專利名稱：：生物防腐劑枯草芽孢桿菌素及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及肉、香腸、魚及其制品保存用的防腐劑。特別是涉及用細菌代謝物提取細菌素類的防腐劑
技術領域：
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背景技術：
：隨著食品工業的發展，傳統防腐方法已不能滿足其防腐需要，人們對食品防腐方法提出了更高的要求，要求操作更簡單,保質期更長，防腐成本更低。基于此，化學產品用于食品防腐的做法開始流行。早期的化學防腐主要有甲醛、硝酸鹽類等高毒產品，以后又研究出苯甲酸、苯甲酸鈉、脫氫醋酸納、雙乙酸鈉等數十種各類化學合成的食品防腐劑。隨著科學技術的進步，人們逐步發現化學合成食品防腐劑的存在對人體健康的巨大威脅。近年來，隨著人們生活和消費水平的提高,人們對食品的安全水平提出了更高的要求，食品加工企業為了順應市場的變化，其產品也越來越向"綠色"和"天然"等方向轉變，因此,天然、安全的功能性食品防腐劑的研究開發就成為必要。肉制品以其營養豐富、風味獨特而廣泛受到人們的喜愛，但同時它也是各種微生物滋長的良好場所。隨著人們飲食結構的改善，消費能力的加強對肉食的需求日漸增大，這就要求肉制品生產廠家在不斷提高質量產量,增加品種的基礎上,保證產品具有足夠的保質期。目前食品行業對于魚、肉等制品多采用傳統的低溫、低pH值、低Aw、化學貯藏等方法，雖然使得食品的保質期得到延長，但也存在著一些不足，如物理方法中的低溫，消耗大量的能源的同時也增加了生產成本；化學方法貯藏效果顯著，但也給食品安全帶來了威脅，雖然現有的防腐劑向著低毒方向研究發展，卻不能杜絕毒副作用。世界各國都一直致力于尋找廣譜、安全、高效的食品防腐劑。至此，綠色防腐劑應運而生，從來源分主要有植物來源、動物來源、微生物來源三種。動植物來源的防腐劑，如甲殼素、殼聚糖、蒜氨酸、肉桂等生產周期長，成本較高。而微生物來源的防腐劑，主要是一些有機酸、多肽或前體肽。目前已被批準并在全球廣泛應用的微牛物防腐劑有乳酸鏈球菌肽、曲酸和納他霉素，但它們對高溫，極端環境的適應能力較差，并且只能對特定的菌種產生抑制作用，抑菌范圍小，需要聯合使用以達到理想的防腐效果。細菌素是某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，抑菌范圍不局限于同源細菌，產生菌對其細菌素有自身免疫性。細菌素以生產菌而命名，如大腸桿菌產生的細菌素稱大腸菌素，乳酸菌產生的稱為乳酸鏈球菌素(乳鏈菌肽，Nisin)，綠膿桿齒產生的稱綠膿菌素。在芽孢桿菌細菌素中，枯草菌素(subtilin)[JohannW.G.-U.，Marie-Curie—Str..Bacillussubtilisantibiotics:structures,synthesesandspecificfUnctions[J]..MolecularMicrobiology，2005，56(4):845857〗最早被Jansen，E.Petal.于1944年發現，它是由B.subtilisATCC6633產生的-種羊毛硫抗生素，在生化、遺傳特征以及作用方式上與nisin相似。在酸性條件下穩定，遇堿易分解，自然界中以雙親性的陽離子存在。它能抑制許多革蘭氏陽性細菌。對胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，耐熱性強，經121°C3060min處理仍未失活。枯草菌素通過核糖體合成，包括34aa，形成的具有5個環狀結構的的小肽，它是由一個54aa的前體脫去20aa的引導肽釋放而來[別小妹，陸兆新，呂鳳霞等.BacillussubtilisfmbR抗菌物質的分離和鑒定[J].中國農業科學.2006，39(11):2327~2334]。生產比nisin容易，可以用淀粉作為營養源，有很強的抗不良環境的能力，因此在食品上具有較好的應用前景，但在國內尚無生產，也無使用及相關規定。