專利名稱：用于多基因表達的載體的制作方法
用于多基因表達的載體
本發明涉及改造用于獨立表達多個目的核苷酸序列的重組載體，其中所述目的核苷酸序列獲得自同一種生物體或從密切相關的生物體。本發明涉及在多種原核及真核體外系統或在動物或人類對象中表達彼此顯示同源性的多個核苷酸序列用于治療或預防性目的重組核酸技術領域。本發明特別用于免疫治療領域，尤其用于治療或預防因感染性生物如乳頭狀瘤病毒和肝炎病毒所致的病理狀況。
重組DNA技術己經使得在培養的宿主細胞或在活生物中表達核苷酸序列成為可能。已經產生幾種質粒DNA和病毒載體并用于多種目的，包括免疫接種、基因治療、免疫治療和在培養的細胞中表達。載體如腺病毒的和痘病毒載體具有容納巨大克隆容量的優點，具有在類型廣泛的宿主細胞中表達多個核苷酸序列的潛能。表達多個核苷酸序列可以有利于改善由所編碼的多肽提供的治療效力(例如聯合體液免疫及細胞免疫)。有利的是產生單個重組載體，而非產生分別改造以表達每種想要的核苷酸序列的多個重組載體，至少對于生產步驟和行政批準而言是有利的。
例如，就乳頭狀瘤病毒感染而言，有意義的將是表達來自幾種乳頭狀瘤病毒基因型的免疫原性多肽，旨在拓寬或增強宿主的免疫應答，尤其在面臨多重感染(例如HPV-16和HPV-18)風險的對象中。然而，編碼此類免疫原性多肽的核苷酸序列在相關HPV基因型之間是高度同源的。例如，在核苷酸水平顯示63%的整體同源性的HPV-16 E6和HPV-18 E6序列反而包含具有超過75 %極高同源性的可以危及從單個載體表達HPV-16和HPV-18基因的特殊區域。
另外，當表達病毒源多肽時，同源核苷酸序列也可以因病毒基因組的整體組織作用而產生。病毒通過生物學機制(如內部翻譯起始或移碼)使用相同核苷酸序列來編碼兩種不同蛋白質是相當頻繁的，例如相同DNA的序列在多于一個可讀框中翻譯。例如，在HPV-16基因組中，毗鄰的E1和E2基因具有59個核苷酸的重疊區，其在不同的可讀框中被翻譯。換句話說，El基因的最后59個核苷酸與E2基因的頭59個核苷酸重疊。然而，預期載體中同源序列的存在不利地影響載體的穩定性，尤其在載體生產步驟期間，這導致基因序列丟失，原因在于同源序列之間出現的
重組事件。因此，在單個載體中表達HPV-16E1和E2基因涉及59個核苷酸共同部分的存在，其中所述共同部分可能潛在地造成同源重組事件并且最終造成El與E2同源序列之間所包含的序列丟失。這類不希望的同源重組事件也可以在相同載體中表達HPV-16和HPV-18基因序列時發生。這種不穩定性問題可以導致載體原液不可用，尤其對于人類臨床試驗而言。
在這個方面，W092/16636提出將同源核苷酸序列以彼此相反的方向插入重組載體中，從而降低重組事件的可能性。然而，該策略是就痘苗病毒載體進行描述的，沒有對其他重組載體(如腺病毒)進行描述。另外，以相反方向排列并非總是可能的，原因在于可能的啟動子干擾和構建限制。
本領域需要產生能夠在宿主細胞或對象中表達從同一種生物體或從密切相關的生物體所獲得的核苷酸序列的重組載體，其中所述生物在天然環境下含有高度同源的部分。本發明通過提供一種新策略滿足這種需求，所述策略被設計為旨在以如下方式使重組事件的可能性最小化，即利用遺傳密碼的簡并性改變同源核苷酸序列兩者之一或兩者以使得它們的同源性比修飾前更少，同時不改變或不顯著改變所編碼的氨基酸序列。本發明允許避開同源重組的有害作用，其中所述有害作用可以在同源序列之間出現，尤其在載體生產步驟期間，并且導致同源序列之間所含有的核苷酸序列丟失。已經發現本發明的載體在表達天然環境下共同擁有59個核苷酸的100%同源部分的El和E2乳頭狀瘤病毒基因方面出人意料地有效并且在載體生產步驟期間出人意料地穩定。還發現本發明的載體在表達從密切相關的HPV-16和HPV-18基因型中獲得的E6和E7基因方面出人意料地有效。
這個技術問題通過提供如權利要求書中定義的實施方案加以解決。本發明的其他和另外方面、特征和優點將因以下對本發明當前優選實施方案的描述而顯而易見。這些實施方案出于公開目的給出。
因此，在第一方面，本發明提供載體，其至少包含編碼第一多肽的第一核酸分子和編碼第二多肽的第二核酸分子，其中
-所述第一和第二核酸分子分別獲得自第一和第二天然核酸序列，其中所述第一和第二天然核酸序列在一40個或更多個連續核苷酸的部分顯示大約80%或大于80%的同源性百分比，禾口
-在該載體中包含的所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修飾，以使得所述的同源性百分比減低至小于75%。
如整個申請書范圍內通篇所用，術語"一("a"和"an")"以如此含義使用，從而它們意指所指向的化合物或步驟的"至少一個"、"至少第一個"、"一個或多個"或"多個"，除非上下文另外申明。例如，術語"一細胞"包括多個細胞，包括其混合物。
如論在本文中何處使用，術語"和/或"包括"和"、"或"和"與該術語相聯的要素的全部或任何其他組合"的意思。例如，"第一核酸分子和/或第二核酸分子"意指第一核酸分子或第二核酸分子或第一以及第二核酸分子。
如本文中所用的術語"約"或"大約"意指在給定值或區間的5%范圍內，優選在4%范圍內并且更優選在2%范圍內。如本文中所用，當用來定義產物、組合物和方法時，術語"包括"意圖指該產品、組合物和方法包括所指的組分或步驟，但不排除其他組分或步驟。"基本上由......組成"應當指排
除任何具有重要意義的其他組分或步驟。因此，基本上由所提及組分組成的組合物將不排除痕量雜質和可藥用載體。"由......組成"應當指將其他組
分或步驟的更多痕量要素排除。例如，當多肽不含有除所提及氨基酸序列之外的任何氨基酸時，則該多肽"由一個氨基酸序列組成"。當多肽"基本上由一個氨基酸序列組成"時，這種氨基酸序列僅連同幾個額外氨基酸殘基，一般連同約1個至約50個或左右的額外殘基一起存在。多肽"包含"一個氨基酸序列，當該氨基酸序列至少是此多肽的最終氨基酸序列的部分時。此種多肽可以具有幾個直至幾千個額外的氨基酸殘基。此類額外的氨基酸殘基可以在多肽轉運方面發揮作用、促進肽產生或純化、延長半壽期及其他作用。同理可以適用于核苷酸序列。
如本文中所用，"載體"可以是能夠送遞并在宿主細胞或對象中表達至少第一和第二核酸分子的任意介質。載體可以是染色體外的(例如附加體)或整合的(用于并入宿主染色體)、自主復制或非自我復制的，多拷貝或低拷貝的，雙鏈或單鏈的、裸露的或與其他分子復合的(例如與脂質或聚合物復合以形成顆粒結構(如脂質體、脂質復合體或納米粒子)的載體、包裹在病毒衣殼內的載體和固定在固相粒子上的載體等)。術語"載體，，的定義也包括已經被修飾以允許偏好地靶向特定宿主細胞的載體。靶向載體的一個特征性 特點是在其表面存在配體，其中所述配體能夠識別并結合至細胞的且表面
暴露的組分如細胞特異性標記(例如HPV感染的細胞)、組織特異性標記或 腫瘤特異性標記。該配體可以被遺傳地插入在載體表面存在的多肽中(例 如，如WO94/10323和WO02/96939中描述的腺病毒纖突、五鄰體、pIX或 如EP 1 146 125中描述的痘苗病毒p14基因產物)。
在本發明的上下文中，術語"核酸"、"核酸分子"、"多核苷酸"和"核苷 酸序列"以互換方式使用并且定義了多脫氧核糖核苷酸(DNA)或多核糖核 苷酸(RNA)分子或其任意組合的任意長度的聚合物。該定義包括單鏈或雙 鏈的、線性或環狀的、天然存在的或合成性核苷酸。另外，此類多核苷酸 可以包含非天然存在性核苷酸(例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物，如US 5,525,711、 US 4，711,955或EPA 302 175中所描述的那些)以及化學修飾(例 如見WO 92/03568; US 5,118,672)，以提高核酸的體內穩定性、增強其送 遞或減低從宿主對象中的清除速率。若存在，可以在聚合之前或之后賦予 修飾。
術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中以互換方式用來指包含由肽鍵連 接的9個或更多個氨基酸的氨基酸殘基聚合物。該聚合物可以是線性或環 狀的。在本發明的上下文中，"多肽"可以包含作為L立體異構物(天然存在 形式)或D立體異構物的氨基酸并且可以包含除20種天然存在性氨基酸之 外的氨基酸，如(3-丙氨酸、鳥氨酸或甲硫氨酸亞砜或在一個或多個a-氨基、 a-羧基或側鏈上被修飾(例如通過附接甲基、甲酰、乙酰基、糖基、磷酸基 等)的氨基酸。作為一般提示，若氨基酸聚合物長(例如多于50個氨基酸殘 基)，則它優選稱作多肽或蛋白質。因此，"肽"指約9個至約50個氨基酸長 度的片段。在本發明的上下文中，肽優選地包含天然存在性(或天然)蛋白質 的所選區域，例如含有表位的其免疫原性片段。
如本文中定義的術語"多肽"包括天然多肽以及修飾的多肽。如本文中 所用，術語"天然"指從自然界來源中回收的區別于由人在實驗室中以人工 方式修飾或改造的材料。例如，天然多肽由存在于野生型生物或細胞的基 因組中的基因編碼。相反，修飾的多肽由這樣的核酸分子編碼，其中所述 核酸分子已經在實驗室中被修飾，從而與天然多肽的區別在于例如一個或 多個氨基酸的插入、缺失或置換或這些可能性的任意組合。當構思了幾個
10修飾時，它們可以涉及連續殘基和/或非連續殘基。由本發明構思的修飾的 實例可以導致由該天然多肽顯示的生物活性的改變。可以通過常規方法， 如通過結構性和功能性分析法，鑒定對給定生物學活性關鍵的氨基酸，并 且本領域技術人員可以輕易地確定能夠減低或取消這種生物學活性的突變 類型。此類修飾可以通過常規技術如位點定向誘變法進行。備選地，可以 通過化學合成在自動化過程中產生編碼修飾的多肽的合成性核酸分子(例 如，如所附實施例部分中所述，從重疊的合成性寡核苷酸中裝配出來)。
如本文中所用的術語"獲得"指從自然界中找到、分離、純化或衍生的 材料。"分離"意指從其自然環境中移出。"純化"指該材料基本上不含與其 天然關聯的至少一種其他組分。"衍生"指與天然材料相比的一個或多個修 飾(尤其突變，如置換、缺失和/或插入)。分離、純化和修飾技術在本領域 中是常規的并且取決于待獲得的材料(例如從自然界的一個來源克隆核酸
分子可以通過使用限制性酶、通過PCR或通過化學合成進行)。
如本文中所用，術語"同源性"通常表述百分比并且指在至少40個連續 核苷酸(例如大約40、 45、 50、 55、 57、 58、 59、 60、 70或甚至更多個連 續核苷酸)部分的范圍內彼此仍保留給定程度的相同性的核苷酸序列。"至 少80%"指大約80°/。或大于80% (例如超過80%的任意值，有利地至少85%， 合意地至少87%，優選至少90%，更優選至少95%，仍更優選少97%至多 到100%的序列同源性)。"小于75%"指低于75的任意值，例如大約74、 72、 70、 68、 65、 62、 60%或甚至更小。兩個核苷酸序列之間的同源性百分比 是由所述序列共有的相同位置數目的函數，同時考慮了需要導入用于最佳 比對的空位數和每個空位的長度。在本領域中多種計算機程序和數學算法 可用于確定核苷酸序列之間的相同性百分比，如GCG Wisconsin軟件包和 在國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)可公開獲得并在印刷出版物中描述(例如Altschul等人，1990, J. Mol. Biol. 215， 403-410)的基本局部比對搜索工具(BLAST)程序。
作為起點，可以使用第一和第二核酸分子之間在修飾之前的序列比對 結果，旨在揭示共同擁有80%或大于80%同源性百分比的具有40個或更多 個連續核苷酸的一個或多個部分，例如"同源"部分。在具體實施方案，至 少在40個或更多個(例如大約40、 45、 50、 55、 57、 58、 59、 60、 70個或 甚至更多個)連續核苷酸的所述同源部分中修飾第一核酸分子或第二核酸分子或第一以及第二核酸分子的密碼子使用模式(例如借助密碼子使用模
式的簡并性)，以使得所述的同源性百分比減低至小于75% (例如大約74、 72、 70、 68、 65、 62、 60%或甚至更小)。
盡管甲硫氨酸和色氨酸殘基各自由獨特的核酸三聯體(例如密碼子)編 碼，然而可以使用不同的密碼子來編碼其余18種氨基酸(遺傳密碼的簡并 性)。例如，氨基酸由以下密碼子編碼丙氨酸(Ala或A)由密碼子GCA、 GCC、 GCG和GCU編碼；半胱氨酸(C或Cys)由密碼子UGC和UGU;天 冬氨酸(D或Asp)由密碼子GAC和GAU編碼；谷氨酸(E或Glu)由密碼子 GAA和GAG編碼；苯丙氨酸(F或Phe)由密碼子UUC和UUU編碼；甘氨 酸(G或Gly)由密碼子GGA、 GGC、 GGG禾卩GGU編碼；組氨酸(H或His) 由密碼子CAC和CAU編碼；異亮氨酸(I或Ile)由密碼子AUA、 AUC和 AUU編碼；賴氨酸(K或ys)由密碼子AAA和AAG編碼；亮氨酸(L或Leu) 由密碼子UUA、 UUG、 CUA、 CUC、 CUG和CUU編碼；甲硫氨酸(M或 Met)密碼子AUG編碼；天冬酰胺(N或Asn)由密碼子AAC和AAU編碼； 脯氨酸(P或Pro)由密碼子CCA、 CCC、 CCG和CCU編碼；谷氨酰胺(Q或 Gln)由密碼子CAA和CAG編碼；精氨酸(R或Arg)由密碼子AGA、 AGG、 CGA、 CGC、 CGG和CGU編碼；絲氨酸(S或Ser)由密碼子AGC、 AGU、 UCA、 UCC、 UCG和UCU編碼；蘇氨酸(T或Thr)由密碼子ACA、 ACC、 ACG和ACU編碼；纈氨酸(V或Val)由密碼子GUA、 GUC、 GUG和GUU 編碼；色氨酸(W或Trp)由密碼子UGG編碼和酪氨酸(Y或Tyr)由密碼子 UAC和UAU編碼。
減低在所述第一和第二核酸分子內存在的一個或多個同源部分中的同 源性百分比可以通過利用遺傳密碼的簡并性并修飾第一核酸分子和/或第 二核酸分子中的密碼子使用模式實現。修飾密碼子使用模式一般通過將一 個或多個"天然性"密碼子替換為另一個密碼子來進行。例如，將編碼Arg 的AGA密碼子替換為編碼Arg的CGC密碼子會降低密碼子的3個位置中 2個位置的同源性。不需要簡并全部天然密碼子，因為可以用局部替換充分 地減低同源性。另外，修飾密碼子使用模式可以在整個核酸分子范圍內進 行或可以限定于在修飾前存在的同源部分。希望地是，在本發明的上下文 中，簡并性在第一核酸分子中進行并且限定于同源部分。優選地，在核苷 酸水平修飾密碼子使用模式并且所述修飾是在氨基酸水平上沉默的，例如，相同氨基酸的密碼子，以致此 類修飾在編碼的多肽中不翻譯。更優選地，當可能時，以這樣的方式修飾
密碼子使用模式，以致將第一和第二核酸分子之間的同源部分限制在小于9 個或8個連續核苷酸，有利地至小于7個連續核苷酸，優選地至小于6個 連續核苷酸，并且更優選至小于5個連續核苷酸。對密碼子使用模式的修 飾可以通過本領域技術人員已知的眾多方式進行，如位點定向誘變(例如使 用法國Amersham， Les Ullis的SculptorTM體外誘變系統)、PCR誘變、DNA 改組和通過化學合成技術(例如產生合成性核酸分子)。
當本發明的載體包含多于兩種核酸分子時，則可以修飾在該載體中所 包含的從天然核酸序列獲得的任意核酸分子(其中所述天然核酸序列在一 40個或更多個連續核苷酸的部分與從中獲得另一個核酸分子的至少一個其 他天然核酸序列顯示大約80%或大于80%的同源性百分比)，以使得所述的 同源性百分比減低至小于75%，即使得該載體中所包含的核酸分子對無一 會包含顯示大于75%的相同性百分比的40個或更多個連續核苷酸部分。
可以使用從中獲得所述核酸分子的每個(每對)天然性序列之間的序列 比對結果，旨在揭示出顯示80%或大于80%同源性百分比的一個或多個部 分。隨后，修飾一個或多個天然序列的序列，尤其通過簡化密碼子使用， 從而減低至少同源部分中的同源性百分比至小于75%。最后，該載體中所 包含的核酸分子均應當不包含與所述載體中所包含的任何其余核酸分子顯 示大于75%相同性百分比的40個或更多個(例如45、 50、 55、 57、 58、 59、 60、 70或甚至更多個)連續核苷酸部分。
如上所述，由該載體中包含的核酸分子編碼的多肽可以具有或可以不 具有與天然多肽相同的氨基酸序列。尤其，除了使用簡并密碼子以致于至 少在核酸分子的同源部分中減低同源性的突變之外，該載體中所包含的所 述核酸分子也可以包含導致或不導致修飾所編碼多肽的氨基酸序列的額外 突變。
