttctttgttc gattctctct gttttaggtt 1620
tcttatgttt agatccgttt ctctttggtg ttgttttgat ttctcttacg gcttttgatt 1680
tggtatatgt tcgctgattg gtttctactt gttctattgt tttatttcag gtggatccac 1740
aggctcggta cttatttcga aaagtgagaa attctccatc atcgacacaa gatagtgttg 1800
cacgtatggt tgctcagcta tttgtttctg attgtttggt gccaaatgta gctgatactt 1860
tttctgcttc caatttgtgg cgaattatgg acaaagctat gcatgacatg gtcgcaaaaa 1920
attaccaagg ccaaatggaa gaggagttta cgcgtaatgc taaactatat cgttttcagt 1980
tgaaggatat tgaaaaacct ttgaaggacc cagagactga tttggcaaag gctggtcaag 2040
ggatattggc atggtctaag gaggcacatg ttaagtttat ggttgctttt agagttttaa 2100
atgatttgtt attgaagtca ttaaactcta atgttgttta cgataacaca atgtctgaga 2160
ccgaattcac ccaaactatc ctcaacgggt ggcaatgaca taaaaacttc ccgtatcggg 2220
aacatcatca taaattgctc acgcccgatt cgagacacag agataatagc atccaaccaa 2280
cgttgaacat catcaacatt gcgacaagat aagctagcgt tacactccaa aaaatcagca 2340
taaacagctg ggtctttggg aagattttta atccaatcac gcaaagattc ctggtattca 2400
caaaaatgct tatactcacg gaacctgtgt gctgctatct tcgtcaattt acgcgaaaca 2460
cttggaaaca aatgtccatt agataaagca taaccacaaa aagtgatagg aacatttaaa 2520
tccaatttga aatccaagac agtttccttt ttaatcaact ttaacatttg atcgttaatt 2580
ttcaaattag cctgcctttt aaaaccatca tcgcccttca tggccataca aaatggtccg 2640
gtcccacgaa gcatagcatt taacatagca cccattaaaa tggtattacc aagcaaagtg 2700
ccgggttctc cactagtctt aacataagac atatgtgctc tgacatatct ggactgcata 2760
acatatttct cacgaaatga gaaataccaa tccaaaaaga agtcagaaat gcccaaagca 2820
gcataaatat gtctttctat caattgggtg aaaacccctt gcccagaatc gcaagcagca 2880
gcatcgataa ccccgtttat agcactatct ggtactgtat tcatggcggc atttattttt 2940
ccaacaaatt cggtctcaga cattgtgtta tcgtaaacaa cattagagtt taatgacttc 3000
aataacaaat catttaaaac tctaaaagca accataaact taacatgtgc ctccttagac 3060
catgccaata tcccttgacc agcctttgcc aaatcagtct ctgggtcctt caaaggtttt 3120
tcaatatcct tcaactgaaa acgatatagt ttagcattac gcgtaaactc ctcttccatt 3180
tggccttggt aattttttgc gaccatgtca tgcatagctt tgtccataat tcgccacaaa 3240
ttggaagcag aaaaagtatc agctacattt ggcaccaaac aatcagaaac aaatagctga 3300
gcaaccatac gtgcaacact atcttgtgtc gatgatggag aatttctcac ttttcgaaat 3360
aagtaccgag cctgtggatc ccccgaattt ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 3420
tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatctaat ttctgttgaa 3480
ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 3540
tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 3600
aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcc 3648
<210>18
<211>3648
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pHiNK184
<220>
<221>啟動子
<222>(1)..(1738)
<223>遍在蛋白3啟動子加前導內含子
<220>
<221>重復單元
<222>(1739)..(2166)
<223>BNYVV RNA1重復片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(2167)..(2946)
<223>間隔基
<220>
<221>重復單元
<222>Complement((2947)..(3375))
<223>BNYVV RNA1重復片段
<220>
<221>莖-環
<222>(1739)..(3375)
<223>由間隔基分隔的BNYVV RNA1片段的反向重復
<220>
<221>終止子
<222>(3376)..(3648)
<223>NOS終止子
<400>18
ggtaccggat ttggagccaa gtctcataaa cgccattgtg gaagaaagtc ttgagttggt 60
ggtaatgtaa cagagtagta agaacagaga agagagagag tgtgagatac atgaattgtc 120
gggcaacaaa aatcctgaac atcttatttt agcaaagaga aagagttccg agtctgtagc 180
agaagagtga ggagaaattt aagctcttgg acttgtgaat tgttccgcct cttgaatact 240
tcttcaatcc tcatatattc ttcttctatg ttacctgaaa accggcattt aatctcgcgg 300
gtttattccg gttcaacatt ttttttgttt tgagttatta tctgggctta ataacgcagg 360
cctgaaataa attcaaggcc caactgtttt tttttttaag aagttgctgt taaaaaaaaa 420
aaaagggaat taacaacaac aacaaaaaaa gataaagaaa ataataacaa ttactttaat 480
tgtagactaa aaaaacatag attttatcat gaaaaaaaga gaaaagaaat aaaaacttgg 540
atcaaaaaaa aaaacataca gatcttctaa ttattaactt ttcttaaaaa ttaggtcctt 600
tttcccaaca attaggttta gagttttgga attaaaccaa aaagattgtt ctaaaaaata 660
ctcaaatttg gtagataagt ttccttattt taattagtca atggtagata cttttttttc 720
ttttctttat tagagtagat tagaatcttt tatgccaagt tttgataaat taaatcaaga 780
agataaacta tcataatcaa catgaaatta aaagaaaaat ctcatatata gtattagtat 840
tctctatata tattatgatt gcttattctt aatgggttgg gttaaccaag acatagtctt 900
aatggaaaga atcttttttg aactttttcc ttattgatta aattcttcta tagaaaagaa 960
agaaattatt tgaggaaaag tatatacaaa aagaaaaata gaaaaatgtc agtgaagcag 1020
atgtaatgga tgacctaatc caaccaccac cataggatgt ttctacttga gtcggtcttt 1080
taaaaacgca cggtggaaaa tatgacacgt atcatatgat tccttccttt agtttcgtga 1140
taataatcct caactgatat cttccttttt ttgttttggc taaagatatt ttattctcat 1200
taatagaaaa gacggttttg ggcttttggt ttgcgatata aagaagacct tcgtgtggaa 1260
gataataatt catcctttcg tctttttctg actcttcaat ctctcccaaa gcctaaagcg 1320
atctctgcaa atctctcgcg actctctctt tcaaggtata ttttctgatt ctttttgttt 1380
ttgattcgta tctgatctcc aatttttgtt atgtggatta ttgaatcttt tgtataaatt 1440
gcttttgaca atattgttcg tttcgtcaat ccagcttcta aattttgtcc tgattactaa 1500
gatatcgatt cgtagtgttt acatctgtgt aatttcttgc ttgattgtga aattaggatt 1560
ttcaaggacg atctattcaa tttttgtgtt ttctttgttc gattctctct gttttaggtt 1620
tcttatgttt agatccgttt ctctttggtg ttgttttgat ttctcttacg gcttttgatt 1680
tggtatatgt tcgctgattg gtttctactt gttctattgt tttatttcag gtggatccac 1740
aggctcggta cttatttcga aaagtgagaa attctccatc atcgacacaa gatagtgttg 1800
cacgtatggt tgctcagcta tttgtttctg attgtttggt gccaaatgta gctgatactt 1860
tttctgcttc caatttgtgg cgaattatgg acaaagctat gcatgacatg gtcgcaaaaa 1920