對枯草桿菌素的生物合成途徑、結構與功能的研究表明大多數枯草桿菌素為多肽類物質，部分為具有特殊結構的蛋白類物質如結合有多糖、磷脂的蛋白[NorimasaT"SusumuO.,MakotoU.,etal.Bacilysocin,aNovelphospholipidsantibioticproducedbyBcjc飾ssw&"'fc/6S[J].AntimicrobialAgentsandchemotherapy,2002,46(2):315320]。細菌素已成為微生物學研究中一個較為活躍的領域，研究主要涉及到產生細菌素菌株的篩選鑒定，細菌素的分離純化、理化性質、產生的遺傳學、作用機理、發酵條件和應用以及工程菌株的構建等。細菌素對一定范圍的微生物有抑殺作用，通過抑制芽孢萌發，在細菌細胞膜上形成親水孔道等方式，導致細胞自溶而死亡。細菌素由于其本身的特性而廣泛地應用于醫療、食品防腐、抗病原真菌、細菌分類、流行病菌系的鑒定和植物病害的生物防治，所以細菌素的研究有著廣泛的理論意義和應用價值。目前國內拮抗件芽孢桿菌及其代謝產物細菌素用于食品防腐的研究，報道不多，目前僅處于一種嘗試開發階段，但普遍認為具有廣闊的開發前景。現有關于枯草芽孢桿菌應用方面的報道多是大量用作藥物、保健品、飼料添加劑，另外還可以用于植物病害的生物防治。其應用機理大致相同，即通過芽孢桿菌代謝產生的蛋白多肽類的拮抗性物質，抑制其他有害菌的生長。現有的對芽孢桿菌細菌素的研究表明[XieLL,ChatterjeeC,BalsaraR,OkeleyNM，vanderDonkWA.HeterologousexpressionandpurificationofSpaBinvolvedinsubtilinbiosynthesis[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2002，295:952-957.]，芽孢桿菌可以代謝產生多種拮抗性物質，其細菌素資源非常豐富。芽孢桿菌現己大量用作藥物、保健品、飼料添加劑，另外還可以用于植物病害的生物防治。其應用機理大致相同，即通過芽孢桿菌代謝產生的蛋白多肽類的拮抗性物質，抑制其他有害菌的生長。例如，醫藥中的枯草芽孢桿菌活菌制劑一白天鵝氣霧劑，地衣芽孢桿菌的微生態制劑一整腸生等；飼料工業中，1989年美國FDA和飼料工業協會公布的可以直接喂養動物的微生物中，芽孢桿菌就達五種，即凝結芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌；生物防治中，巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等可以產生抗菌蛋白抑制植物病原真菌。此外，芽孢桿菌產生的脂類細菌素還被認為是迄今為止的一種最好的生物表面活性劑，在食品、日用化工等方面有著廣闊的應用潛力。目前雖然對芽孢桿菌的細菌素研究報道較多，但是對于在食品中的應用開發國內還未見報道，從安全的發酵食品中分離得到的食品級的微生物將是開發新的食品用細菌素的最好來源。
發明內容本發明的目的在于尋求一種食品級的生物防腐劑——枯草芽孢桿菌素，以減少現有化學防腐劑在食品中的應用。將從泡菜中分離出來的菌種萬sciW^^/WWisB.C119接種于lOOmL液體牛肉膏蛋白胨培養基(以下簡稱液體培養基)中，置于搖床中37匸，120r/min培養6h作為種液。再將種子液按2%接種液體培養基中，37。C震蕩培養24h，4000r/min離心20min，去菌體得上清液，作為拮抗液。對拮抗液采用硫酸銨鹽析，使鹽離子終濃度達到65%。放置4。C冰箱中靜止812h，取出后13500r/min離心10min得沉淀，用去離子水將沉淀溶解，用截流分子量為3500的透析代流水透析過夜，透析液先經過葡聚糖凝膠G-50(S印hadexG-50)凝膠層析分離，280nm光波下檢測收集組分，檢測各組分抑菌活性，將活性組分用瓊脂糖凝膠FF陰離子(DEAE-S印haroseFastFlow)梯度洗脫，收集檢測拮抗性。