本發明的載體包括病毒載體以及非病毒載體(例如質粒DNA)。合適的 非病毒載體包括質粒如pREP4、pCEP4 (Invitrogene)、pCI (Promega)、pCDM8 (Seed， 1987, Nature 329， 840)、 pVAX禾口 pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi等人，2002, J. Virol. 76， 12735-12746)。"病毒載體"在本文中根據 本領域認可的意思使用。它指包含病毒來源的至少一個元件的任意載體，所述的元件包括完整病毒基因組、其部分或如下文所述的修飾的病毒基因 組以及其產生的病毒粒子(例如包裹到病毒衣殼中以產生感染性病毒粒子 的病毒載體)。本發明的病毒載體可以是復制型的或可以是遺傳上失能的， 從而是復制缺陷型的或復制受損的。如本文中所用的術語"有復制能力"包 括選擇復制型和條件復制型病毒載體，其中所述病毒被改造成在特定宿主 細胞(例如腫瘤細胞)中更好地或選擇性地復制。病毒載體可以從多種不同的
病毒獲得并且尤其從選自由逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、痘 病毒、皰疹病毒、麻疹病毒和泡沫病毒組成的組中的病毒獲得。
在一個實施方案中，本發明的載體是腺病毒載體(綜述，見"Adenoviral vectors for gene therapy", 2002,編輯D. Curid禾卩J. Douglas, Academic Press)。它可以從任意的人或動物腺病毒衍生。可以在本發明的環境中使用 任意的血清型和亞群。可以更具體地提及亞群A (例如血清型12、 18和31)、 亞群B(例如血清型3、 7、 11、 14、 16、 21、 34和35)、亞群C (例如血清 型l、 2、 5和6)、亞群D (例如血清型8、 9、 10、 13、 15、 17、 19、 20、 22-30、 32、 33、 36-39和42-47)、亞群E (血清型4)和亞群F (血清型40和 41)。特別優選的是人腺病毒2 (Ad2)、 5 (Ad5)、 6 (Ad6)、 11 (Adl 1)、 24 (Ad24) 和35 (Ad35)。此類腺病毒從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.))可獲得并且已經是描述其序列、 組織和產生方法的無數出版物的主題，因而允許技術人員使用它們(見例如 US6，133,028; US6,110，735; WO02/40665; WO00/50573; EP 1016711; Vogels等人，2003, J. Virol. 77, 8263-8271)。
本發明的腺病毒載體可以是復制型的。復制型的腺病毒載體的眾多實 例是本領域技術人員輕易可得的(見例如Hemandez-Alcoceba等人，2000， Human Gene Ther. 11， 2009-2024; Nemunaitis等人，2001,Gene Ther. 8, 746-759; Alemany等人，2000， Nature Biotechnology 18， 723-727; WO00/24408 ; US5,998，205, WO99/25860, US5，698,443, WO00/46355, WO00/15820和WO01/36650)。
備選地，本發明的腺病毒載體可以是復制缺陷型的(見例如 W094/28152)。優選的復制缺陷型腺病毒載體是El缺陷的(例如US 6,136,594和US 6,013,638)，其中El缺失從大約第459位置延伸至第3328 位置或從大約第459位置延伸至第3510位置(通過參考在GeneBank中以登錄號M73260并在Chroboczek等人，1992， Virol. 186, 280-285中披露的人 腺病毒5型的序列)。可以通過缺失腺病毒基因組的額外部分(例如在非必需 E3區域或在其他必需E2、 E4區域中，如Lusky等人，1998, J. Virol 72, 2022-2032中所述)進一步改善克隆容量和安全性。
第一和第二核酸分子可以獨立地插入本發明腺病毒載體的任意位置 中，如Chartier等人(1996， J. Virol. 70, 4805-4810)中描述，并且相對于插入
區域的天然轉錄方向在有義和/或反義方向上獨立地安置。例如，它們可以 被同時插入而替代E1區域，或備選地，插入一個核酸分子替代El區域并 且插入另一個核酸分子替代E3區域。
在另一個實施方案中，本發明的載體是痘病毒載體(見例如Cox等人 "Viruses in Human Gene Therapy"中，J. M. Hos編輯，Carolina Academic Press)。該載體可以從痘病毒科(poxviridae)的任意成員、尤其金絲雀痘病毒 (例如，如W095/27780中所述的ALVAC)、禽痘病毒(例如，如Paoletti等 人，1995， Dev. Biol. Stand. 84， 159-163中所述的TROVAC)或痘苗病毒獲得， 優選后者。合適的痘苗病毒可以選自由從選自由哥本哈根株(Goebel等人， 1990， Virol. 179, 247-266禾卩517-563; Johnson等人，1993, Virol. 196， 381-401)、 Wyeth株、NYVAC(見W092/15672和Tartaglia等人，1992， Virology 188, 217-232)和高度減毒的改良Ankara (MVA)株(Mayr等人，1975, Infection 3, 6-16)構成的組。此類載體和產生方法在本領域技術人員可獲得 的眾多文獻中描述(例如Paul等人，2002， Cancer gene Ther. 9， 470-477; Piccini等人，1987， Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4,769,330; US 4,772,848; US 4,603,112; US 5,100,587和US 5，179，993)。在本發明中 使用的第一和第二核酸分子優選地插入痘病毒基因組的非必需基因座中， 旨在重組痘病毒仍保持活力和感染性。非必需區域是非編碼的基因間區或 其失活或缺失不明顯破壞病毒生長、復制或感染的任意基因。也可以構思 在病毒必需基因座中的插入，只要在病毒粒子產生期間提供缺損功能，例 如通過使用攜帶互補序列的輔助細胞系，其中所述互補序列與痘病毒基因 組中所缺失的那些序列相對應。
當使用哥本哈根痘苗病毒時，至少第一和第二核酸分子優選地插入胸 苷激酶基因(tk)中(Hruby等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80， 3411-3415; Weir等人，1983, J. Virol. 46， 530-537)。然而，其他插入位點也是適合的，例如在血凝素基因(Guo等人，1989,J. Virol. 63， 4189-4198)中、 在KIL基因座中、在u基因中(Zhou等人，1990, J. Gen. Virol. 71， 2185-2190) 或在痘苗病毒基因組的左側端，其中己經在文獻中報道了在左側端的多種 自發或工程化缺失(Altenburger等人，1989, Archives Virol. 105， 15-27; Moss 等人，1981， J. Virol. 40， 387-395; Panicali等人，1981， J. Virol. 37， 1000-1010; Perkus等人，1989， J， Virol. 63， 3829-3836; Perkus等人，1990, Virol. 179， 276-286; Perkus等人，1991， Virol. 180， 406-410)。
當使用MVA時，可以在MVA基因組中存在的已鑒定的缺失I至VII 的任一者中以及在D4R基因座中獨立地插入至少第一和第二核酸分子 (Antoine等人，1998， Virology 244, 365-396)，不過優選在缺失II和/或III 中的插入(Meyer等人，1991, J. Gen. Virol. 72， 1031-1038; Sutter等人，1994, Vaccine 12， 1032-1040)。
當使用禽痘病毒時，盡管可以考慮在胸苷激酶基因中插入，然而至少 第一和第二核酸分子優選地導入位于ORF7和9之間的基因間區內(見例如 EP 314 569和US 5,180,675)。
在本發明的另一個實施方案中，至少第一和第二核酸分子獨立地編碼 能夠在表現或易于表現病理狀況的對象中提供治療活性或保護活性的多 肽。如本文中所用的術語"對象"指脊椎動物，特別是哺乳動物物種的成員， 尤其是家養動物、牲畜、體育動物和包括人在內的靈長類。此種多肽優選 地選自由免疫原性多肽和抗腫瘤多肽組成的組。
"免疫原性"多肽指這樣的多肽，所述多肽能夠在表達該多肽的對象中 誘導、刺激、發育或促進免疫系統。這種免疫應答可以是體液應答或細胞 應答或體液應答和細胞應答。體液應答激發針對所討論多肽的抗體產生， 而細胞應答激發T-輔助細胞和/或CTL應答和/或刺激細胞因子產生。 一般， 可以通過本領域中作為標準的多種測定法體外或體內地評價多肽的免疫原 屬性(對可用于評價免疫應答的啟動和激活的技術的一般描述，見例如J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health編輯的Coligan等人，Current Protocols in Immunology最新版)。例如，檢測可以是比色法、熒光測定或 放射法，并且合適的技術包括ELISA、蛋白質印跡法、放射免疫測定法和 免疫沉淀測定法。細胞免疫的測量可以通過測量由激活的效應細胞(包括從 CD4+和CD8+T-細胞衍生的那些效應器細胞)分泌的細胞因子譜(例如通過ELIspot量化產生IFNy的細胞)、通過確定免疫效應細胞的激活狀態免疫(例 如借助傳統[3印胸苷攝取的T細胞增殖測定法)、通過分析致敏對象中的抗 原特異性T淋巴細胞(例如在細胞毒性測定法中的肽特異性裂解)進行。多 肽的免疫原屬性也可能在合適的動物模型中通過ELIspot、基于四聚物的分 析技術或用于分析T細胞介導的免疫的其他標準技術評價。合適的免疫原 性多肽可以從乙型肝炎病毒(HBV)(如EP 414 374; EP 304 578或EP 198 474 中描述的S、 preS2或preSl-多肽)；丙型肝炎病毒(HCV)(例如Core (C)、包 膜糖蛋白E1、 E2、非結構多肽NS2、 NS3、 NS4,或NS5或其任意組合)； 人免疫缺陷病毒(HIV)(例如gpl20或gpl60)和乳頭狀瘤病毒(如此后所述) 獲得。
"抗腫瘤"多肽指能夠導致抑制或凈縮減腫瘤細胞擴張的多肽。多肽的 抗腫瘤屬性可以在適宜的動物模型中或在治療的對象中由實際腫瘤大小在 一段時間后縮小而確定。多種方法可以用來估計腫瘤腫瘤大小，所述方法 包括放射學方法(例如，單光子和正電子發射計算機斷層攝影術；通常見 "Nuclear Medicine in Clinical Oncology", Winkler, C.(編輯)Springer畫Verlag, New York, 1986)，使用常規成像試劑(例如檸檬酸鎵-67)的方法、免疫學方 法(例如放射標記的針對特定腫瘤標記的單克隆抗體)以及超聲波方法(見 "Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff禾口 Fukuda，(編輯)， Igaku-Shoin， New York, 1984)。備選地，可以基于腫瘤標記存在的減少而確 定多肽的抗腫瘤屬性。實例包括用于檢測前列腺癌的PSA和用于檢測結直 腸癌和某些乳腺癌的CEA。另外，可以在合適的動物模型中，例如使用以 代表性人癌細胞系注射的小鼠，確定多肽的抗腫瘤屬性。在明顯的腫瘤已 經發育后，用本發明的載體注射小鼠，并隨后監測腫瘤生長速率的降低和 存活增加。另外，多種體外方法可以用來預測體內腫瘤抑制作用。合適的 抗腫瘤多肽包括腫瘤相關抗原(TAA)如MUC-I(WO92/07000; Acres等人， 2005， Exp. Rev. Vaccines 4(4))、 BRCA-I、 BRCA-2(Palma等人，2006， Critical Reviews in Oncology/haematology 27， 1-23)、癌胚抗原CEA(Conroy等人， 1995，Gene Ther; 2， 59-65)、 MAGE (WO99/40188; De Plaen等人，1994， Immunogenetics 40, 360-369)、 MART-I、 gpl00 (Bakker等人，1994, J. Exp. Med. 179， 1005-9)、 PRAME、 BAGE、 Lage (又稱作NY Eos 1)、 SAGE、 HAGE (WO99/53061)、 GAGE (Robbins禾口 Kawakami, 1996. Current Opinions inImmunol, 8， 628-36)和前列腺特異性抗原(PSA)(Ferguson等人，1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96， 3114-9; WO98/12302, WO98/20117和WOOO/04149)
以及來自具有腫瘤誘導潛能的病毒(例如乳頭狀瘤病毒)中的病毒多肽。
在本發明的另一個實施方案中，所述至少第一和第二核酸分子從同一 種生物體或從密切相關的生物體獲得。
如本文中所用，術語"生物體"包括微生物，其優選地具有致病潛能， 以及高等真核生物。術語"微生物"指真菌、細菌、原蟲和病毒。病毒的代 表性實例包括，而不限于HIV (HIV-I或HIV-2)、人皰疹病毒(例如HSV1 或HSV2)、巨細胞病毒(CMV)、 Epstein Barr病毒(EBV)、肝炎病毒(例如甲 型肝炎病毒(HAV)、 HBV、 HCV和戊型肝炎病毒)、黃病毒(例如黃熱病毒)、 帶狀皰疹病毒(VZV)、副粘病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒、 流感病毒和乳頭狀瘤病毒(如上文定義)。合適細菌的代表性實例包括，不限 于奈瑟氏菌屬(Neisseria)(例如淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏 菌(N. meningitidis));博德特菌屬(Bordetella)(例如百日咳博德特菌(B. pertussis)、副百日咳博德特菌(B. parapertussis)和支氣管炎博德特菌(B. bronchiseptica))、分枝桿菌屬(Mycobacteria)(例如結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、牛分枝桿菌(M. bovis)、麻風分枝桿菌(M. leprae)、鳥分枝桿 菌(M. avium)、副結核分枝桿菌(M. paratuberculosis)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis));軍團菌屬(Legionella)(例如嗜肺軍團菌(L. pneumophila));埃細 氏菌屬(Escherichia)(例如腸毒性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大 腸桿菌)；志賀氏菌屬(Shigella)(例如宋內志賀氏菌(S. so皿ei)、痢疾志賀氏 菌(S. dysenteriae)、福氏志賀氏菌(S. flexneri));沙門氏菌屬(Salmonella)(例 如傷寒沙門氏菌(S. typhi)、副傷寒沙門氏菌(S. paratyphi)、豬霍亂沙門氏菌 (S. cholemesuis)、腸炎沙門氏菌(S. enteritidis));李斯特菌屬(Listeria)(例如 單核細胞增多李斯特菌(L. monocytogenes));螺桿菌屬(Helicobacter)(例如幽 門螺桿菌(H. pylori));假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa));葡萄球菌屬(Staphylococcus)(例如金黃色葡萄球菌(S. aureus)、 表皮葡萄球菌(S. epidermidis));腸球菌屬(Enterococcus)(例如糞腸球菌(E. faecalis、屎腸球菌(E. faecium));芽孢桿菌屬(Bacillus)(例如炭疽芽胞桿菌(B. anthmcis));棒狀桿菌(Corynebacterium)(例如白喉桿菌(C. diphtheriae))和衣 原體(Chlamydia)(例如沙眼衣原體(C. trachomatis)、肺炎衣原體(C.
18pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(C. psittaci))。寄生蟲的代表性實例包括，不限 于瘧原蟲屬(Plasmodium)(例如惡性瘧原蟲(P.falciparum));弓形蟲屬
(Toxoplasma)(例如剛地弓形蟲(T.gondii));利什曼原蟲(Leshmania)(例如碩大 利什曼原蟲(L.major));肺囊蟲屬(Pneumocystis)(例如卡氏肺囊蟲(P.carinii)) 和血吸蟲屬(Schisostoma)(例如曼氏血吸蟲(S.mansoni))。真菌的代表性實例 包括，不限于假絲酵母屬(Candida)(例如白色假絲酵母(C.albicans))和曲霉屬 (Aspergillus)。高等真核生物優選地是包括人的哺乳動物。
"同一種生物體"定義為源自共同祖先并已經遵循相同進化途徑的生 物。代表性實例包括具有相同血清型或基因型的多種病毒分離株。例如， 將兩個HPV-16分離株劃分在這個類別中。"密切相關的生物體"定義為源自 共同祖先但在進化期間已經趨異的生物。代表性實例包括具有不同血清型 或基因型的病毒。例如，將HPV-16和HPV-18劃分在這個類別中。
在優選的實施方案中，從中獲得至少第一和第二核酸分子的生物體是 乳頭狀瘤病毒并且每種核酸分子編碼一種乳頭狀瘤病毒多肽。"乳頭狀瘤病 毒"可以定義為屬于乳頭狀瘤病毒亞科的病毒并且該術語包括非人物種來 源的動物乳頭狀瘤病毒以及人乳頭狀瘤病毒(HPV)，其中所述非人物種包 括，但不限于牛、馬、兔、綿羊、犬、非人靈長類和嚙齒類。目前已經鑒 定了多于100種HPV基因型(VanRanst等人，1992， J. Gen. Virol. 73， 2653; De Villiers等人，2004, Virology 324, 17-27)，其中根據致瘤潛能，已經所述 基因型劃分為"低危"(LR)和"高危"(HR)血清型"。LR HPV在感染對象中引 起良性腫瘤，而HR具有惡性進展的高風險。
一般而言，乳頭狀瘤病毒具有一個被蛋白質衣殼包圍的約7900堿基對 雙鏈環狀DNA(見例如Pfister， 1987，在The papovaviridae: The Papillomaviruses, Salzman禾卩Howley編輯，Plenum Press, New York,第1-38 頁)。它們的基因組由三個功能區早期區(E)、晚期區(L)和長調控區(LCR) 組成。LCR含有轉錄調節序列如增強子和啟動子。晚期區編碼L1和L2結 構蛋白，它們分別是主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白，而早期區編碼在細胞 核中優勢存在的控制病毒復制、轉錄和細胞轉化的調節蛋白(E1-E7)。更具 體地，El蛋白是具有ATP依賴性解螺旋酶活性的DNA結合磷蛋白 (Desaintes禾口 Demeret, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 339-347; Wilson等人， 2002, Virus Gene 24， 275-290)。 E2蛋白是調節病毒基因轉錄并控制DNA復制的多功能性DNA結合磷蛋白(Bechtold等人，2003, J. Virol. 77， 2021-8)。 E4編碼的蛋白質結合并破壞細胞漿角蛋白網絡并在病毒成熟中發揮作用。 E5蛋白的功能仍存在爭論并且該蛋白質的表達往往在宿主染色體中病毒整 合期間喪失。HR HPV基因型的編碼E6和E7的基因產物往往參與感染細 胞的致瘤性轉化(Kanda等人，1988, J. Virol. 62, 610-3; Vousden等人，1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell等人，1987， J. Virol. 61, 3635-40)，假定通過這 些病毒蛋白分別與細胞腫瘤抑制蛋白基因產物p53和視網膜母細胞瘤(Rb) 蛋白的結合作用(這在B.N. Fields, D. M. Knipe和P.M. Howley (編輯), Virology,第3版.Lippincott-Raven Press, New York, N.Y中的Howley, 1996, Papillomaviruses and their replication,第2045-2076頁綜述)。參與天然 HPV-16 E6多肽與p53結合的氨基酸殘基已經清晰地定義為從第118至122 位殘基的(+l是首個Met殘基，或從優選使用的第二 Met殘基開始的從第 111至115位殘基)(Crook等人，1991, Cell 67, 547-556)并且參與天然HPV-16 E7多肽與Rb結合的那些氨基酸殘基位于第21至26位殘基(Mimger等人， 1989， EMBO J. 8, 4099-4105; Heck等人，1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 4442-4446)。
優選地，至少第一和第二核酸分子獨立地從選自由HPV-16、 HPV-1S、 HPV-30、 HPV-31、 HPV隱33、 HPV-35、 HPV誦39、 HPV-45、 HPV-51 、 HPV-52、 HPV-56、 HPV-58、 HPV-59、 HPV-66、 HPV-68、 HPV-70禾卩HPV-85組成
的組中的高危型乳頭狀瘤病毒獲得。
如本文中所用的"乳頭狀瘤病毒多肽"指由源自乳頭狀瘤病毒基因組/來 源的核酸分子編碼的本領域確認的多肽。如與術語"多肽"相關聯的上文定 義，"乳頭狀瘤病毒多肽"包括天然的、修飾的乳頭狀瘤病毒多肽和其肽。 乳頭狀瘤病毒來源包括，但不限于生物樣品(例如從已經暴露于乳頭狀瘤病 毒的對象中收集的生物樣品、組織切片、尸檢標本和組織培養物)、培養的 細胞(例如在ATCC獲得的CaSki細胞)以及在保藏機構、商業目錄中獲得 或在文獻中描述的重組材料。眾多乳頭狀瘤病毒基因組的核苷酸序列和所 編碼多肽的氨基酸序列已經在文獻中描述并且可在專業數據庫例如 Genbank中獲得。就一般信息而言，HPV-16基因組在Genbank中以登錄號 NC 01526和K02718描述；HPV-18以登錄號NC 001357和X05015描述； HPV-31以登錄號J04353描述；HPV-33以登錄號M12732描述；HPV-35以登錄號NC 001529描述；HPV-39以登錄號NC 001535描述；HPV-45以登錄號X74479描述；HPV-51以登錄號NC 001533描述；HPV-52以登錄號NC 001592描述；HPV-56以登錄號X74483描述；HPV-58以登錄號D90400描述；HPV-59以登錄號NC 001635描述；HPV-68以登錄號X67160和M73258描述；HPV-70以登錄號U21941描述并且HPV-85以登錄號AF131950描述。
由第一和/或第二核酸分子編碼的乳頭狀瘤病毒多肽可以是早期、晚期乳頭狀瘤病毒多肽或其任意組合。早期乳頭狀瘤病毒多肽包括El、 E2、E4、 E5、 E6禾卩E7，而晚期多肽可以是LI或L2。數目眾多的乳頭狀瘤病毒血清型的早期和晚期多肽的核苷酸和氨基酸序列在技術人員可獲得的文獻中描述。
希望是，至少第一和第二核酸分子獨立地編碼選自由El、 E2、 E6和E7組成的組中的早期多肽。出于說明目的，天然HPV-16 El、 E2、 E6和E7多肽的氨基酸序列分別在SEQIDNO:l-4中給出。然而，本發明不限于這些示例性序列。實際上，所述核苷酸和氨基酸序列可以在不同的乳頭狀瘤病毒分離株之間變動，并且本發明的范圍包括這種天然的遺傳變異以及非天然的修飾，如下文所述的那些修飾。在此后給出合適的修飾的乳頭狀瘤病毒多肽的示例描述(例如在SEQ ID NO:5-8和64-65中)，然而(例如，
針對源自其他乳頭狀瘤病毒基因型的多肽，通過序列比較)調整本文中所述的修飾，屬于本領域技術人員的能力范圍。
在本發明中使用的合適乳頭狀瘤病毒El多肽包括刺激病毒復制無效的突變體，即它們刺激病毒復制的能力在統計上顯著地低于相應的天然El多肽(例如小于75%,有利地小于50%，優選小于10%并且更優選小于5°/。)。對于一般指南而言，負責刺激病毒復制的結構域位于El的中央部分(例如Hugues和Romanos, 1993, Nucleic Acids Res.21, 5817-23)。在本領域技術人員可獲得的文獻中描述復制缺陷型El多肽的代表性實例，例如在Yasugi等人(1997， J. Virol 71， 5942-51)中。在本發明上下文中優選的修飾包括將HPV-16 El多肽第482位置處的Gly殘基置換為另一種殘基(優選置換為Asp殘基)(例如見SEQ ID NO:5)或將HPV-18 El多肽第489位置處的Gly殘基置換為另一種殘基(優選置換為Asp殘基)(例如見SEQ ID NO:6)。
在本發明中使用的合適E2多肽包括與天然E2多肽相比，在轉錄激活作用和/或復制活性方面缺陷的突變體(例如小于75%,有利地小于50%，優選地小于10%并且更優選地小于5%)。對于一般指南，負責轉錄激活作用和刺激復制的結構域位于E2的氨基末端部分(見dorf等人，1985， Virology,145,181-185; Kennedy等人，1991， J. Virol. 65, 2093-2097; Cole等人，1987,J. Mol.Biol. 193, 599-608; McBride等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,510-514)并且可以使用標準方法輕易地確定E2復制和轉錄活性的降低或缺乏(見例如Sakai等人，1996, J. Virol. 70, 1602-1611)。在本領域技術人員可獲得的文獻中描述用在本發明中的合適缺陷型E2突變體，例如在Demeret等人(1995, Nucleic Acids Res. 23, 4777-4784)、 Sakai等人(1996， J. Virol. 70,1602-1611)、 Brokaw等人(1996, J. Virology 70, 23-29)和Ferguson等人(1996，J. Virology 70， 4193-4199)中描述。在本發明上下文中優選的修飾包括將HPV-16 E2第39位置處的Glu殘基優選地置換為Ala殘基(E39A)和/或將第73位置處的lie殘基優選地置換為Ala殘基(I73A)(例如見SEQ ID NO:7)。出于說明目的，在HPV-16 E2的第39和73位置處的Glu和lie殘基分別對應于HPV-18 E2的第43和77位置處的Glu和lie殘基(例如見SEQ IDNO:8)。
在本發明中使用的合適E6多肽包括在與細胞的腫瘤抑制基因產物p53結合方面無效的非致瘤性突變體。非致瘤性E6多肽的代表性實例在例如Pirn等人(1994， Oncogene 9， 1869-1876)和Crook等人(1991， Cell 67， 547-556中描述。在本上下文中優選的修飾包括HPV-16 E6中殘基118至122(CPEEK)的缺失(例如見SEQ ID NO:64)或HPV-18 E6中113至117 (NPAEK)的缺失。
在本發明中使用的合適E7多肽包括在與細胞的腫瘤抑制基因產物Rb結合方面無效的非致瘤性突變體。非致瘤性E7多肽的代表性實例在例如Munger等人(1989, EMBO J. 8， 4099-4105)、Heck等人(1992， Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89， 4442-4446)和Phelps等人(1992, J. Virol. 66, 2148-2427)中描述。在本上下文中優選的修飾包括HPV-16 E7中殘基21至26 (DLYCYE)的缺失(例如見SEQ ID NO:65)或HPV-18 E7中24至28 (DLLCH)的缺失。
此外，由至少第一和/或第二核酸分子編碼的多肽(例如乳頭狀瘤病毒多肽)還可以包含額外的修飾，其中所述額外修飾有益于所編碼多肽的加工、穩定性和/或溶解度的額外修飾，例如阻抑潛在切割位點、阻抑潛在位點和/或呈遞在表達細胞的表面。例如，編碼的多肽可以包含錨定于表達細胞的
質膜內部的合適信號。實際上，先前已知膜呈遞作用改善了 I類MHC和/或II類MHC呈遞，從而導致宿主免疫系統識別作用增強(見例如WO99/0388)。由于天然的早期乳頭狀瘤病毒多肽(E1、 E2、 E6和E7)是細胞核蛋白質(盡管不能確切地鑒定到常見核定位信號)，可能有益的是使之定位在質膜處，旨在改善其免疫原潛力并且因此改善它們在宿主對象中的治療效力。
多肽在宿主表達細胞表面的高效膜呈遞可以通過將該多肽融合于信號肽和膜錨定肽來實現。此類肽是本領域已知的。簡而言之，信號肽通常存在于膜呈遞或分泌的多肽的氨基端并且啟動它們進入內質網(ER)。信號肽包含15至35個基本上疏水的氨基酸，所述氨基酸隨后由位于ER的特異性內肽酶去除以產生成熟的多肽。膜錨定肽通常是本質上高度疏水的并且起到將多肽錨定于細胞膜中的作用(見例如Bmnden和Tooze， 1991，在Introduction to Protein Structure中，第202-214頁，NY Garland)。可以在本發明上下文中使用的信號肽和膜錨定性肽的選擇是繁多的。它們可以獨立地從任意的分泌或膜錨定的多肽(例如細胞多肽或病毒多肽)如狂犬病病毒糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白獲得或可以是合成肽。插入信號肽的優選位點是用于翻譯起始的密碼子的氨基端下游并且插入膜錨定性肽的優選位點是是羧基端，例如緊鄰終止密碼子的上游。根據需要，可以使用接頭肽來將信號肽和/或膜錨定肽與編碼的多肽連接。
合適在本發明中使用的膜錨定性和缺陷型El多肽的代表性實例在SEQ ID NO:5 (定義如實施例部分中所述HPV-16 SS-E1*-TMR多肽)禾口在SEQ ID NO:6 (定義如實施例部分中所述HPV-18 SS-E1 *-TMF多肽)給出。合適在本發明中使用的膜錨定性和缺陷型E2多肽的代表性實例在SEQ IDNO:7 (定義如實施例部分中所述HPV-16 SS-E2*-TMR多肽)和在SEQ IDNO:8 (定義如實施例部分中所述HPV-18 SS-E2*-TMF多肽)給出。合適在本發明中使用的膜錨定性和非致瘤性E6和E7多肽的代表性實例分別在SEQID NO:64 (定義如實施例部分中所述HPV-16 SS-E6*-TMR多肽)和在SEQIDNO:65 (定義如實施例部分中所述HPV-16 SS-E7*-TMF多肽)給出。