attaccaagg ccaaatggaa gaggagttta cgcgtaatgc taaactatat cgttttcagt 1980
tgaaggatat tgaaaaacct ttgaaggacc cagagactga tttggcaaag gctggtcaag 2040
ggatattggc atggtctaag gaggcacatg ttaagtttat ggttgctttt agagttttaa 2100
atgatttgtt attgaagtca ttaaactcta atgttgttta cgataacaca atgtctgaga 2160
ccgaatttgt tggaaaaata aatgccgcca tgaatacagt accagatagt gctataaacg 2220
gggttatcga tgctgctgct tgcgattctg ggcaaggggt tttcacccaa ttgatagaaa 2280
gacatattta tgctgctttg ggcatttctg acttcttttt ggattggtat ttctcatttc 2340
gtgagaaata tgttatgcag tccagatatg tcagagcaca tatgtcttat gttaagacta 2400
gtggagaacc cggcactttg cttggtaata ccattttaat gggtgctatg ttaaatgcta 2460
tgcttcgtgg gaccggacca ttttgtatgg ccatgaaggg cgatgatggt tttaaaaggc 2520
aggctaattt gaaaattaac gatcaaatgt taaagttgat taaaaaggaa actgtcttgg 2580
atttcaaatt ggatttaaat gttcctatca ctttttgtgg ttatgcttta tctaatggac 2640
atttgtttcc aagtgtttcg cgtaaattga cgaagatagc agcacacagg ttccgtgagt 2700
ataagcattt ttgtgaatac caggaatctt tgcgtgattg gattaaaaat cttcccaaag 2760
acccagctgt ttatgctgat tttttggagt gtaacgctag cttatcttgt cgcaatgttg 2820
atgatgttca acgttggttg gatgctatta tctctgtgtc tcgaatcggg cgtgagcaat 2880
ttatgatgat gttcccgata cgggaagttt ttatgtcatt gccacccgtt gaggatagtt 2940
tgggtgaatt cggtctcaga cattgtgtta tcgtaaacaa cattagagtt taatgacttc 3000
aataacaaat catttaaaac tctaaaagca accataaact taacatgtgc ctccttagac 3060
catgccaata tcccttgacc agcctttgcc aaatcagtct ctgggtcctt caaaggtttt 3120
tcaatatcct tcaactgaaa acgatatagt ttagcattac gcgtaaactc ctcttccatt 3180
tggccttggt aattttttgc gaccatgtca tgcatagctt tgtccataat tcgccacaaa 3240
ttggaagcag aaaaagtatc agctacattt ggcaccaaac aatcagaaac aaatagctga 3300
gcaaccatac gtgcaacact atcttgtgtc gatgatggag aatttctcac ttttcgaaat 3360
aagtaccgag cctgtggatc ccccgaattt ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 3420
tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatctaat ttctgttgaa 3480
ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 3540
tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 3600
aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcc3648
<210>19
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1563
<400>19
gggcggatcc gctagcccgc ggccgctctt tctttccaag g41
<210>20
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1564
<400>20
cccgccatgg gtcgacgcca ttttttatga gctgc 35
<210>21
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1565
<400>21
cccgccatgg gatccgatga tttctaccga gaattaaggg40
<210>22
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1566
<400>22
gggcgctagc ctaatgctta tatagtacc29
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1567
<400>23
gggcgctagc cttgctggag tataagccgg 30
<210>24
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1568
<400>24
gggcgtcgac cgcgggcttt aaaggtggga ggccc 35
<210>25
<211>12766
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pZU623
<220>
<221>啟動子
<222>(55)..(1781)
<223>遍在蛋白3加先導內含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(1790)..(2430)
<223>PRSV nt CP區
<220>
<221>misc_feature
<222>(2511)..(3111)
<223>ZYMV nt CP區
<220>
<221>內含子
<222>(3245)..(3686)
<223>actin2 intronL
<220>
<221>misc_feature
<222>Complement((3822)..(4422))
<223>ZYMV nt CP區
<220>
<221>misc_feature
<222>Complement((4503)..(5143))
<223>PRSV nt CP區
<220>
<221>終止子
<222>(5160)..(5429)
<223>NOS啟動子
<220>
<221>啟動子
<222>(5498)..(6669)
<223>SMAS啟動子
<220>
<221>基因
<222>(6691)..(7866)
<223>磷酸甘露糖異構酶A編碼序列
<220>
<221>終止子
<222>(7928)..(8202)
<223>胭脂堿合酶終止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(8254)..(8385)
<223>胭脂堿左邊界片段
<220>
<221>基因
<222>(8664)..(9452)
<223>壯觀霉素(aadA)編碼序列
<220>
<221>misc_structure
<222>(9462)..(11549)
<223>pVSl ORI
<220>
<221>misc_structure
<222>(11550)..(12484)
<223>pUC19 ORI
<220>
<221>misc_feature
<222>(12500)..(12755)
<223>胭脂堿右邊界區
<220>
<221>莖-環
<222>(1790)..(5143)
<223>PRSV-ZYMV反向重復片段
<400>25
ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt accccggatt 60
tggagccaag tctcataaac gccattgtgg aagaaagtct tgagttggtg gtaatgtaac 120
agagtagtaa gaacagagaa gagagagagt gtgagataca tgaattgtcg ggcaacaaaa 180
atcctgaaca tcttatttta gcaaagagaa agagttccga gtctgtagca gaagagtgag 240
gagaaattta agctcttgga cttgtgaatt gttccgcctc ttgaatactt cttcaatcct 300
catatattct tcttctatgt tacctgaaaa ccggcattta atctcgcggg tttattccgg 360
ttcaacattt tttttgtttt gagttattat ctgggcttaa taacgcaggc ctgaaataaa 420
ttcaaggccc aactgttttt tttttaagaa gttgctgtta aaaaaaaaaa aagggaatta 480
acaacaacaa caaaaaaaga taaagaaaat aataacaatt actttaattg tagactaaaa 540
aaacatagat tttatcatga aaaaaagaga aaagaaataa aaacttggat caaaaaaaaa 600
aacatacaga tcttctaatt attaactttt cttaaaaatt aggtcctttt tcccaacaat 660
taggtttaga gttttggaat taaaccaaaa agattgttct aaaaaatact caaatttggt 720
agataagttt ccttatttta attagtcaat ggtagatact tttttttctt ttctttatta 780
gagtagatta gaatctttta tgccaagttt tgataaatta aatcaagaag ataaactatc 840
ataatcaaca tgaaattaaa agaaaaatct catatatagt attagtattc tctatatata 900
ttatgattgc ttattcttaa tgggttgggt taaccaagac atagtcttaa tggaaagaat 960
cttttttgaa ctttttcctt attgattaaa ttcttctata gaaaagaaag aaattatttg 1020
aggaaaagta tatacaaaaa gaaaaataga aaaatgtcag tgaagcagat gtaatggatg 1080
acctaatcca accaccacca taggatgttt ctacttgagt cggtctttta aaaacgcacg 1140