收集的活性組分為無色或略帶黃色，無味，透明的液體溶液。在pH310范圍內都有拮抗活性，在偏酸性環境里活性較高；熱穩定性高，在10(TC處理30min仍然具抑菌活性，因此通過旋轉蒸發器來控制生產濃度為0.1100.Omg/ml，最好為0.l50.Omg/ml。對確定有活性的組份進行急性毒性實驗，取60只健康昆明種小白鼠，雌雄各半，體重18士2g，實驗溫度2025。C，相對濕度6070%，適應3d后，灌胃進行正式實驗，正式實驗時間14d。將60只小白鼠隨機分為6組(雌雄各半)，分別為l、2、3、4、5、6組。其中第l組為對照組灌胃蒸餾水，26組分別按照每公斤體重(kg.BW)灌胃枯草芽孢桿菌素0.008g、0.04g、0.2g、lg、5g。每天觀察小白鼠的活動、精神、采食、和死亡狀況。于飼喂兩周后統計小白鼠死亡情況，計算死亡率、LD5。、判斷抗菌物質的毒性分級。實驗結束后，屠宰小白鼠觀察各種臟器及組織的病理變化，包括色澤、大小、質地、形態等。并計算小白鼠增重和飼料的利用率。在整個試驗期間未發現對照組和實驗組間有何差異；對照組和實驗組也沒有小白鼠死亡的情況；也沒有發現有明顯的中毒癥狀。觀察各種臟器的形態、質地也無未見明顯的病理變化。按急性毒性分級標準，該枯草芽孢桿菌素屬無毒級。即以成人50kg體重計算，一次攝入量為250g也不會有中毒癥狀發生。觀察枯草芽孢桿菌素對其它微生物的抑制作用，選取我們生活中常見的一些微生物，見表l表1抑菌譜受試菌菌種名稱真菌蘋果酵母、黑獅酵母、白假絲酵母細菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀桿菌霉菌黑曲霉檢測方法a.細菌和真菌采用牛津杯法檢測抑菌活性(1)將牛津杯、無菌水、槍頭濕熱滅菌。吸管、鑷子、三角耙干熱滅菌。(2)吸取0.5ml的指示菌菌懸液加入到4.5ml無菌水中，將指示菌稀釋10倍，用移液管吸取3到4滴(約0.5ml)的指示菌稀釋液到于平板上，用三角耙涂勻。(3)用鑷子夾取牛津杯放到平板上，每皿放13個，然后用移液管在牛津杯內加入23滴枯草芽孢桿菌素。(4)37"C培養48h觀察，用直尺測量抑菌圈直徑(包括牛津杯直徑)。b.對于霉菌，采用紙片擴散法將黑曲霉菌直接接種于PM培養基的平板中央，置于25'C培養，待菌落直徑長到5cm時，在菌落邊緣0.5cm處放置直徑0.5cm的濾紙片。在濾紙片上滴加0.5ml的枯草芽孢桿菌素，置于25'C培養，待菌落生長形成月牙形抑菌圈時，測量抑菌圈直徑。將上述列出的指示菌按照所示方法制成指示菌液，觀察菌株對不同指示菌的抑菌效果。結果如表2，3所示，抗菌譜的測定，共選取指示菌7株，其中細菌3株，酵母3株，霉菌1株。在所選的7株細菌中，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌和致賀氏菌為革蘭氏陰性菌。由表2，3可以看出，枯草芽孢桿菌B.C119抗菌譜廣，對細菌、酵母菌、霉菌都有抑菌作用，對細菌的抑制效果最好。在酵母菌中，對黑獅酵母作用明顯。對霉菌的抑制作用與細菌和酵母大致相同。在細菌中B.C119對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、致賀桿菌都有抑菌作用，而前者是革蘭氏陽性菌，后二者是革蘭氏陰性菌，說明它既能抑制革蘭氏陽性菌又能抑制革蘭氏陰性菌。表2細菌素Cl對細菌和酵母菌的抑制情況指示菌抑菌圈直徑(cm)金黃色葡萄球齒1.6人腸桿齒1.7志賀氏齒1.6內假絲酵母1.6(C""(i/(i""/Z7/c"浴)黑獅酵母2.5蘋果酵母1.1細菌和酵母菌采用牛津杯法。表3細菌素Cl對霉菌和白腐菌的抑制情況指示菌抑菌圈直徑(cm)黑曲毒1.5(Aspergillusniger)霉菌采用紙片擴散法。通過添加在香腸上，以延長其貨架期為目的，以檢測香腸在保藏期間雜菌總數的方法觀察枯草芽孢桿菌素對延長香腸貨架期的效果。