在特別優選的實施方案中，至少第一核酸分子和第二核酸分子編碼從同一種HPV血清型中獲得的兩種不同乳頭狀瘤病毒多肽。
23在這個實施方案的優選方面，第一核酸分子編碼E1多肽并且第二核酸
分子編碼E2多肽或反之亦然。希望是，編碼El和E2的核酸分子從HPV-16 或從HPV-18獲得。優選地，第一核酸分子編碼包含SEQ ID NO:5所示的 氨基酸序列或基本上由該氨基酸序列組成、或由該氨基酸序列組成的多肽 并且第二核酸分子編碼包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或基本上由該 氨基酸序列組成、或由該氨基酸序列組成的多肽。優選地，第一核酸分子 編碼包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或基本上由該氨基酸序列組成、 或由該氨基酸序列組成的多肽并且第二核酸分子編碼包包含SEQ ID NO:8 所示的氨基酸序列或基本上由該氨基酸序列組成、或由該氨基酸序列組成 的多肽。
在天然環境(例如HPV-16或HPV-18基因組)中，編碼El的序列的3' 部分與編碼E2的序列的5'部分重疊59個核苷酸。預計這59個100%同源 核苷酸的存在不利地影響同時表達編碼El和E2的核酸分子的載體的穩定 性。同源重組可以在這些共同部分之間發生并且導致共同部分之間所含有 的核苷酸序列丟失。
根據本發明，在編碼El和E2的核酸分子中存在于修飾之前的59核苷 酸重疊部分之間的100%同源性可以通過在所述核酸分子之一中簡化密碼 子使用模式而減低至小于75%。簡并的序列的代表性實例在SEQ ID NO:9 中給出，其中在重疊59個核苷酸的El/E2內的同源性減低至69% (如
圖1 中所示)并且編碼HPV-16 El禾Q E2多肽的本發明優選載體包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。相同策略可以適用于HPV-18編碼El和E2的序 列中存在的重疊部分。可以在編碼E1的第一核酸分子中導入此類簡并的序 列以替換天然重疊的59個核苷酸(例如分別是SEQIDNO:10和11)。
因此，本發明的優選載體包含第一核酸分子，其中所述第一核酸分子 包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列(其編碼SEQ ID NO:5的HPV-16 El 多肽)或基本上由該核苷酸序列組成、或由該核苷酸序列組成；和第二核酸 分子，其中所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列(其編 碼SEQ IDNO:7的HPV-16 E2多肽)或基本上由該核苷酸序列組成、或由該 核苷酸序列組成。因此，本發明的另一個優選載體包含第一核酸分子，其 中所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:l 1所示的核苷酸序列(其編碼SEQ ID NO:6的HPV-18 El多肽)或基本上由該核苷酸序列組成、或由該核苷酸序列組成；和第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含SEQIDNO:13所示 的核苷酸序列(其編碼SEQ ID NO:8的HPV-18 E2多肽)或基本上由該核苷 酸序列組成、或由該核苷酸序列組成。更優選地，本發明的載體是MVA 載體，第一(編碼El的)核酸分子置于痘苗病毒7.5K啟動子的控制下并且第 二(編碼E2的)核酸分子在痘苗病毒H5R啟動子的控制下，并且第一和第二 核酸分子均插入所述MVA載體的缺失III中。
本發明也涉及載體，其中所述載體包含編碼HPV-16E1多肽的第一核 酸分子、編碼HPV-16E2多肽的第二核酸分子、編碼HPV-18E1多肽的第 三核酸分子和編碼HPV-18E2多肽的第四核酸分子，其中所述第一、第二、 第三和第四核酸分子不包含顯示75%或大于75%同源性百分比的40個或更 多個連續核苷酸的部分。優選地，所述HPV-16E1多肽包含SEQIDNO:5 所示的氨基酸序列，所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸 序列，所述HPV-18 El多肽包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列和/或所述 HPV-18 E2多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在天然環境中，編碼HPV-16和HPV-18 El的序列包含顯示80%或大 于80%同源性百分比的40個或更多個連續核苷酸的幾個部分。對于編碼 HPV-16和HPV-18 E2的序列而言也是如此。此外，毗鄰的編碼El和E2 的序列在HPV-16和HPV-18基因組中的一個大約59核苷酸的部分內重疊。 在這種情況下，建議修飾編碼的HPV-18 El和E2的核酸分子的序列，從 而減低與其HPV-16對應物的同源性至小于75%，尤其在兩種血清型共有 的同源部分中。為此目的，可以比對HPV-16和HPV-18E1和E2基因的核 苷酸序列并且可以在核苷酸水平設計修飾旨在減低同源性至小于8、 7、 6 或優選5個連續核苷酸。另外，可以進一步修飾HPV-18E1序列以減低與 重疊HPV-18 E2序列5'末端的59核苷酸部分的同源性至小于75%。優選地， 修飾了密碼子使用，但是所述修飾在氨基酸水平不翻譯，除了產生如本文 中定義的修飾之外，例如產生缺陷型酶功能的修飾。分別在SEQIDNO:ll 和SEQ ID NO:13中給出可以適宜地用作第三和第四核酸分子的編碼 HPV-18E1-和HPV-18E1的"簡并"核苷酸序列的代表性實例。13)。本發明 的優選載體包含第一核酸分子，其中所述第一核酸分子包含SEQIDNO:10 所示的核苷酸序列(其編碼SEQ ID NO:5所示的HPV-16 El多肽)或基本上 由該核苷酸序列組成、或由該核苷酸序列組成；第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列(其編碼SEQ ID NO:7 所示的HPV-16E2多肽)或基本上由該核苷酸序列組成、或由該核苷酸序列 組成；第三核酸分子，其中所述第三核酸分子包含SEQIDNO:ll所示的核 苷酸序列(其編碼SEQ ID NO:6所示的HPV-18 El多肽)或基本上由該核苷 酸序列組成、或由該核苷酸序列組成；和第四核酸分子，其中所述第四核 酸分子包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列(其編碼SEQ ID NO:8所示的 HPV-18 E2多肽)或基本上由該核苷酸序列組成、或由該核苷酸序列組成。 優選地，該載體是MVA載體，第一、第二、第三和第四核酸分子導入該 MVA載體的缺失III中，第一和第三(編碼E1的)核酸分子按照相反的方向 布置，各自處在痘苗病毒p7.5K啟動子的控制下，并且第二和第四(編碼E2 的)核酸分子按照相反的方向布置，各自處在痘苗病毒pH5R啟動子的控制 下。
在另一個特別優選的實施方案中，至少第一核酸分子和第二核酸分子 編碼從同一種HPV血清型(例如密切相關的HPV血清型如HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和/或HPV-52獲得的兩種不同的乳頭狀瘤病毒多肽。
在該實施方案的第一方面，從密切相關的生物體獲得的同一種多肽優 選地是E2多肽。編碼的E2多肽優選地被修飾，從而是膜錨定的并且對于 病毒復制無效，如本文中定義。在天然環境中，多種基因型的編碼E2的序 列在核苷酸水平顯示高度同源性，尤其在最保守的區域中。預計這些同源 序列的存在不利地影響共表達兩種或多種(例如3、 4種或甚至更多種)E2基 因(例如來自HRHPV(如HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和HPV-52)的E2基因) 的載體的穩定性。同源重組可以在這些共同部分之間發生并且導致共同部 分之間所含有的核苷酸序列丟失，并且因此導致基因沉默。
根據本發明，在本發明載體中包含的編碼E2多肽的核酸分子可以通過 簡化密碼子使用模式進行修飾，從而減低同源性至小于75%，尤其在高度 同源的部分中。在SSEQIDNO:13、 66、 67、 68和69中給出編碼E2多肽 的簡并核酸分子的代表性實例。更具體地，SEQIDNO:13編碼膜呈遞和復 制缺陷型的HPV-18 E2多肽，其中所述多肽的核苷酸序列己經如此設計， 從而減低與其編碼E2的對應物的同源性至小于8或7個連續核苷酸。SEQ ID NO:66和67均編碼復制缺陷型HPV-33 E2多肽(它在SEQ ID NO:67中 還是膜呈遞的)，其中所述多肽的核苷酸序列已經如此設計，從而減低與編碼E2的其余對應物的同源性至小于8或7個連續核苷酸。SEQ ID NO:68 和69均編碼復制缺陷型HPV-52 E2多肽(它在SEQ ID NO:69中還是膜呈遞 的)，其中所述多肽的核苷酸序列已經如此設計，從而減低與編碼E2的其 余對應物的同源性至小于8或7個連續核苷酸。然而，本發明不限于這些 示例性序列并且可以基于這個原則設計編碼如上文定義的E2乳頭狀瘤病 毒多肽的簡并核酸分子的備選形式。
本發明的優選載體包含編碼如本文中定義的HPV-16 E2多肽(例如包含 SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的膜呈遞和復制缺陷型的E2多肽)的第一核 酸分子；編碼如本文中定義的HPV-18 E2多肽(例如包含SEQIDNO:8所示 氨基酸序列的膜呈遞和復制缺陷型的E2多肽)的第二核酸分子；編碼如本 文中定義的HPV-33 E2多肽(例如包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的膜 呈遞和復制缺陷型的E2多肽)的第三核酸分子；編碼如本文中定義的 HPV-52 E2多肽(例如包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的膜呈遞和復制 缺陷型的E2多肽)的第四核酸分子。更優選地，第一核酸分子包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或基本上由該核苷酸序列組成；第二核酸分子包 含SEQ IDNO:13所示的核苷酸序列或基本上由該核苷酸序列組成；第三核 酸分子包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列或基本上由該核苷酸序列組 成；和/或第四核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列或基本上由 該核苷酸序列組成。更優選地，本發明的載體是MVA載體并且編碼E2的 第四核酸分子插入缺失ni中。甚至更優選地，第一和第二核酸分子處在痘 苗病毒H5R啟動子的控制下并且置于彼此倒置的方向上，而第三和第四核 酸分子處在痘苗病毒p7.5K啟動子的控制下并且置于彼此倒置的方向上。
在該實施方案的另一個方面，從密切相關的生物體獲得的同一種多肽 優選地是E6多肽、E7多肽或E6和E7多肽。E6和E7可以獨立地表達或 表達為融合多肽。編碼的E2多肽優選地被修飾，從而是膜錨定和非致瘤的， 如本文中定義。
在天然環境中，HPV-16和HPV-18的天然E6序列在核苷酸水平具有 63%的同源性而HPV-16和HPV-18的天然E7序列彼此57%同源。然而， 在兩種情況下，HPV-16和HPV-18天然序列共享了顯示80%或大于80°/。同 源性的40個或更多個連續核苷酸的幾個部分(見圖2)。預計這些同源序列 的存在不利地影響共表達HPV-16和HPV-18 E6和/或E7基因的載體的穩定性。同源重組可以在這些同源部分之間發生并且導致同源部分之間所含 有的核苷酸序列丟失，并且因此導致基因沉默。
根據本發明，HPV-16禾n/或HPV-18 E6和E7多肽的核酸分子可以通過 簡化密碼子使用模式進行修飾，從而減低同源性至小于75%，尤其在同源 部分中。在SEQ ID NO:14中給出編碼HPV-18 E6多肽的簡并核酸分子的 代表性實例并且在SEQ ID NO:15中給出編碼HPV-18 E7多肽的簡并的修 飾核酸分子的代表性實例。更具體地，已經如此設計SEQIDNO:14和SEQ IDNO:15，從而減低與HPV-16對應物的同源性至小于8、 7、 6個或優選5 個連續核苷酸，同時編碼HPV-18的膜錨定和非致瘤性E6和E7多肽。然 而，可以基于這個原則設計編碼如上文定義的E6和/或E7乳頭狀瘤病毒多 肽的簡并核酸分子的備選形式。
本發明的優選載體包含編碼如本文中定義的(例如膜錨定的和非致瘤 性)HPV-16 E6多肽的第一核酸分子和編碼如本文中定義的(例如膜錨定的 和非致瘤性)HPV-18 E6多肽的第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含 SEQIDNO:14所示的核苷酸序列或基本上由該核苷酸序列組成。本發明的 優選載體包含編碼如本文中定義的(例如膜錨定的和非致瘤性)HPV-16 E6
多肽的第一核酸分子和編碼如本文中定義的(例如膜錨定的和非致瘤 性)HPV-18 E6多肽的第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或基本上由該核苷酸序列組成。更優選地，本發 明的載體是MVA載體，第一核酸分子置于痘苗病毒7.5K啟動子的控制下 并且第二核酸分子在痘苗病毒H5R啟動子的控制下，并且第一和第二核酸 分子均插入所述MVA載體的缺失III中。
本發明也涉及載體，所述載體包含編碼HPV-16 E6多肽與HPV-16 E7 多肽的融合物的第一核酸分子和編碼HPV-18 E6多肽與HPV-18 E7多肽的 融合物的第二核酸分子，其中所述第一和第二核酸分子不包含顯示大約 75%或大于75%的同源性百分比的40個或更多個連續核苷酸的部分。