gtggaaaata tgacacgtat catatgattc cttcctttag tttcgtgata ataatcctca 1200
actgatatct tccttttttt gttttggcta aagatatttt attctcatta atagaaaaga 1260
cggttttggg cttttggttt gcgatataaa gaagaccttc gtgtggaaga taataattca 1320
tcctttcgtc tttttctgac tcttcaatct ctcccaaagc ctaaagcgat ctctgcaaat 1380
ctctcgcgac tctctctttc aaggtatatt ttctgattct ttttgttttt gattcgtatc 1440
tgatctccaa tttttgttat gtggattatt gaatcttttg tataaattgc ttttgacaat 1500
attgttcgtt tcgtcaatcc agcttctaaa ttttgtcctg attactaaga tatcgattcg 1560
tagtgtttac atctgtgtaa tttcttgctt gattgtgaaa ttaggatttt caaggacgat 1620
ctattcaatt tttgtgtttt ctttgttcga ttctctctgt tttaggtttc ttatgtttag 1680
atccgtttct ctttggtgtt gttttgattt ctcttacggc ttttgatttg gtatatgttc 1740
gctgattggt ttctacttgt tctattgttt tacttcaggt gggggatccg atgatttcta 1800
ccgagaatta agggaaagac tgtccttaat ttaaatcatc ttcttcagta taatccgcaa 1860
caaattgaca tttctaacac tcgtgccact cagtcacaat ttgagaagtg gtatgaggga 1920
gtgaggaatg attatggtct caatgataat gaaatgcaag tgatgctaaa tggcttgatg 1980
gtttggtgta tcgagaatgg tacatctcca gacatatctg gtgtctgggt tatgatggat 2040
ggggaaaccc aagttgatta tccaatcaag cctttaatag agcatgctac tccgtcattt 2100
aggcaaatta tggctcactt tagtaacgcg gcagaagcat acattgcgaa gagaaatgct 2160
actgagagat acatgccgcg gtatggaatc aagagaaatt tgactgacat tagtcttgct 2220
agatacgctt tcgacttcta tgaggtgaat tcgaaaacac ctgatagggc tcgtgaagct 2280
cacatgcaga tgaaagctgc agcgctgcga aacactagtc gcagaatgtt tggtatggac 2340
ggcagtgtta gtaacaagga agaaaacacg gagagacaca cagtggaaga tgtcaataga 2400
gacatgcact ctctcctggg tatgcgcaac tgaatactcg cgcttgtgtg tttgtcgagt 2460
ctgactcgac cctgtttcac cttatggtac tatataagca ttaggctagc cttgctggag 2520
tataagccgg atcaaattga gttatacaac acacgagcgt ctcatcagca attcgcctct 2580
tggttcaacc aagttaaaac agaatatgat ctgaatgagc aacagatggg agttgtaatg 2640
aatggtttca tggtttggtg cattgaaaat ggcacgtcac ccgacattaa cggagtatgg 2700
gttatgatgg acggtaatga gcaggttgaa tatcctttga aaccaatagt tgaaaatgca 2760
aagccaacgc tgcgacaaat aatgcatcac ttttcagatg cagcggaggc atatatagag 2820
atgagaaatg cagaggcacc atacatgccg aggtatggtt tgcttcgaaa cttacgggat 2880
aggagtttgg cacgatatgc tttcgacttc tacgaagtca attccaaaac tccggaaaga 2940
gcccgcgaag ctgttgcgca gatgaaagca gcagccctta gcaatgtttc ttcaaggttg 3000
tttggccttg atggaaatgt tgccaccact agcgaagaca ctgaacggca cactgcacgt 3060
gatgttaata ggaacatgca caccttgcta ggtgtgaata caatgcagta aagggtaggt 3120
cgcctaccta ggttatcgtt tcgctgccga cgtaattcta atatttaccg ctttatgtga 3180
tgtctttaga tttctagagt gggcctccca cctttaaagc ccgcggccgc tctttctttc 3240
caaggtaata ggaactttct ggatctactt tatttgctgg atctcgatct tgttttctca 3300
atttccttga gatctggaat tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg 3360
gttttactag aatcgatcta agttgaccga tcagttagct cgattatagc taccagaatt 3420
tggcttgacc ttgatggaga gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt 3480
gaattgaaat ctgaactgtt gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga 3540
atctgaacac tgtttaagtt agatgaagtt tgtgtataga ttcttcgaaa ctttaggatt 3600
tgtagtgtcg tacgttgaac agaaagctat ttctgattca atcagggttt atttgactgt 3660
attgaactct ttttgtgtgt ttgcagctca taaaaaatgg cgtcgaccgc gggctttaaa 3720
ggtgggaggc ccactctaga aatctaaaga catcacataa agcggtaaat attagaatta 3780
cgtcggcagc gaaacgataa cctaggtagg cgacctaccc tttactgcat tgtattcaca 3840
cctagcaagg tgtgcatgtt cctattaaca tcacgtgcag tgtgccgttc agtgtcttcg 3900
ctagtggtgg caacatttcc atcaaggcca aacaaccttg aagaaacatt gctaagggct 3960
gctgctttca tctgcgcaac agcttcgcgg gctctttccg gagttttgga attgacttcg 4020
tagaagtcga aagcatatcg tgccaaactc ctatcccgta agtttcgaag caaaccatac 4080
ctcggcatgt atggtgcctc tgcatttctc atctctatat atgcctccgc tgcatctgaa 4140
aagtgatgca ttatttgtcg cagcgttggc tttgcatttt caactattgg tttcaaagga 4200
tattcaacct gctcattacc gtccatcata acccatactc cgttaatgtc gggtgacgtg 4260
ccattttcaa tgcaccaaac catgaaacca ttcattacaa ctcccatctg ttgctcattc 4320
agatcatatt ctgttttaac ttggttgaac caagaggcga attgctgatg agacgctcgt 4380
gtgttgtata actcaatttg atccggctta tactccagca aggctagcct aatgcttata 4440
tagtaccata aggtgaaaca gggtcgagtc agactcgaca aacacacaag cgcgagtatt 4500
cagttgcgca tacccaggag agagtgcatg tctctattga catcttccac tgtgtgtctc 4560
tccgtgtttt cttccttgtt actaacactg ccgtccatac caaacattct gcgactagtg 4620
tttcgcagcg ctgcagcttt catctgcatg tgagcttcac gagccctatc aggtgttttc 4680
gaattcacct catagaagtc gaaagcgtat ctagcaagac taatgtcagt caaatttctc 4740
ttgattccat accgcggcat gtatctctca gtagcatttc tcttcgcaat gtatgcttct 4800
gccgcgttac taaagtgagc cataatttgc ctaaatgacg gagtagcatg ctctattaaa 4860
ggcttgattg gataatcaac ttgggtttcc ccatccatca taacccagac accagatatg 4920
tctggagatg taccattctc gatacaccaa accatcaagc catttagcat cacttgcatt 4980
tcattatcat tgagaccata atcattcctc actccctcat accacttctc aaattgtgac 5040
tgagtggcac gagtgttaga aatgtcaatt tgttgcggat tatactgaag aagatgattt 5100
aaattaagga cagtctttcc cttaattctc ggtagaaatc atcggatcca tggtgatcac 5160
tgcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 5220
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 5280
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 5340
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 5400
atctatgtta ctagatctct agaaagcttc gtacgttaat taattcgaat ccggagcggc 5460
cgcagggcta gcatcgatgg taccgagctc gagactatac aggccaaatt cgctcttagc 5520