香腸的制作-工藝流程原料選擇一原料修整一預腌一絞肉一斬拌一灌腸一結扎一蒸煮—冷卻一4'C冷藏操作要點原料肉新鮮并經過獸醫衛生檢驗合格。原料肉中的淤血和過多的筋腱要剔除。斬拌應在低溫下進行，斬拌后立即灌腸，以免腸餡堆積變質。生的香腸肉糊灌入腸衣時要盡量灌滿。蒸煮溫度約為8095°C，時間約為l1.5h，然后移出蒸鍋迅速冷卻保存。將待用的香腸隨機分割成25g的小塊，向其中分別加入枯草芽孢桿菌素和山梨酸鉀，留空白對照，按照GB4789.2—2003執行，結果以菌落值(CFU/g)，毎組做兩個平行，取平均值。培養條件為36。C、48h。按照熟肉制品衛生標準中的菌落總數指標，分別對各組的菌落數變化做趨勢線擬合，得到各組的貨架期。通過比較可知，添加了枯草芽孢桿菌素的組抑菌效果要好于添加了山梨酸鉀的組，并且可以使香腸的貨架期得到大幅度的延長。結果表明，在食品中添加該細菌素可以達到抑制雜菌生長，延長貨架期。該實驗中得到的枯草芽孢桿菌素與現有的化學防腐劑和其它細菌素類防腐劑相比，具有無毒、廣譜、高效、對極端環境適應能力強、生產方法簡便、成本低的特點，對今后開發食品級綠色防腐劑有著很強的優勢。具體實施方式(一)生產制備實例實例1將從泡菜中分離出來的菌種WaciWMs〃Mi7is及"79接種于100mL液體培養基中，置于搖床中37。C，120r/min培養6h作為種液。再將種子液按2%接種量接種于液體培養基中，37t:震蕩培養24h，4000r/min離心20min，去菌體得上清液，作為拮抗液。對拮抗液采用硫酸銨鹽析，使鹽離子終濃度達到65°/。。放置4。C冰箱中靜止8h，取出后13500r/min離心10min得沉淀，用去離子水將沉淀溶解，用截流分子量為3500的透析代流水透析過夜，透析液先經過SephadexG-50凝膠層析分離，280nm光波下檢測收集組分，檢測各組分抑菌活性，將活性組分用DEAE-S印haroseFastFlow陰離子梯度洗脫，收集檢測拮抗性。以考馬斯亮藍比色法，檢測收集液中蛋白含量，并用旋轉蒸發儀控制濃度，溫度控制在45"C,使樣品濃度最終為lmgZml。實例2將從泡菜中分離出來的菌種5aci"iAsw^ih's及"J9接種于100mL液體培養基中，置于搖床中37。C，120r/min培養6h作為種液。再將種子液按2%接種量接種于液體培養基中，37。C震蕩培養24h，4000r/min離心20min，去菌體得上清液，作為拮抗液。對拮抗液采用硫酸銨鹽析，使鹽離子終濃度達到65%。放置4'C冰箱中靜止10h，取出后13500r/min離心10min得沉淀，用去離子水將沉淀溶解，用截流分子量為3500的透析代流水透析過夜，透析液先經過S印hadexG-50凝膠層析分離，280nm光波下檢測收集組分，檢測各組分抑菌活性，將活性組分用DEAE-S印haroseFastFlow陰離子梯度洗脫，收集檢測拮抗性。以考馬斯亮藍比色法，檢測收集液中蛋白含量，并用旋轉蒸發儀控制濃度，溫度控制在55。C，使樣品濃度最終為10mg/ml。實例3將從泡菜中分離出來的菌種萬a"'l/Mw力"厶'5"萬.OW接種于100mL液體培養基中，置于搖床中37r，120r/min培養6h作為種液。再將種子液按2°/0接種量接種于液體培養基中，37i:震蕩培養24h，4000r/min離心20min，去菌體得上清液，作為拮抗液。對拮抗液采用硫酸銨鹽析，使鹽離子終濃度達到65%。放置4t:冰箱中靜止12h，取出后13500r/min離心10min得沉淀，用去離子水將沉淀溶解，用截流分子量為3500的透析代流水透析過夜，透析液先經過S印hadexG-50凝膠層析分離，280mn光波下檢測收集組分，檢測各組分抑菌活性，將活性組分用DEAE-S印haroseFastFlow陰離子梯度洗脫，收集檢測拮抗牲。以考馬斯亮藍比色法，檢測收集液中蛋白含量，并用旋轉蒸發儀控制濃度，溫度控制在65。C，使樣品濃度最終為50mg/ml。