本發明也涉及載體，其中所述載體包含編碼HPV-16 E6多肽的第一核 酸分子、編碼HPV-18E6多肽的第二核酸分子、編碼HPV-16E7多肽的第 三核酸分子和編碼HPV-18E7多肽的第四核酸分子，其中所述第一、第二、 第三和第四核酸分子不包含顯示75%或大于75%同源性百分比的40個或更 多個連續核苷酸的部分。優選地，第二核酸分子包含SEQIDNO:14或基本
28上由SEQIDNO:14組成、或由SEQ ID NO:14組成和/或第四核酸分子包含 SEQIDNO:15或基本上由SEQIDNO:15組成、或由SEQIDNO:15組成。 更優選地，本發明的載體是MVA載體，第一和第二核酸分子各自以倒置 方向置于痘苗病毒7.5K啟動子的控制下并且第三和第四核酸分子各自以倒 置方向置于痘苗病毒H5R啟動子的控制下，并且所述第一、第二、第三和 第四核酸分子插入所述MVA載體的缺失III中。
在另一個方面，本發明還提供一種基本上分離的核酸分子，其包含在 任意的SEQIDNO:9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 66、 67、 68或69所示的 核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列組成或由所述核苷酸序列組成。
在本發明的另一個實施方案中，本發明載體中所包含的第一和第二和 (若存在)第三和第四核酸分子處于適合在宿主細胞或對象表達所編碼多肽 的形式，這意指將它們置于對其表達必需的調節序列的控制下。
如本文中所用，術語"調節序列"指允許、有助于或調節給定宿主細胞 中核酸分子表達(包括該核酸或其衍生物之一(例如mRNA)的復制、重復、 轉錄、剪接、翻譯、穩定性和/或運輸至此宿主細胞)的任意序列。在本發明 的上下文中，調節序列與待表達的核酸分子"有效連接"，例如它們處于允 許在宿主細胞或對象內表達的一種功能性聯系中。此類調節序列是本領域 熟失口(見例如Goeddel, 1990，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego)。本領域技術人員應當理解， 調節序列的設計可能取決于這類因素，如載體類型、宿主細胞、想要的表 達水平等。
啟動子是特別重要的并且本發明包括了指導核酸分子在多種類型宿主 細胞中表達的組成型啟動子和指導僅在某些宿主細胞中(例如組織特異性 調節序列)或應答于特定事件或外源因素時(例如因溫度、營養添加物、激素 或其他配體)表達的那些啟動子的用途。用于真核系統中組成型表達的合適 啟動子包括病毒啟動子，如SV40啟動子、巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動 子或增強子(Boshart等人，1985， Cell 41, 521-530)、腺病毒早期和晚期啟動 子、單純皰疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)啟動子和逆轉錄病毒長末端重 復序列(例如MoMuLV和羅氏肉瘤病毒(RSV) LTR)以及細胞的啟動子如 磷酸甘油激酶(PGK)啟動子(Hitzeman等人，1983， Science 219, 620-625; Adra 等人，1987,Gene 60， 65-74)。用于驅動痘病毒載體中核酸分子表達的合適啟動子包括痘苗病毒的7.5K、 H5R、 TK、 p28、 pll或KlL啟動子。備選 地，可以使用人造啟動子如Chakrabarti等人(1997， Bio技術s 23, 1094-1097)， Hammond等人(1997, J. Virological Methods 66， 135國138)和Kumar和Boyle (1990， Virology 179， 151-158)中描述的那些人造啟動子以及早期與晚期痘 病毒啟動子之間的嵌合啟動子。
誘導型啟動子受外源性供應的化合物調節，并且包括，不限于鋅誘導 型金屬硫蛋白(MT)啟動子(Mc Ivor等人，1987， Mol. Cell Biol. 7, 838-848)、 地塞米松(Dex;)-誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒(:MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動 子系統(WO 98/10088)、蛻皮激素昆蟲啟動子(No等人，1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 3346-3351)，四環素抑制型啟動子(Gossen等人，1992， Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89, 5547-5551)\四環素誘導型啟動子(Kim等人，1995， J. Virol. 69, 2565-2573)、RU486誘導型啟動子(Wang等人，1997, Nat. Biotech. 15， 239-243和Wang等人，1997，Gene Ther. 4, 432-441)、雷帕霉素誘導型啟 動子(Magari等人，1997， J. Clin. Invest 100, 2865-2872)和來自大腸桿菌的 lac、 TRP和TAC啟動子。在本發明上下文中使用的調節序列也可以是組織 特異性的，以驅動核酸分子在需要治療益處的特定組織中表達。合適的啟 動子可以取自腫瘤細胞中偏好性表達的基因。此類基因可以通過展示和比 較基因組雜交法鑒定(見例如US 5,759,776和5,776,683)。
本領域技術人員將認識到，控制本發明載體中所包含的核酸分子表達 的調節元件還可以包含用于宿主細胞或對象中正確起始、調節和/或終止轉 錄(例如聚腺苷酸轉錄中止序列)、mRNA運輸(例如核定位信號序列)，加工 (例如剪接信號)、穩定性(例如內含子和非編碼性5'和3'序列)和翻譯(例如三 重體前導序列、核糖體結合位點、Shine-Dalgamo序列等)的額外元件。
在另一個方面，本發明提供包含上述載體的感染性病毒粒子。這里將 不試圖詳細地描述已知用于產生感染性病毒粒子的多種方法。 一般，此類 病毒粒子通過如此方法產生，所述方法包括步驟(a)在適宜的細胞系中導入 病毒載體，(b)在合適的條件下培養該細胞系，從而允許產生所述感染性病 毒粒子，從所述細胞系的培養中回收產生的感染性病毒粒子并且任選地純 化所述回收的感染性病毒粒子。
當病毒載體具有缺陷性時， 一般通過使用輔助病毒在互補細胞系中產 生感染性顆粒，其中所述輔助病毒以反式方式提供無功能的病毒基因。例如，用于彌補缺失E1的腺病毒載體的合適細胞系包括293細胞(Graham等 人，1997， J. Gen. Virol. 36， 59-72)，、 PER-C6細胞(Fallaux等人，1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917)和HER96細胞。適于增殖痘病毒載體的細胞是禽 細胞，并且最優選地是從雞胚制備的原代雞胚成纖維細胞(CEF)，其中所述 雞胚從受精卵獲得。生產者細胞可以在常規發酵反應器、燒瓶和培養皿中， 在適宜的溫度、pH和氧含量條件下培養。
感染性病毒粒子可以從培養上清液或從裂解后的細胞回收。它們可以 根據標準技術(如在例如W096/27677、 W098歸24、 W098/22588 、 WO98/26048、 WO00/40702、 EP1016700和WO00/50573中描述的層析、超 離)進一步純化。
在另一個方面，本發明提供包含上述核酸分子、載體或感染性病毒粒 子的宿主細胞。如本文中所用的術語"宿主細胞"定義了可以或已經是本發 明載體或感染性病毒粒子的受者的任意細胞和此類細胞的子代。該術語應 當廣義地理解，從而包括分離的細胞， 一組細胞以及細胞的特定組織形式， 例如在組織或器官中。此類細胞可以是原代、轉化的或培養的細胞。
本發明上下文中的宿主細胞包括原核細胞(例如大腸桿菌、芽孢桿菌 屬、李斯特菌屬)、低等真核細胞如酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和其他真核細胞如昆蟲細胞、植物和高等真核細胞，特別優選哺乳 動物細胞(例如人或非人細胞)。合適宿主細胞的代表性實例包括，但不限于 BHK(乳倉鼠腎)細胞、MDCK細胞(Madin-Darby犬腎細胞系)、CRFK細胞 (Cmndell貓腎細胞系)、CV-I細胞(非洲猴腎細胞系)、COS (例如COS-7)細 胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小鼠NIH/3T3細胞、HeLa細胞和Vero細 胞。術語"宿主細胞"也包括能夠彌補本發明復制缺陷型載體(例如腺病毒載 體)的至少一個缺損功能的互補細胞，如上文所提及的那些細胞。
宿主細胞可以用于通過重組手段產生由本發明的載體或感染性顆粒中 所包含核酸分子編碼的多肽。此類技術是本領域熟知(見例如Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987畫2002;禾口 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual最新版,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
在另一個方面，本發明提供包含上述核酸分子、載體、感染性病毒粒子或宿主細胞(如本文也稱作"活性物質")或其任意組合的組合物。有利地， 該組合物是包含治療有效量的活性物質和可藥用介質的藥物組合物。
如本文中所用的術語"可藥用介質"意圖包括與藥物施用兼容的任意和 全部的載體、溶劑、稀釋劑、賦形劑、分散介質、包衣劑、抗菌劑和抗真 菌劑和吸收延遲劑等。如本文中所用，"治療有效量"是足以減緩通常與對 象中想要治療或預防的病理狀況關聯的一種或多種癥狀的劑量。當涉及預 防性用途時，該術語意指足以預防或延遲對象中建立病理狀況的劑量。例 如，治療有效量可以是足以在治療的對象中誘導或增強受免疫應答的那個 量或是足以減輕、改進、穩定、逆轉、延緩或延遲病理狀況進展(例如對象 中損害或腫瘤的尺寸縮小或退化損害，感染的對象中病毒感染的逆轉)的那
希望地，本發明的組合物包含在所用的劑量和濃度上無毒的一種或多 個載體和/或稀釋劑。此類載體和/或稀釋劑優選地選自通常用來配制處于全 身性或粘膜施用的單位劑量或多劑量形式的組合物的那些載體和/或稀釋 劑。合適載體可以溶劑、含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、 液體聚乙二醇等)的分散介質、植物油或其合適的混合物。稀釋劑優選地是 等滲的、低滲的或略微高滲的，并且具有相對低的離子強度。合適稀釋劑
的代表性實例包括無菌水、生理鹽水(例如氯化鈉)、Ringer's溶液、葡萄糖、 海藻糖或蔗糖溶液、Hank's溶液和其他生理平衡鹽水溶液(見例如最新版 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro， Lippincott, Williams&Wilkins)。適當地調節并緩沖本發明組合物的pH，旨在適合用在 人或動物中，優選地在生理性或略微堿性的pH (在大約pH 7.5至大約pH 9 之間，特別優選大約8或8.5的pH)。合適的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液(例 如PBS)、碳酸氫鈉緩沖液和/或Tris緩沖液。
本發明的組合物可以處于多種形式，例如冷凍的、固體(例如干燥粉碎 的或凍干形式)或液體(例如含水的)。活性物質外加任意額外所需成分的固 體組合物可以從經受真空干燥和冷凍干燥的其先前經無菌過濾的溶液獲 得。根據需要，它可以貯存在通過使用前添加合適媒介物而立即重構的無 菌安瓿中。
特別優選的組合物(尤其當活性物質是腺病毒載體)在lM蔗糖、150mM NaCl、 ImM MgCl2、 54 mg/1 Tween 80、 10 mM Tris， pH 8.5中配制。另一種優選的組合物在10 mg/ml甘露醇、1 mg/ml HSA、 20 mM Tris、 pH 7.2 和150mMNaCl中配制。此類制劑特別適合在至少2個月時間范圍內在冷 凍(例如-70。C、 -40°C、 -20。(:)或冷藏(例如4。C)溫度保護本發明組合物的穩定性。
該組合物也可以含有一種或多種可藥用賦形劑用于提供希望的藥用屬 性或藥代動力學屬性，例如包括調節或維持pH、滲透性、黏性、透明度、 顏色、無菌性、穩定性、釋放至或吸收進入人或動物對象。穩定組分的代 表性實例包括聚山梨酯80、 L-精氨酸、聚乙烯吡咯垸酮、海藻糖和可以用 來獲得溶解度、穩定性和半壽期的希望屬性的聚合物如聚乙二醇(Davis等 人，1978, Enzyme Eng. 4, 169-173; Burnham等人，1994, Am. J. Hosp. Pharm. 51,210-218)。增稠劑包括羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。該組合物也 可以含有本領域已知促進穿透或跨粘膜屏障或在特定器官種運輸的物質。 例如，適用于陰道施用的組合物可以逐步地包含用來增加粘膜孔徑的一種 或多種吸收增強劑。
另外，本發明的組合物包含適合給人類全身性或粘膜性施用的一種或 多種佐劑。術語"佐劑"指這樣的化合物，其具有增強針對特定抗原的免疫 應答的能力。佐劑可以被送遞至抗原部位處或其附近。體液免疫的增強一 般由針對該抗原所產生的抗體的滴度顯著提高(通常大于IO倍)表現。細胞 免疫的增可以通過陽性皮膚試驗、細胞毒T細胞測定、IFNY或IL-2的 ELIspot測定法測量。優選地，在本發明中施用的佐劑能夠刺激針對活性物 質的免疫，尤其通過toll樣受體(TLR)如TLR國7、 TLR國8禾tl TLR-9。有用佐 劑的代表性實例包括，不限于鋁膠、礦物油乳液如弗氏完全佐劑和不完全 佐劑(IFA)、脂多糖或其衍生物(Ribi等人，1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY， p407漏19)、皂武如QS21 (Sumino等人，1998, J.Virol. 72, 4931-9; WO 98/56415)、咪唑喹啉化合物如咪喹莫特(Suader, 2000， J. Am Acad Dermatol. 43， S6-S11)、 m-咪唑并(4， 5-c)奎諾酮-4-胺衍生物(AldaraTM)和相關化合物 (Smorlesi, 2005，Gene Ther. 12, 1324-32)、胞嘧啶磷酸鳥苷寡脫氧核苷酸如 CpG (Chu等人，1997， J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel等人，2003， J. Immunol. 171 : 2358-2547)和陽離子肽如IC-31(Kritsch等人，2005， J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-70)。本發明的核酸分子，載體，感染性顆粒或組合物可以通過多種施用模 式施用，包括全身、局部和粘膜施用。全身施用可以通過任意方式進行， 例如通過皮下、皮內、肌內、靜脈內、腹膜內、血管內、動脈內注射。注 射可以用常規注射器或注射針或本領域可獲得的任何其他裝置進行。粘膜 施用可以通過口腔、鼻、呼吸道內、肺內、陰道內或肛門內途徑進行。局 部施用可以使用經皮膚手段(例如貼劑等)進行。特別優選用病毒載體和感染 性顆粒作為活性物質的肌內或皮下施用。