cgtacaatat tactcaccgg tgcgatgccc cccatcgtag gtgaaggtgg aaattaatga 5580
tccatcttga gaccacaggc ccacaacagc taccagtttc ctcaagggtc caccaaaaac 5640
gtaagcgctt acgtacatgg tcgataagaa aaggcaattt gtagatgtta acatccaacg 5700
tcgctttcag ggatcccgaa ttccaagctt ggaattcggg atcctacagg ccaaattcgc 5760
tcttagccgt acaatattac tcaccggtgc gatgcccccc atcgtaggtg aaggtggaaa 5820
ttaatgatcc atcttgagac cacaggccca caacagctac cagtttcctc aagggtccac 5880
caaaaacgta agcgcttacg tacatggtcg ataagaaaag gcaatttgta gatgttaaca 5940
tccaacgtcg ctttcaggga tcccgaattc caagcttgga attcgggatc ctacaggcca 6000
aattcgctct tagccgtaca atattactca ccggtgcgat ccccccatcg taggtgaagg 6060
tggaaattaa tgatccatct tgagaccaca ggcccacaac agctaccagt ttcctcaagg 6120
gtccaccaaa aacgtaagcg cttacgtaca tggtcgataa gaaaaggcaa tttgtagatg 6180
ttaacatcca acgtcgcttt cagggatccc gaattccaag cttgggctgc aggtcaatcc 6240
cattgctttt gaagcagctc aacattgatc tctttctcga gggagatttt tcaaatcagt 6300
gcgcaagacg tgacgtaagt atccgagtca gtttttattt ttctactaat ttggtcgttt 6360
atttcggcgt gtaggacatg gcaaccgggc ctgaatttcg cgggtattct gtttctattc 6420
caactttttc ttgatccgca gccattaacg acttttgaat agatacgctg acacgccaag 6480
cctcgctagt caaaagtgta ccaaacaacg ctttacagca agaacggaat gcgcgtgacg 6540
ctcgcggtga cgccatttcg ccttttcaga aatggataaa tagccttgct tcctattata 6600
tcttcccaaa ttaccaatac attacactag catctgaatt tcataaccaa tctcgataca 6660
ccaaatcgag atctgcaggg atccccgatc atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac 6720
tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc 6780
cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat 6840
gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc 6900
ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca 6960
gcacagccac tctccattca ggttcatcca aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc 7020
aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat gccgccgagc gtaactataa agatcctaac 7080
cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa 7140
ttttccgaga ttgtctccct actccagccg gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac 7200
tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg 7260
cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg attttaaaat cggccctcga tagccagcag 7320
ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg 7380
ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc 7440
gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat 7500
aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa tacattgata ttccggaact ggttgccaat 7560
gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca 7620
gaactggact tcccgattcc agtggatgat tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat 7680
aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca 7740
acgttgtgga aaggttctca gcagttacag cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc 7800
gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag 7860
ctgtaagagc ttactgaaaa aattaacatc tcttgctaag ctgggagctc gtcgacggat 7920
cgaattcctg cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 7980
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 8040
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 8100
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 8160
gcggtgtcat ctatgttact agatctctag aactagtgga tctgctagcc ctgcaggaaa 8220
tttaccggtg cccgggcggc cagcatggcc gtatccgcaa tgtgttatta agttgtctaa 8280
gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag ctccccgacc 8340
ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagaatta attctcatgt 8400
ttgacagctt atcatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg 8460
aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc 8520
actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc aaatattctg 8580
aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 8640
caatttcaca caggaaacag accatgaggg aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac 8700
tatcagaggt agttggcgtc atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt 8760
tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta 8820
cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa 8880
cttcggcttc ccctggagag agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc 8940
acgacgacat cattccgtgg cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc 9000
agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta 9060
tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac 9120
tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat 9180
ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca 9240
tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa 9300
tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg tcatacttga agctaggcag gcttatcttg 9360
gacaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtt cactacgtga 9420
aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aaagctctag tggatccccg aggaatcggc 9480
gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg 9540
tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc 9600
ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 9660
cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 9720
ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 9780
tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 9840