(二)應用實例實施例1香腸的制作工藝流程原料選擇一原料修整一預腌一絞肉一斬拌一灌腸一結扎一蒸煮—冷卻一4'C冷藏操作要點原料肉新鮮并經過獸醫衛生檢驗合格。原料肉中的淤血和過多的筋腱要剔除。斬拌應在低溫下進行，斬拌后立即灌腸，以免腸餡堆積變質。生的香腸肉糊灌入腸衣時要盡量灌滿。蒸煮溫度約為8095°C，時間約為l1.5h，然后移出蒸鍋迅速冷卻保存。將待用的香腸隨機分割成25g的小塊，分成3組，向其中2組分別加入枯草芽孢桿菌素(濃度0.5mg/ml)lml和山梨酸鉀(濃度0.5mg/ml)lml，留1組做空白對照，按照GB4789.2—2003執行，結果以菌落值(CFU/g)，每組做兩個平行，取平均值。培養條件為36i:、48h。按照熟肉制品衛生標準中的菌落總數指標，分別對各組的菌落數變化做趨勢線擬合，得到各組的貨架期(表4)。表4香腸貯藏期間菌落總數(X10'CFU/g)的變化及貨架期<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(表5)。表5香腸貯藏期間菌落總數(X10tFU/g)的變化及貨架期通過比較可知，添加了枯草芽孢桿菌素的組抑菌效果要好于添加了山梨酸鉀的組，并且可以使香腸的貨架期延長了14.4%。實施例2香腸的制作同(二)應用實例的實施例l將待用的香腸隨機分割成25g的小塊，分成3組，向其中2組分別加入枯草芽孢桿菌素(濃度0.5mg/ml)10ml和山梨酸鉀(濃度0.5mg/ml)10ml，留l組做空白對照，按照GB4789.2—2003執行，結果以菌落值(CFU/g)，每組做兩個平行，取平均值。培養條件為36'C、48h。按照熟肉制品衛生標準中的菌落總數指標，分別對各組的菌落數變化做趨勢線擬合，得到各組的貨架期(表5)。表5香腸貯藏期間菌落總數(X104CFU/g)的變化及貨架期<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通過比較可知，添加了枯草芽孢桿菌素的組抑菌效果要好于添加了山梨酸鉀的組，并且可以使香腸的貨架期延長了54.5%。實施例3香腸的制作(二)應用實例的實施例1將待用的香腸隨機分割成25g的小塊，分成3組，向其中2組分別加入枯草芽孢桿菌素(濃度O.5mg/ml)20ml和山梨酸鉀(濃度O.5mg/ml)20ml，留l組做空白對照，按照GB4789.2—2003執行，結果以菌落值(CFU/g)，每組做兩個平行，取平均值。培養條件為36"C、48h。按照熟肉制品衛生標準中的菌落總數指標，分別對各組的菌落數變化做趨勢線擬合，得到各組的貨架期(表6)。表6香腸貯藏期間菌落總數(X10tFU/g)的變化及貨架期<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通過比較可知，添加了枯草芽孢桿菌素的組抑菌效果要好于添加了山梨酸鉀的組，并且可以使香腸的貨架期延長了66.5%。實施例4香腸的制作同(二)應用實例的實施例1將待用的香腸隨機分割成25g的小塊，分成3組，向其中2組分別加入枯草芽孢桿菌素(濃度O.lmg/ml)10ml和山梨酸鉀(濃度0.lmg/ml)10ml，留l組做空白對照，按照GB4789.2—2003執行，結果以菌落值(CFU/g)，每組做兩個平行，取平均值。培養條件為36。C、48h。按照熟肉制品衛生標準中的菌落總數指標，分別對各組的菌落數變化做趨勢線擬合，得到各組的貨架期(表7)。表7香腸貯藏期間菌落總數(X10tFU/g)的變化及貨架期貯藏時間(d)貨架<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通過比較可知，添加了枯草芽孢桿菌素的組抑菌效果要好于添加了山梨酸鉀的組，并且可以使香腸的貨架期延長了18.0%。實施例5香腸的制作同(二)應用實例的實施例l將待用的香腸隨機分割成25g的小塊，分成3組，向其中2組分別加入枯草芽孢桿菌素(濃度0.2mg/ml)10ml和山梨酸鉀(濃度0.2mg/ml)10ml，留l組做空白對照，按照GB4789.2—2003執行，結果以菌落值(CFU/g)，每組做兩個平行，取平均值。