適宜劑量可以根據已知因素變動，如具體活性物質的藥代動力學特征、 年齡、健康和待治療的對象的重量、待治療的病理狀況、癥狀的特征和范 圍、同時治療的種類、治療的頻率、預防或治療的需求和/或所需的作用。 劑量還將根據所選的具體施用途徑計算。對確定適宜治療劑量必需的計算 的進一步修正由開業醫生在相關環境影響下常規地進行。就一般指導而言，
腺病毒粒子的合適劑量是從約105至約1013iu (感染單位)，希望是從約107 至約1012iu并且優選地從約108至約10"iu。痘苗病毒粒子的合適劑量是從 約104至約10^pflj(蝕斑形成單位)，希望是從約105至約109pfo并且優選地 從約106至約5xl08pfti。載體質粒可以在10嗎與20 mg之間并且優選在 100嗎與2mg之間的劑量上施用。另外，施用可以根據標準方法、劑量或 方案，在幾小時、幾日和/或幾周范圍內以單個劑量或備選地以多個劑量進 行。此外，施用可以通過大丸劑注射或連續輸注方式進行。例如，對象可 以用上述核酸分子、載體、感染性顆粒或組合物的至少2次(例如從2次至 IO次)施用進行治療。優選地，第一系列施用在從幾日至4周的時間段內依 次地實施，隨后在1至6個月范圍內實施第一系列施用(例如1或2次施用)， 隨后是所述第一系列的最后施用。第二系列的每次施用之間的時間段可以 是從幾日至4周。在優選的實施方案中，第一系列施用包括以周間隔的三 次依次施用并且第二系列施用包括在4至6個月內的一次施用，隨后是所 述第一系列。作為一般指導，對于MVA載體，優選的施用途徑是以包含 于106與5x 106pfo之間的MVA顆粒/粒子劑量的皮下方式。
本發明的核酸分子、載體、感染性顆粒、宿主細胞或組合物可以導入 對象中，以治療或預防多種病理狀況，包括遺傳疾病、先天疾病和獲得性 疾病。本發明也涉及本發明核酸分子、載體、感染性顆粒、宿主細胞或組 合物用于制備用于治療或預防此類病理狀況的藥物的用途。它特別適宜于
34治療或預防感染性疾病(例如病毒性和/或細菌性感染)、癌癥和免疫缺陷 病。如本文中所用的術語"癌癥"包括因不想要的細胞增殖所致的任意癌變 狀況，包括彌散或局限性腫瘤、轉移、癌變息肉和腫瘤前損傷(例如瘤形成)。 在本發明上下文中構思的感染性疾病包括與如上所述致病微生物感染 相關的任意病況。在本發明上下文中構思的癌癥包括，而不限于惡性膠質 瘤、肉瘤、黑素瘤、肥大細胞瘤、癌以及乳腺癌、前列腺癌、睪丸癌、卵 巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌(尤其與乳頭狀瘤病毒感染相關的那些子宮頸 癌)、肺癌(例如包括巨細胞、小細胞、鱗狀細胞和腺癌)、腎癌、膀胱癌、
肝癌、結腸癌、肛癌、胰腺癌、胃癌、胃腸癌、口腔癌、喉癌、腦和CNS 癌、皮膚癌(例如黑素瘤和非黑素瘤)、血癌(淋巴瘤、白血病，尤其當它們 在實體組織中發育時)、骨癌、視網膜母細胞瘤和甲狀腺癌。
在優選的實施方案中，本發明用于預防性或治療性治療與乳頭狀瘤病 毒(尤其HRHPV)感染相關的病況，如持續性感染、惡變前和惡性病變。"持 續性感染"指在沒有實現病毒根除的感染對象中乳頭狀瘤病毒感染的無癥 狀期。 一般觀察不到臨床體征。惡變前損害的實例包括，不限于可以在多 種組織中檢測到的低度、中度或高度的上皮內瘤形成如CIN(頸部上皮內瘤 形成)、外陰上皮內瘤形成(VIN)、肛門上皮內瘤形成(AIN)、陰莖上皮內瘤 形成(PIN)和陰道上皮內瘤形成(ValN)。惡性病變的實例包括，不限于子宮 頸癌、肛門癌、陰道癌、陰莖癌和口腔癌。編碼乳頭狀瘤病毒多肽的本發 明核酸分子、載體、感染性顆粒、宿主細胞或組合物特別定義用于治療惡 變前損害、尤其CIN2/3損害或惡性病變，尤其子宮頸癌。在另一個實施方 案中，本發明也可以用于預防性或治療性治療與肝炎病毒(例如HBV或 HCV)感染相關的病況，如持續性感染、慢性或fblgurant hepatitis和肝癌。
活性物質可以單獨施用或根據需要與常規治療用藥程式(例如放療、化 療和/或手術)結合使用。使用標準藥物、劑量和治療法，根據標準方法送遞 常規治療用藥程式至動物或人對象中，并且此類用藥程式可以在施用本發 明活性物質之前、期間和/或之后進行。例如，為處理與相關HCV感染的 病況，本發明的方法或用途優選地與例如蛋白酶抑制劑(例如絲氨酸蛋白酶 抑制劑如Vertex公司的VX950)、聚合酶抑制劑、解螺旋酶抑制劑、抗纖維 變性藥、核苷類似物、TLR激動劑、siRNA、反義寡核苷酸、抗HCV抗體、 免疫調節劑、治療性疫苗和在治療HCV相關性肝癌(例如通常通過肝動脈
35中化學栓塞法施用的阿霉素或阿霉素碘油與動物膠的混合物)中常規使用
的抗腫瘤藥聯合。 一個特別合適的組合包括用PEG化的IFN-a (IFN-a2a或 IFN-(x2b)和/或利巴韋林治療，優選地持續24至48周，此后施用本發明的 活性物質。為治療與乳頭狀瘤病毒感染相關的病況，本發明的方法或用途 可以與燒蝕術如電圈切除術聯合。本發明的方法或用途也可以與免疫刺激 物如細胞因子(例如IL-2、 IL-7、 IL畫15、 IL-18、 IL畫21、 IFNg)或自殺基因產 物(例如在Caruso等人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90， 7024-28中描述 的HSV-1胸苷激酶；在WO 99/54481中描述的FCU-I )或表達此類多肽的 載體聯合實施。
在另一個實施方案中，本發明的方法或用途根據包括依次施用激發組 合物和增強組合物的激發/增強治療用藥程式實施。 一般，激發性和增強組 合物使用包含或編碼至少一個共同抗原結構域的不同媒介物。本發明的方 法或用途可以包括施用激發性組合物1至10次，隨后施用增強性組合物1 至10次。希望是，注射間隔期是l日至12個月。優選的用藥程式包括獨 立地依次施用激發物3或4次，由3至10日(例如1周)的間隔時間分隔， 隨后在終末施用激發物后1至幾周施用增強物1或2次。另外，激發性和 增強性組合物可以在相同部位或在備選部位通過相同施用途徑或通過不同 施用途徑施用。例如，可以通過粘膜途徑施用基于多肽的組合物，而優選 地注射基于載體的組合物，例如皮下注射MVA載體、肌內注射DNA質粒 和腺病毒載體。本發明的載體、感染性顆粒或組合物可以用來激發或增強 或激發并增強治療的對象的免疫應答。在一個實施方案中，用本發明的質 粒載體進行激發并且用本發明的痘苗病毒感染性顆粒增強。在另一個實施 方案中，用本發明的腺病毒感染性顆粒進行激發并且用本發明的痘苗病毒 感染性顆粒增強。仍在另一個實施方案中，用本發明的痘苗病毒感染性顆 粒進行激發并且用本發明的腺病毒感染性顆粒增強。
本發明已經以說明性方式進行描述，并且應當理解已經使用的術語意 圖本質上是描述性而非限制性的。顯然，本發明的眾多修改和變體在上述 教授內容的影響下是可能的。因此應當理解在所附權利要求書的范圍內， 本發明可以按照不同于本文具體所描述的方式實施。
以上所提及的專利、出版物和數據庫條目的全部公開內容出版物特別 地通過引用方式以相同程度完整并入本文，如同專門且個別地說明通過引用方式并入每份這種單獨的專利、出版物和條目。 附圖簡述
圖1說明(A)存在于天然HPV-16 El序列末尾的59個核苷酸(a)與存在 于天然HPV-16 E2序列開始處的59個核苷酸(b)之間的序列比對結果以及 (B)存在于天然HPV-16 El序列末尾或天然HPV-16 E2序列開始處的59個 核苷酸(a)與SEQ ID NO:9 (b)之間的序列比對結果。
圖2說明(A)在HPV-16與HPV-18 E6-編碼序列之間和(B)在HPV-16 E6-編碼序列與SEQ IDNO:14之間的序列比對/比對結果。
以下實施例起到說明本發明的作用。
實施例
下文所述的構建根據詳述于Maniatis等人(19S9， Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)中的一般基因 工程技分子克隆技術或當使用試劑盒時根據制造商推薦實施。PCR擴增技 術是本領域技術人員已知的(見例如1990年Academic Press出版社Innis、 Gelfand、 Sninsky和White出版的《PCR方案-方法和應用指南》(PCR protocols-A guide to methods and applications))。攜帶氨節青霉素抗性基因的 重組質粒在補充有100 pg/ml抗生素的瓊脂或液體培養基上的大腸桿菌 C600 (Stratagene)、 BJ5183 (Hanahan, 1983， J. Mol. Biol. 166， 557-580)和 NM522中復制。重組痘苗病毒的構建根據以上所提及文獻和Mackett等人 (1982, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 79， 7415國7419)和Mackett等人(1984, J. Virol. 49， 857-864)中所屬領域內的常規技術進行。使用大腸桿菌的選擇基 因gpt(黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶)(Falkner和Moss, 1988， J. Virol. 62, 1849-1854)來促進重組痘苗病毒的選擇。
實施例1:構建表達HPV-16 El和E2基因(MVATG17410)的MVA載體 a)構建編碼HPV-16 E2基因的重組MVA載體(MVATG 17408) 克隆HPV16E2基因
從分離自CaSki細胞(ATCC CRL-1550)的基因組DNA中克隆編碼 HPV-16 E2的核苷酸序列。使用引物OTG16809 (SEQ ID NO:16)和OTG16810(SEQIDNO:17)擴增E2基因。所得片段由BamHI和EcoRI消 化并插入由相同酶限制性處理過的pGEX2T(Amersham Biosciences),產生 pTG17239。對克隆的E2基因測序顯示與(GenbankNC-01526中描述的)HPV 16 E2原型序列相比，存在5個突變。兩個突變是沉默的，并且使用 QuickChange位點定向誘變誘變(Stratagene)校正三個非沉默突變(T2101, S219P, K310T)，產生pTG 17268。 修飾HPV-16E2多肽
并入pTG 17268的E2核苷酸序列通過位點定向誘變法修飾，旨在產生 名為edE2f的HPV-16 E2變體(E39A和173A)。更具體的，通過將位置39 中的Glu殘基置換為Ala來取消E2的復制功能，并且通過將位置73中的 He殘基置換為Ala來取消其反式激活功能。所得質粒pTG17318包含編碼 :^^-16￡2*的修飾的序列。
HPV-16 E2f通過在氨基端融合于信號肽并且在羧基融合于衍生自狂犬 病病毒(PG株；Genbank ay009097)糖蛋白的膜錨定序列而進一步修飾，從 而指導HPV-16 E2+在表達宿主細胞中呈遞在質膜表面上。使用以下引物: OTG17500(SEQIDNO:18)、 OTG17501 (SEQ ID NO:19)、 OTG17502(SEQ ID NO:20)、 OTG17503 (SEQ ID NO:21)、 OTG17504 (SEQ ID NO:22)和 OTG17505 (SEQ IDNO:23)，通過三重PCR再裝配出編碼名為SS-E2*-TMR 的膜呈遞的E2缺陷型變體的核苷酸序列(SEQIDNO:12)。將再裝配的序列 插入pBS-衍生性載體(Stratagene)，以產生pTG17360，并隨后克隆在痘苗 病毒轉移質粒中e pH5R啟動子下游(Rosel等，1986, J Virol. 60, 436-449)， 產生pTG17408。
設計轉移質粒旨在允許通過同源重組于MVA基因組的缺失III中插入 待轉移的核苷酸序列。它源自質粒pTGlE(在Braun等人，2000,Gene Ther. 7， 1447-57中描述)，其中向所述pTGlE克隆包圍MVA缺失III的側翼序列 (BRG3和BRD3)，其中所述側翼序列通過PCR從MVATGN33.1 DNA獲得 (Sutter和Moss， 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51)。該轉移質粒 也含有(Lausanne大學R. Wittek友好提供的)早晚期痘苗病毒人造啟動子pi 1K7.5的控制下的維多利亞水母(Aequorea victoria)增強型綠色熒光蛋白 (eGFP基因，從Clontech公司的pEGP-Cl分離)與大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷 酸核糖轉移酶基因(gpt基因)之間的融合。黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶的合成能夠使GPT+重組MVA在含有霉酚酸、黃嘌呤和次黃嘌呤的選擇培養 基(Falkner等，1988, J. Virol. 62， 1849-54)中形成蝕斑并且eGFP能夠使得重 組MVA蝕斑可見到。選擇標記eGFP-GPT置于處于相同方向的同源序列 兩個之間。當實現了克隆性選擇時，在無選擇作用下允許eGPP-GPZ重組 MVA生長時，通過幾次傳代輕易消除該選擇標記。
構建表達HPV-16SS-E2、TMR基因的重組MVA