ggcacgtaga ggtttcagca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 9900
tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 9960
acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 10020
ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 10080
acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 10140
gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 10200
tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 10260
tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 10320
gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 10380
aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg 10440
ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 10500
tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 10560
agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 10620
tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 10680
ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 10740
aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc 10800
tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc 10860
ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc 10920
gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt 10980
cgccactcga ccgccggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga aggtgttgct gactcatacc 11040
aggcctgaat cgccccatca tccagccaga aagtgaggga gccacggttg atgagagctt 11100
tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga acttttgctt tgccacggaa cggtctgcgt 11160
tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca actcagcaaa agttcgattt attcaacaaa 11220
gccgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt tacaaccaat taaccaattc 11280
tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 11340
aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 11400
ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 11460
acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 11520
gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 11580
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 11640
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 11700
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 11760
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 11820
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 11880
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 11940
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc 12000
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 12060
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 12120
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 12180
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 12240
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 12300
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagae 12360
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 12420
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 12480
ttttgatccg gaattaattc ctgtggttgg catgcacata caaatggacg aacggataaa 12540
ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt 12600
acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc 12660
tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa 12720
gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgctgca ggaatt12766
<210>26
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1598
<400>26
catgccatgg atccaatggc cacgaattaa agctatcacg tc42
<210>27
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1590
<400>27
acgcgtcgac cgcggattca aacgattatt aattacgata aaag 44
<210>28
<211>11461
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pZU634
<220>
<221>啟動子
<222>(55)..(1786)
<223>遍在蛋白3啟動子加先導內含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(1790)..(2574)
<223>PVY nt CP區
<220>
<221>內含子
<222>(2595)..(3036)
<223>actin2 intronL
<220>
<221>misc_feature
<222>complement((3057)..(3847))
<223>PVY nt cP區
<220>
<221>終止子
<222>(3855)..(4124)
<223>NOS終止子
<220>
<221>啟動子
<222>(4193)..(5364)
<223>SMAS啟動子
<220>
<221>gene
<222>(5386)..(6561)
<223>磷酸甘露糖異構酶A編碼序列
<220>
<221>終止子
<222>(6623)..(6897)
<223>胭脂堿合酶終止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(6949)..(7080)
<223>胭脂堿左邊界片段
<220>
<221>gene
<222>(7359)..(8147)
<223>壯觀霉素(aadA)編碼區
<220>
<221>misc_structure
<222>(8157)..(10244)
<223>pVS1 ORI
<220>
<221>misc_structure
<222>(10245)..(11179)
<223>pUC19 ORI
<220>
<221>misc_feature
<222>(11195)..(11450)
<223>胭脂堿右邊界片段
<220>
<221>莖-環
<222>(1790)..(3847)
<223>PVY反向重復區
<400>28
ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt acccgtaccg 60
gatttggagc caagtctcat aaacgccatt gtggaagaaa gtcttgagtt ggtggtaatg 120
taacagagta gtaagaacag agaagagaga gagtgtgaga tacatgaatt gtcgggcaac 180
aaaaatcctg aacatcttat tttagcaaag agaaagagtt ccgagtctgt agcagaagag 240
tgaggagaaa tttaagctct tggacttgtg aattgttccg cctcttgaat acttcttcaa 300
tcctcatata ttcttcttct atgttacctg aaaaccggca tttaatctcg cgggtttatt 360
ccggttcaac attttttttg ttttgagtta ttatctgggc ttaataacgc aggcctgaaa 420
taaattcaag gcccaactgt tttttttttt aagaagttgc tgttaaaaaa aaaaaaaggg 480
aattaacaac aacaacaaaa aaagataaag aaaataataa caattacttt aattgtagac 540
taaaaaaaca tagattttat catgaaaaaa agagaaaaga aataaaaact tggatcaaaa 600
aaaaaaacat acagatcttc taattattaa cttttcttaa aaattaggtc ctttttccca 660
acaattaggt ttagagtttt ggaattaaac caaaaagatt gttctaaaaa atactcaaat 720