培養條件為36'C、48h。按照熟肉制品衛生標準中的菌落總數指標，分別對各組的菌落數變化做趨勢線擬合，得到各組的貨架期(表8)。表8香腸貯藏期間菌落總數(X104CFU/g)的變化及貨架期<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>通過比較可知，添加了枯草芽孢桿菌素的組抑菌效果要好于添加了山梨酸鉀的組，并且可以使香腸的貨架期延長了42.5°/。。實施例6香腸的制作同(二)應用實例的實施例1將待用的香腸隨機分割成25g的小塊，分成3組，向其中2組分別加入枯草芽孢桿菌素(濃度0.4mg/ml)10ml和山梨酸鉀(濃度O.4mg/ml)10ml，留l組做空白對照，按照GB4789.2—2003執行，結果以菌落值(CFU/g)，每組做兩個平行，取平均值。培養條件為36"C、48h。按照熟肉制品衛生標準中的菌落總數指標，分別對各組的菌落數變化做趨勢線擬合，得到各組的貨架期(表9)。表9香腸貯藏期間菌落總數(X104CFU/g)的變化及貨架期貯藏時間(d)貨架組別1351015202530期(d)10.230.380.731.292.113.454.2516.2025.220.400.480.771.322.333.994.4518.8423.0對照0.370.520.911.994.5010.83199.00_16.7通過比較可知，添加了枯草芽孢桿菌素的組抑菌效果要好于添加了山梨酸鉀的組，并且可以使香腸的貨架期延長了51.0%。權利要求1.生物防腐劑枯草芽孢桿菌素，其特征在于由枯草芽孢桿菌BacillussubtilisB.C119培養中產生的具有拮抗性細菌素，為無色或略帶黃色的無味、透明的溶液；其濃度為0.1～100.0mg/ml，在pH3～10范圍內有拮抗活性，在偏酸性環境里活性較高；熱穩定性高，在100℃處理30min仍然具抑菌活性。2.根據權利要求1所述生物防腐劑枯草芽孢桿菌素，其特征在于所述濃度為0.150.0mg/ml。3.如權利要求1所述生物防腐劑枯草芽孢桿菌素的制備方法，其特征在于工藝步驟為(1)將從泡菜中分離出來的菌種萬aciWiA5T/Mj7^5丑6779接種于100mL液體牛肉膏蛋白胨培養基中，置于搖床中37r，120r/min培養6h作為種液；(2)再將種子液按2%比例接種到液體培養基中，37。C震蕩培養24h,4000r/min離心20min，去菌體得上清液，作為拮抗液；(3)對拮抗液采用硫酸銨鹽析，使鹽離子終濃度達到65%，放置4'C冰箱中靜止812h，取出后13500r/min離心10min得沉淀，用去離子水將沉淀溶解，用截流分子量為3500的透析代流水透析過夜，透析液先經過S印hadexG_50凝膠層析分離，280nm光波下檢測收集組分，檢測各組分抑菌活性，將活性組分用DEAE-S印haroseFastFlow陰離子梯度洗脫，收集檢測拮抗性。全文摘要生物防腐劑枯草芽孢桿菌素及其制備方法。將分離出來的菌種BacillussubtilisB.C119接種于液體培養基中，經搖床37℃培養、接種培養后離心得拮抗液。對其硫酸銨鹽析，使鹽離子濃度達65％。4℃放置后離心得沉淀，用去離子水將其溶解，用截流分子量為3500的透析代流水透析過夜，再經過SephadexG-50凝膠層析分離，280nm光波下檢測收集活性組分并用DEAE-SepharoseFastFlow陰離子梯度洗脫。產品為無色或略帶黃色、無味、透明的液體，在pH3～10范圍內都有拮抗活性，且熱穩定性好。與現有防腐劑相比，具有無毒、廣譜、高效、適應能力強、生產簡便、成本低的特點。文檔編號C12N1/20GK101411353SQ20081022886公開日2009年4月22日申請日期2008年11月18日優先權日2008年11月18日發明者侯紅漫,洋劉,帆張申請人:大連工業大學