通過在感染MVATGN33.1(M010.1 pfb/細胞)并以pTG17408(根據標準 磷酸鈣DNA沉淀法)轉染的原代雞胚成纖維細胞(CEF)中同源重組開展 MVATG 17408病毒的產生。通過在含有霉酚酸、黃嘌呤和次黃嘌呤的選擇 培養基存在下的三輪蝕斑純化進行病毒的選擇。如上所述，隨后通過在非 選擇培養基中傳代消除選擇標記。通過PCR驗證不存在親代MVA混雜。
通過蛋白質印跡法進行E2表達的分析。CEF用MOI 0.2的 MVATG17408感染并且24小時后，收獲細胞。使用商業化抗E2單克隆抗 體TVG271 (Abeam)進行蛋白質印跡分析。檢測到具有55 kD表觀分子量的 蛋白質的表達，同時E2、TMR的理論分子量是48.9kDa。用內切糖苷酶F 處理細胞提取物后，觀察到重組蛋白的大小降低，表明從MVATG17408 表達的E2* TMR多肽是N-糖基化的。
b)構建編碼HPV-16E1基因的重組MVA，其中所述HPV-16 El基因在與 HPV-16E2基因(MVATG 17409)交疊的部分中是簡并的
從CaSki細胞DNA(ATCC CRL-1550)克隆了編碼HPV-16 El多肽的核 苷酸序列。更具體地，El基因分EIa(nt 1-1102)和EIb(nt 1001 to 1950)兩個 部分擴增。使用引物OTG16811 (SEQ ID NO:24)和OTG 16814 (SEQ ID NO:25)來擴增EIa片段，其中所述Ela片段由BamHI和EcoRI消化并插入 由相同酶限制性處理的pGEX2T，產生pTG17240。使用OTG16813 (SEQ ID NO:26)和OTG 16812 (SEQ ID NO:27)產生Elb片段，并由Bamffl和EcoRI 消化，隨后插入pGEX2T,產生pTG 17241。與(GenbankNC-01526中描述 的)HPV 16 El原型序列相比，測序顯示存在4個突變。 一個突變是沉默的， 并且三個存在于Ela中的非沉默突變(K130Q， N185T和T220S)由位點定向 誘變誘變法校正。隨后通過克隆在BsrGI和EcoRI消化的pTG 17241中的 己校正Ela片段而重新裝配出完整的El基因。所得的質粒命名為 pTG17289。在HPV-16基因組中，El基因的最后59個核苷酸與E2基因的頭59 個核苷酸相同。為了在編碼El和E2的MVA載體的生產步驟期間規避不 穩定性問題，通過密碼子使用修飾法修飾E1編碼序列的這個部分，從而減 低與E2編碼序列的序列同源性。使用簡并引物OTG17408 (SEQ IDNO:28) 和OTG17409 (SEQ ID NO:29)，通過擴增El基因的3'末端獲得簡并序列 (SEQ ID NO:9)。所得擴增片段由Nsil和BglII消化并插入由相同酶限制性 處理過的pTG 17289，產生pTG17340。
HPV-16簡并El序列也借助位點定向誘變法突變，通過將HPV-16 El 的位置482中的Gly殘基置換為Asp殘基(G482D，本文中又命名為El*)， 旨在消除所編碼E1多肽的復制功能，從而產生pTG17373。
通過與衍生自狂犬病病毒(ERA分離株；在GenbankNM38452中描述) 糖蛋白的信號肽和膜錨定肽融合，還修飾了 HPV-16 degf序列，從而指導 所編碼的多肽在細胞質表面表達。使用以下引物OTG 17560 (SEQ ID NO:30)、 OTG17561 (SEQ ID NO:31)、 OTG17562 (SEQ ID NO:32)、 OTG17563 (SEQ ID NO:33)、 OTG17564 (SEQ ID NO:34)和OTG17565 (SEQ IDNO:35)，通過三重PCR重構SS-Eldeg*-TMR序列(SEQ ID NO:10)。所 得的片段插入pBS-衍生的載體(Stratagene),產生pTG17404。 SS-E ldeg* -TMR序列隨后克隆在痘苗病毒轉移質粒中p7.5K啟動子下游(Cochran等， 1985, J. Virol. 54， 30-7)，產生pTG17409。
MVATG1 7409病毒的產生通過如上所述的同源重組在CEF中進行。 c)構建編碼HPV-16 El和E2基因的重組MVA載體(MVATG 17410)
從pTG1740分離已測序并受p7.5K啟動子控制的SS-E ldeg* -TMR序 列并插入pTG17408，產生pTG17410。
MVATG1 7410病毒的產生通過如上所述的同源重組在CEF中進行。
實施例2:構建編碼HPV-18 El和E2基因(MVATG17582)的MVA載體
將HPV-18El和E2基因重構為合成基因并且設計寡核苷酸從而(i)旨在 降低由天然HPV-16和HPV-18序列所共有的同源部分之間的同源性百分比 至小于75% (比對HPV-16和HPV-18的El和E2基因的序列并設計寡核苷 酸從而旨在減低同源性至小于5個連續核苷酸)(ii)降低在天然HPV-18 El 序列3'端和在HPV-18 E2序列5'端均存在的59個核苷酸部分之間的同源性至小于75。/。并且(ii)導入取消HPV-18 El和E2基因產物之酶功能的突變 (El : G489D， E2 : E43A和177A)。
HPV-18 degEP序列通過裝配50個寡核苷酸重構并克隆在pBS載體 中，產生pTG 17473。使用引物OTG15315 (SEQ IDNO:36)、OTG17881 (SEQ ID NO:37)、 OTG17882 (SEQ ID NO:38)、 OTG17883 (SEQ ID NO:39)、 OTG17884 (SEQ ID NO:40)和OTG17885 (SEQ ID NO:41)，通過三重PCR 隨后將El序列融合于來自麻疹病毒F蛋白的信號序列克隆 (SS-18Eldeg、TMF)。所得的片段(SEQ IDNO:ll)克隆在MVA轉移載體中 處于p7.5K啟動子的控制下，以產生pTG17521。
HPV-18 degE2"^序列通過裝配26個寡核苷酸重構并克隆在pBS載體 中，產生pTG 17498。使用引物OTG17875 (SEQ ID NO:42)、OTG17876 (SEQ ID NO:43)、 OTG17877 (SEQ ID NO:44)、 OTG17878 (SEQ ID NO:45)、 OTG17879 (SEQ ID NO:46)和OTG17880 (SEQ ID NO:47)，通過三重PCR 進行與狂犬病病毒(ERA株；Genbank n。 M38452)糖蛋白的信號肽和膜錨定 肽的融合。將SS-18E2、TMR盒插入痘苗病毒轉移質粒中p7H5R啟動子下 游，產生pTG17552。最后，從pTG17521分離p7.5K-SS-Eldeg、TMF盒并 插入pTG17552,產生pTG17582。
重組MVATG17521、 MVATG17552和MVATG17582的產生如上所述 進行。
實施例3:構建表達HPV-16和HPV-18 El和E2基因的多價MVA載體 (MVATG 17583)
將p7.5K-SS-18Eldeg*-TMF盒和pH5R-SS-18E2*-TMR盒導入 pTG17410(含有p7.5K-SS-16Eldeg*-TMR盒和pH5R-SS-16E2、TMR)并且 將所得轉移質粒命名為pTG17583。 MVATG 17583的產生如上所述進行。
實施例4:構建表達HPV16和HPV18 E6和E7基因的多價重組病毒
MVATG 16327是表達HPV-16和HPV-18 E6和E7多肽的膜錨定型和 非致瘤性變體的重組MVA病毒。將E6和E7核苷酸序列突變，旨在消除 其致瘤屬性(E6f和E7*)，并且融合于編碼適宜信號肽和膜錨定肽的序列 (E6*tm， E7*tm)。更具體地，HPV-18 E7^^分別在其氨基端和羧基端與麻疹病毒F糖蛋白的信號肽和膜錨定肽融合，其中HPV-16 E6*、 HPV-16 E7* 和HPV-18 ￡6*與從狂犬病病毒糖蛋白的信號肽和膜錨定肽衍生的信號肽 和膜錨定肽融合。另外，通過密碼子使用修飾法進一步修飾HPV-18 E6和 E7核苷酸序列，從而減低與其HPV16對應物的同源性。為此目的，比對 天然HPV 16和HPV 18基因的序列并且進行密碼子簡并以減低同源性至小 于5個連續核苷酸。在該載體中，HPV-16和HPV-18 E6序列在彼此相反 的方向上均置于p7.5K啟動子的控制下，其中HPV-16和HPV-18 E7序列 由H5R啟動子驅動并且將全部表達盒插入MVA基因組的切除III區域。
a) 構建HPV-16E7nm表達盒
如WO99/03885中所述，從Caski細胞分離并修飾HPV-16 E7基因， 從而編碼一種非致瘤性和膜呈遞的E7多肽(16E7^mR)。通過缺失氨基酸殘 基21-26(ADLYCYE)進行非致瘤性突變，并且通過將￡7*突變的序列分別 在其5'端和3'端與編碼從狂犬病病毒(ERA株；Genbank登錄號M38452)糖
蛋白克隆的信號肽和膜錨定性肽的序列融合進行膜呈遞。將所得的序列克 隆處在早期晚期pH5R啟動子(Rosel等，1986. J. Virol. 60， 436-9)的控制下 并將該盒導入pBS衍生的載體，產生pTG16161。
b) 克隆HPV-16E6nm和HPV-18E6hm表達盒
如WO99/03885中所述，分離并修飾HPV-16 E6基因，從而編碼一種 非致瘤性和膜呈遞的E6多肽。通過缺失氨基酸殘基118-122(ADLYCYE) 進行非致瘤性突變，并且通過將E6+突變的序列分別在其5'端和3'端與編碼 從狂犬病病毒(PG strain; Genbank登錄號ay009097)糖蛋白衍生的信號肽和 膜錨定性肽的序列融合進行膜呈遞。這通過在含有被一個BamHI位點隔開 的信號肽和膜錨定性肽序列的載體中插入所述E6+突變序列進行，從而產 生pTG 16097。
通過裝配寡核苷酸OTGl 5174 (SEQ ID NO:48)、 OTG1 5175 (SEQ ID NO:49)、 OTG1 5176 (SEQ ID NO:50)、 OTG15177 (SEQ ID NO:51)、 OTG15178(SEQIDNO:52)、 OTG15179 (SEQ ID NO:53)、 OTG15180(SEQ IDNO:54)和OTG15181 (SEQ ID NO:55)，產生了合成性HPV-18 E6序列。
如此設計寡核苷酸，從而引起編碼氨基酸殘基113-117(非致瘤性突變 ANPAEK)密碼子缺失并且簡化密碼子使用，旨在減低與HPV-16 E6基因的 同源性(簡并的序列)。所得的合成性序列隨后分別在其5'端和3'端與編碼從
42狂犬病病毒糖蛋白基因衍生的信號肽和膜錨定性肽的序列融合以提供如
SEQ ID NO:14所示的序列，從而產生pTG16160。將HPV-16 E6*tmR和 HPV-18 degE6*tmR序列以相反方向插入，每個序列均處在p7.5K啟動子的 控制下。將表達盒隨后導入pTG16161以產生pTG 16215。
c) 克隆HPV-18 E7*tmF表達盒
通過過裝配寡核苷酸OTG14773 (SEQ ID NO:56)、 OTG14774 (SEQ ID NO:57)、 OTG14775 (SEQ ID NO:58)、 OTG14776 (SEQ ID NO:59)、 OTG14777 (SEQ ID NO:60) and OTG14778 (SEQ ID NO:61)，產生了合成性 HPV-18 E7序列。如此設計寡核苷酸，從而引起編碼氨基酸殘基24-28(非 致瘤性突變ADLLCH)密碼子缺失并且簡化密碼子使用，旨在減低與 HPV-16 E7基因的同源性(簡并的序列)。所得的合成性序列隨后分別在其 5'端和3'端與從麻疹病毒F蛋白基因衍生的信號肽和膜錨定性肽的編碼序 列融合(在EP 0305229中描述)。將所得的序列(SEQ ID NO:15)克隆處在 pH5R啟動子的控制下并將表達盒導入pBS衍生的載體以產生pTG 16015。
d) 構建轉移質粒pTG 16327
轉移質粒pTG6019 (其在WO99/03885的實施例2中描述)含有位于 MVA缺失III側翼的同源序列。此質粒如下修飾。通過引物OTG 15040 (SEQ IDNO:62)和OTG15041 (SEQ ID NO:63)雜交所獲得的合成性多接頭被導入 由BamUl和Sad消化的pTG6019，產生pTG 16007。從(在EP 1 146 125的 實施例2中描述的)pTG14033分離含有置于早期晚期pH5R啟動子控制下 的編碼大腸桿菌gpt的表達盒的Sacl-Sacl片段并且導入經Sacl消化的pTG 16007，產生pTG16093。黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶的合成能夠使GPT+ 重組MVA在含有霉酚酸、黃嘌呤和次黃嘌呤的選擇培養基(Falkner等人， 1988. J.Virol. 62, 1849-54)中形成蝕斑。選擇標記GPT置于處于相同方向的 同源序列兩個之間。當實現了克隆性選擇時，在無選擇作用下允許 eGPP-GPZ重組MVA生長時，通過幾次傳代輕易消除該選擇標記。
從pTG16015分離含有HPV-18 degE7*TMF表達盒的HindIII-SmaI片 段并導入經相同酶消化的pTG 16093，產生pTG16105。另一方面，pTG16215 由Sail和EcoR消，用T4 DNA聚合酶處理，并且將含有HPV-16 E7*tmR、 HPV-16 E6*tmR和HPV-18 degE6*TMR表達盒的所得片段導經Smal消化 的pTG16105，產生pTG16327(圖2)。e) MVATG16327的產生
通過在原代雞胚成纖維細胞(CEF)中同源重組開展MVATG16327的產 生。為此目的，在事先以MOI 0.1 pfb/細胞感染MVATGN33.1的CEF上根 據標準磷酸鈣DNA沉淀法轉染pTG 16327。通過在含有霉酚酸、黃嘌呤和 次黃嘌呤的選擇培養基存在下，在CEF上的3輪蝕斑純化進行病毒的選擇。 隨后通過在非選擇培養基中傳代消除選擇標記。通過PCR驗證不存在親代 MVA混雜。
通過蛋白質印跡法進行基因表達的分析。CEF用MOI 0.2的 MVATG16327感染并且24小時后，收獲細胞。使用分別針對HPV-16與 HPV-18 E6和E7蛋白的兔多克隆抗體，開展蛋白質印跡分析。結果顯示 全部HPV多肽正確地從MVATG16327中表達。
f) 研究MVATG16327的遺傳穩定性