ttggtagata agtttcctta ttttaattag tcaatggtag atactttttt ttcttttctt 780
tattagagta gattagaatc ttttatgcca agttttgata aattaaatca agaagataaa 840
ctatcataat caacatgaaa ttaaaagaaa aatctcatat atagtattag tattctctat 900
atatattatg attgcttatt cttaatgggt tgggttaacc aagacatagt cttaatggaa 960
agaatctttt ttgaactttt tccttattga ttaaattctt ctatagaaaa gaaagaaatt 1020
atttgaggaa aagtatatac aaaaagaaaa atagaaaaat gtcagtgaag cagatgtaat 1080
ggatgaccta atccaaccac caccatagga tgtttctact tgagtcggtc ttttaaaaac 1140
gcacggtgga aaatatgaca cgtatcatat gattccttcc tttagtttcg tgataataat 1200
cctcaactga tatcttcctt tttttgtttt ggctaaagat attttattct cattaataga 1260
aaagacggtt ttgggctttt ggtttgcgat ataaagaaga ccttcgtgtg gaagataata 1320
attcatcctt tcgtcttttt ctgactcttc aatctctccc aaagcctaaa gcgatctctg 1380
caaatctctc gcgactctct ctttcaaggt atattttctg attctttttg tttttgattc 1440
gtatctgatc tccaattttt gttatgtgga ttattgaatc ttttgtataa attgcttttg 1500
acaatattgt tcgtttcgtc aatccagctt ctaaattttg tcctgattac taagatatcg 1560
attcgtagtg tttacatctg tgtaatttct tgcttgattg tgaaattagg attttcaagg 1620
acgatctatt caatttttgt gttttctttg ttcgattctc tctgttttag gtttcttatg 1680
tttagatccg tttctctttg gtgttgtttt gatttctctt acggcttttg atttggtata 1740
tgttcgctga ttggtttcta cttgttctat tgttttattt caggtggggg atccaatggc 1800
cacgaattaa agctatcacg tccaaaatga gaatgcccaa gagtaagggt gcaactgtac 1860
taaatttgga acacctactc gagtatgctc cacagcaaat tgaaatctca aatactcgag 1920
caactcaatc acagtttgat acatggtatg aagcagtaca acttgcatac gacataggag 1980
aaactgaaat gccaactgtg atgaatgggc ttatggtttg gtgcattgaa aatggaacct 2040
cgccaaatat caatggagtt tgggttatga tggatggaga tgaacaagtc gaatacccac 2100
tgaaaccaat cgttgagaat gcaaaaccaa cacttaggca aatcatggca catttctcag 2160
atgttgcaga agcgtatata gaaatgcgca acaaaaagga accatatatg ccacgatatg 2220
gtttagttcg taatctgcgc gatggaagtt tggctcgcta tgcttttgac ttttatgaag 2280
ttacatcacg tacaccagtg agggctagag aggcacacat tcaaatgaag gccgcagctt 2340
taaaatcagc tcaatctcga cttttcggat tggatggtgg cattagtaca caagaggaaa 2400
acacagagag gcacaccacc gaggatgttt ctccaagtat gcatactcta cttggagtga 2460
agaacatgtg attgtagtgt ctttccggac gatatataga tatttatgtt tgcagtaagt 2520
attttggctt ttcctgtact acttttatcg taattaataa tcgtttgaat ccgcggccgc 2580
tctttctttc caaggtaata ggaactttct ggatctactt tatttgctgg atctcgatct 2640
tgttttctca atttccttga gatctggaat tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact 2700
aaatcttttg gttttactag aatcgatcta agttgaccga tcagttagct cgattatagc 2760
taccagaatt tggcttgacc ttgatggaga gatccatgtt catgttacct gggaaatgat 2820
ttgtatatgt gaattgaaat ctgaactgtt gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat 2880
gttagattga atctgaacac tgtttaagtt agatgaagtt tgtgtataga ttcttcgaaa 2940
ctttaggatt tgtagtgtcg tacgttgaac agaaagctat ttctgattca atcagggttt 3000
atttgactgt attgaactct ttttgtgtgt ttgcagctca taaaaaatgg cgtcgaccgc 3060
ggattcaaac gattattaat tacgataaaa gtagtacagg aaaagccaaa atacttactg 3120
caaacataaa tatctatata tcgtccggaa agacactaca atcacatgtt cttcactcca 3180
agtagagtat gcatacttgg agaaacatcc tcggtggtgt gcctctctgt gttttcctct 3240
tgtgtactaa tgccaccatc caatccgaaa agtcgagatt gagctgattt taaagctgcg 3300
gccttcattt gaatgtgtgc ctctctagcc ctcactggtg tacgtgatgt aacttcataa 3360
aagtcaaaag catagcgagc caaacttcca tcgcgcagat tacgaactaa accatatcgt 3420
ggcatatatg gttccttttt gttgcgcatt tctatatacg cttctgcaac atctgagaaa 3480
tgtgccatga tttgcctaag tgttggtttt gcattctcaa cgattggttt cagtgggtat 3540
tcgacttgtt catctccatc catcataacc caaactccat tgatatttgg cgaggttcca 3600
ttttcaatgc accaaaccat aagcccattc atcacagttg gcatttcagt ttctcctatg 3660
tcgtatgcaa gttgtactgc ttcataccat gtatcaaact gtgattgagt tgctcgagta 3720
tttgagattt caatttgctg tggagcatac tcgagtaggt gttccaaatt tagtacagtt 3780
gcacccttac tcttgggcat tctcattttg gacgtgatag ctttaattcg tggccattgg 3840
atccatggtg atcactgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 3900
tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 3960
aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 4020
gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaacct aggataaatt 4080
atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctctagaaa gcttcgtacg ttaattaatt 4140
cgaatccgga gcggccgcag ggctagcatc gatggtaccg agctcgagac tatacaggcc 4200
aaattcgctc ttagccgtac aatattactc accggtgcga tgccccccat cgtaggtgaa 4260
ggtggaaatt aatgatccat cttgagacca caggcccaca acagctacca gtttcctcaa 4320
gggtccacca aaaacgtaag cgcttacgta catggtcgat aagaaaaggc aatttgtaga 4380
tgttaacatc caacgtcgct ttcagggatc ccgaattcca agcttggaat tcgggatcct 4440
acaggccaaa ttcgctctta gccgtacaat attactcacc ggtgcgatgc cccccatcgt 4500
aggtgaaggt ggaaattaat gatccatctt gagaccacag gcccacaaca gctaccagtt 4560
tcctcaaggg tccaccaaaa acgtaagcgc ttacgtacat ggtcgataag aaaaggcaat 4620
ttgtagatgt taacatccaa cgtcgctttc agggatcccg aattccaagc ttggaattcg 4680
ggatcctaca ggccaaattc gctcttagcc gtacaatatt actcaccggt gcgatccccc 4740
catcgtaggt gaaggtggaa attaatgatc catcttgaga ccacaggccc acaacagcta 4800
ccagtttcct caagggtcca ccaaaaacgt aagcgcttac gtacatggtc gataagaaaa 4860
ggcaatttgt agatgttaac atccaacgtc gctttcaggg atcccgaatt ccaagcttgg 4920
gctgcaggtc aatcccattg cttttgaagc agctcaacat tgatctcttt ctcgagggag 4980
atttttcaaa tcagtgcgca agacgtgacg taagtatccg agtcagtttt tatttttcta 5040