在以MOI 10、fb/細胞和10 fb/細胞感染的CEF上將MVATG16327 傳5代。對從第5代研究用原液分離的100個病毒克隆評價遺傳穩定性。 使用兩種方法確定表達盒的結構的PCR擴增法，和借助蛋白質印跡法的 抗原檢測。PCR分析的結果顯示99c/。克隆含有目的表達盒。免疫檢測法顯 示97%的克隆表達4種抗原HPV-16和HPV-18的E6*tm和E7*tm多肽。
這些分析表明在5次傳代后，從MVATG 16327衍生的97%的克隆是 一致的，表明該構建體的良好遺傳穩定性。
實施例5:構建表達HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和HPV-52E2基因的多價 MVA載體
編碼HPV-33 E2多肽的合成基因由Geneart(Regensburg, Germany)合 成。如此設計該合成性序列，從而(i)減低與源自HPV-16, HPV-18和HPV-52 的E2基因的同源性百分比至小于75 %(若可能，縮小同源部分至小于6個 連續核苷酸)和(ii)導入取消HPV-33基因產物之酶功能的突變(E39A和 173 A)。
HPV-33 degE2+序列隨后與編碼狂犬病病毒(ERA株，Genbank n。 M38452)糖蛋白的信號肽和膜錨定性肽的核苷酸序列融合。使用引物TG1 8962 (SEQ ID NO:72)、 OTG18963 (SEQ ID NO:73)、 OTG18964 (SEQ ID NO:74)、 OTG18965 (SEQ ID NO:75)、 OTG1 8966 (SEQ ID NO:76) and OTG18967 (SEQ ID NO:77)，通過三重PCR進行該步驟。將編碼 SS-33degE2*-TMR多肽的所得片段(SEQ ID NO:67)克隆在MVA轉移載體 中處于p7.5K啟動子的控制下，并且如上所述產生病毒粒子。
編碼HPV-52 E2多肽的合成基因由Geneart(Regensburg， Germany)合 成。如此設計該合成性序列，從而(i)減低與源自HPV-16、HPV-18和HPV-33 的E2基因的同源性百分比至小于75 %(優選地縮小同源部分至小于6個連 續核苷酸)和(ii)導入取消HPV-52基因產物之酶功能的突變(E39A和I73A)。
使用引物OTGl8968 (SEQ ID NO:78)、 OTGl8969 (SEQ ID NO:79)、 OTGl 8970 (SEQ ID NO:80)、 OTG18971 (SEQ ID NO:81)、 OTGl 8972 (SEQ ID NO:82)和OTGl 8973 (SEQ ID NO:83)，通過三重PCR隨后將合成性 HPV-52 E2*deg序列融合于編碼麻疹病毒F蛋白的信號肽和膜錨定性肽的 核苷酸序列(產生SS-52E2*deg-TM)。
將編碼SS-52E2*deg-TMF多肽的所得片段(SEQ ID NO:69)克隆在 MVA轉移載體中p7.5K啟動子下游，并且如上所述產生病毒粒子。
將編碼膜呈遞的且酶缺陷型HPV-18 E2多肽的pH5R-SS-18E2*-TMR 盒(從pTG17552分離)、編碼膜呈遞的且酶缺陷型HPV-33 E2多肽的 p7.5K-SS-33degE2*-TMR盒、編碼膜呈遞的且酶缺陷型HPV-52 E2多肽的 7.5K-SS-52degE2*-TMF盒導入(含有pH5R-SS-16E2*-TMR盒的)TG17408 并且如上所述產生病毒粒子。
權利要求
1.一種載體，其至少包含編碼第一多肽的第一核酸分子和編碼第二多肽的第二核酸分子，其中-所述第一和第二核酸分子分別獲得自第一和第二天然核酸序列，其在一40個或更多個連續核苷酸的部分顯示大約80％或大于80％的同源性百分比，和-該載體中包含的所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修飾，以使得所述的同源性百分比減低至小于75％。
2. 根據權利要求1的載體，其中第一核酸分子或第二核酸分子或第一 和第二核酸分子的密碼子使用模式至少在所述的40個或更多個連續核苷酸 同源部分內被修飾，以使得所述的同源性百分比減低至小于75%。
3. 根據權利要求2的載體，其中密碼子使用模式在核苷酸水平被修飾 并且所述的修飾在氨基酸水平是沉默的。
4. 根據權利要求2或3的載體，其中密碼子使用模式被修飾以使得第 一與第二核酸分子之間的同源部分限制在小于8個連續核苷酸。
5. 根據權利要求4的載體，其中密碼子使用模式被修飾以使得第一與 第二核酸分子之間的同源部分限制在小于5個連續核苷酸。
6. 根據權利要求1至5任一項的載體，其中所述載體是腺病毒載體。
7. 根據權利要求6的載體，其中所述腺病毒載體是復制缺陷型的。
8. 根據權利要求1至5任一項的載體，其中所述載體是痘病毒載體。
9. 根據權利要求8的載體，其中所述痘病毒載體從選自由哥本哈根株、 Wyeth株、NYVAC和高度減毒的改良Ankara (MVA)株組成的組中的痘苗 病毒獲得。
10. 根據權利要求1至9任一項的載體，其中第一和第二核酸分子獨立 地編碼選自由免疫原性多肽和抗腫瘤多肽組成的組中的多肽。
11. 根據權利要求1至10任一項的載體，其中第一和第二核酸分子從 同一種生物體或從密切相關的生物體獲得。
12. 根據權利要求ll的載體，其中所述生物體是乳頭狀瘤病毒并且第 一和第二核酸分子中每一種核酸分子編碼乳頭狀瘤病毒多肽。
13. 根據權利要求12的載體，其中第一和第二核酸分子獨立地從選自由HPV-16、 HPV畫18、 HPV誦30、 HPV畫31、 HPV畫33、 HPV-35、 HPV-39、 HPV-45、 HPV-51、 HPV隱52、 HPV-56、 HPV-58、 HPV-59、 HPV-66、 HPV國68、 HPV-70和HPV-85組成的組中的高危型乳頭狀瘤病毒獲得。
14. 根據權利要求12或13的載體，其中第一和第二核酸分子獨立編碼 選自由E1、 E2、 E6和E7組成的組中的早期乳頭狀瘤病毒多肽。
15. 根據權利要求12至14任一項的載體，其中第一核酸分子和第二核 酸分子編碼從同一種HPV血清型獲得的至少兩種不同的乳頭狀瘤病毒多 肽。
16. 根據權利要求15的載體，其中第一核酸分子編碼El多肽并且第 二核酸分子編碼E2多肽。
17. 根據權利要求16的載體，其中第一核酸分子編碼包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽并且第二核酸分子編碼包含SEQ ID NO:7所 示氨基酸序列的多肽。
18. 根據權利要求16的載體，其中第一核酸分子編碼包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽并且第二核酸分子編碼包含SEQ ID NO:8所 示氨基酸序列的多肽。
19. 根據權利要求16至18任一項的載體，其中所述載體包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
20. 根據權利要求17或19的載體，其中第一核酸分子包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列并且其中第二核酸分子包含SEQ ID NO:12所示 的核苷酸序列。
21. 根據權利要求18的載體，其中第一核酸分子包含SEQ ID NO:ll 所示的核苷酸序列并且其中第二核酸分子包含SEQ ID NO:13所示的核苷 酸序列。
22. 根據權利要求20或21的載體，其中所述載體是MVA載體，第一 核酸分子置于痘苗病毒7.5K啟動子的控制下并且第二核酸分子在痘苗病毒 H5R啟動子的控制下，并且第一和第二核酸分子均插入所述MVA載體的 缺失III中。
23. 根據權利要求16的載體，其中所述載體包含編碼HPV-16E1多肽 的第一核酸分子、編碼HPV-16 E2多肽的第二核酸分子、編碼HPV-18E1 多肽的第三核酸分子和編碼HPV-18 E2多肽的第四核酸分子，并且其中所述第一、第二、第三和第四核酸分子不包含顯示75%或大于75%同源性百 分比的40個或更多個連續核苷酸的部分。
24. 根據權利要求23的載體，其中所述HPV-16 El多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO:7所示的 氨基酸序列，所述HPV-18E1多肽包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列和 /或所述HPV-18 E2多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
25. 根據權利要求24的載體，其中所述載體包含含有SEQ ID NO:IO 所示核苷酸序列的第一核酸分子、含有SEQIDNO:12所示核苷酸序列的第 二核酸分子、含有SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的第三核酸分子和含有 SEQIDNO:13所示核苷酸序列的第四核酸分子。
26. 根據權利要求23至26任一項的載體，其中所述載體是MVA載體， 所述第一、第二、第三和第四核酸分子被導入MVA載體的缺失m中，第 一和第三核酸分子置于相反的方向上，各自處在痘苗病毒p7.5K啟動子的 控制下，并且第二和第四核酸分子置于相反的方向上，各自處在痘苗病毒 pH5R啟動子的控制下。
27. 根據權利要求12至14任一項的載體，其中所述第一核酸分子和所 述第二核酸分子至少編碼從密切相關的HPV血清型獲得的同一種多肽。
28. 根據權利要求27的載體，其中密切相關的HPV血清型是HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和/或HPV-52。
29. 根據權利要求28的載體，其中從密切相關的生物體獲得的所述同 一種多肽是E2多肽。
30. 根據權利要求29的載體，其中所述載體包含編碼HPV-16E2多肽 的第一核酸分子、編碼HPV-18E2多肽的第二核酸分子、編碼HPV-33E2 多肽的第三核酸分子和編碼HPV-52 E2多肽的第四核酸分子。
31. 根據權利要求30的載體，其中所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述HPV-18 E2多肽包含SEQ ID NO:8所示的 氨基酸序列，所述HPV-33 E2多肽包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列， 所述HPV-52 E2多肽包含SEQ IDNO:71所示的氨基酸序列。
32. 根據權利要求30或31的載體，其中所述第一核酸分子包含SEQID NO:12所示的核苷酸序列、所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:13所示的核 苷酸序列、所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列并且所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列。
33. 根據權利要求28或28的載體，其中從密切相關的生物體獲得的所述同一種多肽是E6多肽、E7多肽或E6和E7多肽。
34. 根據權利要求33的載體，其中第一核酸分子編碼HPV-16E6多肽并且第二核酸分子編碼HPV-18 E6多肽，其中第二核酸分子包含SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列。
35. 根據權利要求33的載體，其中第一核酸分子編碼HPV-16E7多肽并且第二核酸分子編碼HPV-18 E7多肽，其中第二核酸分子包含SEQ IDNO:15所示的核苷酸序列。
36. 根據權利要求34或35的載體，其中所述載體是MVA載體，第一核酸分子置于痘苗病毒7.5K啟動子的控制下并且第二核酸分子在痘苗病毒H5R啟動子的控制下，并且第一和第二核酸分子均插入所述MVA載體的缺失III中。
37. 根據權利要求33的載體，其中所述載體包含編碼HPV-16E6多肽的第一核酸分子、編碼HPV-18E6多肽的第二核酸分子、編碼HPV-16E7多肽的第三核酸分子和編碼HPV-18 E7多肽的第四核酸分子，其中所述第一、第二、第三和第四核酸分子不包含顯示75%或大于75%同源性百分比的40個或更多個連續核苷酸的部分。
38. —種基本上分離的核酸分子，其包含SEQIDNO:9、 10、 11、 12、13、 14、 15、 66、 67、 68或69任一所示的核苷酸序列。
39. —種宿主細胞，其包含根據權利要求38的核酸分子或根據權利要求1至37任一項的載體。
40. —種藥物組合物，其包含治療有效量的根據權利要求38的核酸分子、根據權利要求1至37任一項的載體或根據權利要求39的宿主細胞和可藥用介質。
41. 權利要求40的藥物組合物，其中所述組合物包含適合給人類全身性或粘膜性施用的一種或多種佐劑。
42. 權利要求41的藥物組合物，其中所述佐劑是咪唑喹啉化合物。
43. 根據權利要求38的核酸分子、根據權利要求1至37任一項的載體、根據權利要求39的宿主細胞或根據權利要求40至42任一項的組合物在制備用于治療或預防感染性疾病、癌癥或免疫缺陷病的藥物中的用途。
44. 根據權利要求43的用途，所述藥物用于預防性或治療性治療與乳頭狀瘤病毒感染相關的病況，如持續性感染、惡變前和惡性病變。
45. 根據權利要求43或44的用途，其中按照激發-增強治療模式實施所述用途，并且其中所述載體或組合物用來激發或增強或激發并增強對象的免疫應答。
全文摘要
本發明提供用于表達至少第一和第二核酸分子的載體，其中所述第一和第二核酸分子在40個或更多個連續核苷酸的部分顯示大約80％或大于80％的同源性百分比，并且中所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修飾，以使得所述的同源性百分比減低至小于75％。本發明也涉及基本上分離的核酸分子，其包含如SEQ ID NO9-15和66-69任一所定義的核苷酸序列。還提供包含此種核酸分子或載體的宿主細胞和藥物組合物以及它們用于治療或預防目的的用途。
文檔編號C12N15/86GK101688223SQ200880016061
公開日2010年3月31日 申請日期2008年1月29日 優先權日2007年5月15日
發明者D·施密特, N·西爾韋斯特雷 申請人:特蘭斯吉恩股份有限公司