ctaatttggt cgtttatttc ggcgtgtagg acatggcaac cgggcctgaa tttcgcgggt 5100
attctgtttc tattccaact ttttcttgat ccgcagccat taacgacttt tgaatagata 5160
cgctgacacg ccaagcctcg ctagtcaaaa gtgtaccaaa caacgcttta cagcaagaac 5220
ggaatgcgcg tgacgctcgc ggtgacgcca tttcgccttt tcagaaatgg ataaatagcc 5280
ttgcttccta ttatatcttc ccaaattacc aatacattac actagcatct gaatttcata 5340
accaatctcg atacaccaaa tcgagatctg cagggatccc cgatcatgca aaaactcatt 5400
aactcagtgc aaaactatgc ctggggcagc aaaacggcgt tgactgaact ttatggtatg 5460
gaaaatccgt ccagccagcc gatggccgag ctgtggatgg gcgcacatcc gaaaagcagt 5520
tcacgagtgc agaatgccgc cggagatatc gtttcactgc gtgatgtgat tgagagtgat 5580
aaatcgactc tgctcggaga ggccgttgcc aaacgctttg gcgaactgcc tttcctgttc 5640
aaagtattat gcgcagcaca gccactctcc attcaggttc atccaaacaa acacaattct 5700
gaaatcggtt ttgccaaaga aaatgccgca ggtatcccga tggatgccgc cgagcgtaac 5760
tataaagatc ctaaccacaa gccggagctg gtttttgcgc tgacgccttt ccttgcgatg 5820
aacgcgtttc gtgaattttc cgagattgtc tccctactcc agccggtcgc aggtgcacat 5880
ccggcgattg ctcacttttt acaacagcct gatgccgaac gtttaagcga actgttcgcc 5940
agcctgttga atatgcaggg tgaagaaaaa tcccgcgcgc tggcgatttt aaaatcggcc 6000
ctcgatagcc agcagggtga accgtggcaa acgattcgtt taatttctga attttacccg 6060
gaagacagcg gtctgttctc cccgctattg ctgaatgtgg tgaaattgaa ccctggcgaa 6120
gcgatgttcc tgttcgctga aacaccgcac gcttacctgc aaggcgtggc gctggaagtg 6180
atggcaaact ccgataacgt gctgcgtgcg ggtctgacgc ctaaatacat tgatattccg 6240
gaactggttg ccaatgtgaa attcgaagcc aaaccggcta accagttgtt gacccagccg 6300
gtgaaacaag gtgcagaact ggacttcccg attccagtgg atgattttgc cttctcgctg 6360
catgacctta gtgataaaga aaccaccatt agccagcaga gtgccgccat tttgttctgc 6420
gtcgaaggcg atgcaacgtt gtggaaaggt tctcagcagt tacagcttaa accgggtgaa 6480
tcagcgttta ttgccgccaa cgaatcaccg gtgactgtca aaggccacgg ccgtttagcg 6540
cgtgtttaca acaagctgta agagcttact gaaaaaatta acatctcttg ctaagctggg 6600
agctcgtcga cggatcgaat tcctgcagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 6660
agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 6720
aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 6780
agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 6840
gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc tctagaacta gtggatctgc 6900
tagccctgca ggaaatttac cggtgcccgg gcggccagca tggccgtatc cgcaatgtgt 6960
tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta caccacaata tatcctgcca ccagccagcc 7020
aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa aatcaccact cgatacaggc agcccatcag 7080
aattaattct catgtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 7140
tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 7200
tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 7260
ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga 7320
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg gtgatcgccg 7380
aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc gaaccgacgt 7440
tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca cacagtgata 7500
ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga gctttgatca 7560
acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc gctgtagaag 7620
tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag cgcgaactgc 7680
aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca gccacgatcg 7740
acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc ttggtaggtc 7800
cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag gcgctaaatg 7860
aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga aatgtagtgc 7920
ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg aaggatgtcg 7980
ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata cttgaagcta 8040
ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat 8100
ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataaagc tctagtggat 8160
ccccgaggaa tcggcgtgac ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc 8220
tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg 8280
aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat 8340
cccggcaacc gccggcagcc ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc 8400
aaccagattt tttcgttccg atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca 8460
tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct 8520
acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt cagcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt 8580
gggattacga cctggtactg atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc 8640
gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca 8700
agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc 8760
ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg 8820
tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg 8880
ggcggccgga gtacatcgag atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag 8940
gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg 9000
gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt 9060
tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg 9120
tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc 9180
aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg 9240
gttcctaatg tacggagcag atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa 9300
aaggtctctt tcctgtggat agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc 9360
ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga 9420
ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa 9480
ctcttaaaac ccgcctggcc tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc 9540
aaaaagcgcc tacccttcgg tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta 9600
tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg 9660
gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 9720
ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac 9780
ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 9840
cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc 9900
gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa 9960
ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt 10020
catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 10080
ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 10140
tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 10200
atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agctctgcat taatgaatcg 10260
gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 10320
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 10380
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 10440
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 10500
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 10560
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 10620
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct 10680
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 10740
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 10800
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 10860
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 10920
ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 10980
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 11040
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 11100
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 11160
tcttcaccta gatccttttg atccggaatt aattcctgtg gttggcatgc acatacaaat 11220
ggacgaacgg ataaaccttt tcacgccctt ttaaatatcc gattattcta ataaacgctc 11280
ttttctctta ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg 11340
cgggaaacga caatctgatc atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc 11400
gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg ctgcaggaat 11460
t 1146權利要求
1.一種給植物細胞賦予對選自由真菌傳棒狀病毒、馬鈴薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黃瓜花葉病毒構成的組中的一種以上病毒的抗性或耐受性的方法，包括以下步驟向植物細胞中導入多于一對DNA序列，其中對于每一對，第一種DNA序列編碼真菌傳棒狀病毒、馬鈴薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒或黃瓜花葉病毒的病毒基因組的一部分，并且所述一對DNA序列的第二種DNA序列編碼對于第一種DNA序列反義的序列，這樣當在所述植物細胞中表達時，一對DNA序列的第一和第二種DNA序列所編碼的RNA序列形成雙鏈RNA分子，導致一旦病毒感染則產生該對的DNA序列所來源的病毒基因組的該部分的表達降低，并且其中被導入的DNA序列對中的至少2對來自所述組的不同病毒，產生所述植物細胞對所述組中一種以上的病毒的抗性或耐受性。
2.權利要求1的方法，其中一對的第一種DNA序列含有一種獲自病毒外殼蛋白基因、病毒核殼蛋白基因、病毒復制酶基因、病毒運動蛋白基因或其部分的核苷酸序列。
3.權利要求1的方法，其中每一對的所述第一種DNA序列和所述第二種DNA序列穩定整合于所述細胞的基因組中。
4.權利要求1的方法，其中每一對的所述第一種DNA序列和所述第二種DNA序列包含于2種不同的DNA分子中。
5.權利要求4的方法，其中所述DNA序列還含有與所述第一種DNA序列有效連接的第一種啟動子，和與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動子。
6.權利要求1的方法，其中一對的所述第一種DNA序列和所述第二種DNA序列包含于1種DNA分子中。
7.權利要求6的方法，其中一對的所述第一種DNA序列和所述第二種DNA序列包含于所述DNA分子的同一個DNA鏈中。
8.權利要求7的方法，其中由一對的所述第一種和第二種DNA序列編碼的所述RNA序列包含于一個RNA分子中。
9.權利要求8的方法，其中所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA序列形成雙鏈區。
10.權利要求8的方法，其中所述DNA分子還含有效連接至所述第一種和第二種DNA序列的一個啟動子。
11.權利要求10的方法，其中所述啟動子是異源啟動子。
12.權利要求10的方法，其中所述啟動子是組織特異性啟動子。
13.權利要求10的方法，其中所述啟動子是發育調節型啟動子。
14.權利要求10的方法，其中所述啟動子是組成型啟動子。
15.權利要求10的方法，其中所述啟動子是誘導型啟動子。
16.權利要求8的方法，其中所述DNA分子在第一種和第二種DNA序列之間還含有一個接頭。
17.權利要求16的方法，其中所述接頭含有內含子加工信號。
18.權利要求7的方法，其中由第一種和第二種DNA序列編碼的所述RNA序列包含于2種RNA分子中。
19.權利要求18的方法，其中所述第一種DNA序列有效連接至第一種啟動子，并且所述第二種DNA序列有效連接至第二種啟動子。
20.權利要求18的方法，其中所述第一種DNA序列和所述第二種DNA序列與一種雙向啟動子有效連接。
21.權利要求7的方法，其中所述第一種DNA序列和所述第二種DNA序列包含于所述DNA分子的互補鏈中。
22.權利要求21的方法，其中在所述DNA分子中，所述第一種DNA序列是所述第二種DNA序列的互補DNA鏈。
23.權利要求22的方法，其中所述DNA分子還含有與所述第一種DNA序列有效連接的第一種啟動子。
24.通過權利要求1的方法得到的植物細胞，其中所述細胞對選自由真菌傳棒狀病毒、馬鈴薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黃瓜花葉病毒構成的組中的一種以上病毒具有抗性或耐受性。
25.含有權利要求24的植物細胞的植物，其中所述植物對選自由真菌傳棒狀病毒、馬鈴薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黃瓜花葉病毒構成的組中的一種以上病毒具有病毒抗性或耐受性。
26.從權利要求24的植物細胞再生的植物，其中所述植物對選自由真菌傳棒狀病毒、馬鈴薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黃瓜花葉病毒構成的組中的一種以上病毒具有抗性或耐受性。
27.從權利要求26的植物產生的種子，其中所述種子對選自由真菌傳棒狀病毒、馬鈴薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黃瓜花葉病毒構成的組中的一種以上的病毒具有抗性或耐受性，并且含有一對以上的所述DNA序列。
28.權利要求1的方法，其中所述DNA序列對中的一個含有從真菌傳棒狀病毒復制酶基因或其部分得到的核苷酸序列。
29.權利要求1的方法，其中所述DNA序列對中的一個含有從甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)得到的核苷酸序列。
30.權利要求29的方法，其中所述DNA序列對含有從甜菜壞死黃脈病毒或其部分的復制酶基因(RNA1)得到的核苷酸序列。
31.權利要求30的方法，其中來自BNYVV的復制酶的部分含有3’末端。
32.權利要求1的方法，其中所述DNA序列對中的一個含有從馬鈴薯Y病毒得到的核苷酸序列。
33.權利要求1的方法，其中所述DNA序列對中的一個含有從蕃茄斑萎病毒得到的核苷酸序列。
34.權利要求1的方法，其中所述DNA序列對中的一個含有從黃瓜花葉病毒得到的核苷酸序列。
35.從權利要求26的植物得到的后代，其中所述后代對選自由真菌傳棒狀病毒、馬鈴薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黃瓜花葉病毒構成的組中的一種以上病毒具有抗性或耐受性，并且所述后代含有一對以上的所述DNA序列。
全文摘要
本發明涉及病毒基因表達的調節。本發明涉及利用基因的有義和反義RNA片段改變病毒基因在細胞中表達的方法。有義和反義RNA片段能夠配對并形成雙鏈RNA分子，從而改變基因的表達。本發明還涉及用本發明的方法獲得的細胞、植物或動物，其后代和產生的種子。優選的，這些細胞、植物或動物為病毒抗性或耐受的。
文檔編號C12N1/15GK101348785SQ20081021061
公開日2009年1月21日 申請日期2000年5月8日 優先權日1999年5月10日
發明者P·B·赫菲茨, D·A·帕頓, J·Z·萊文, Q·曲越, 哈恩 P·T·德, J·J·L·吉雷恩 申請人:辛根塔參與股份公司