專利名稱：特異性檢測轉基因大豆dp-356043的標準質粒分子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種特異性檢測轉基因大豆DP-356043的標準質粒分子及其應用，屬于生物檢測技術領域。
背景技術：
近年來，玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等轉基因作物已在許多國家允許種植和生產，并被廣泛用作食品或飼料的加工原料。由于轉基因產品存在著生態風險和食品安全等一系列的問題，因此，世界各國政府和相關國際組織紛紛制定相應的安全管理法規，加強遺傳改良作物的規范管理，并對遺傳改良作物及其產品實施標識制度。我國于2001年5月9 日公布并實施《農業轉基因生物安全管理條例》，并在2002年1月5日公布了農業轉基因生物安全評價、標示和進口安全管理三個配套管理辦法。為了應對遺傳改良作物管理相關的法律法規和制度，建立高效、快速、特異的檢測技術十分必要，它是各國際組織和國家管理遺傳改良作物的有力技術支撐。目前已經發展并廣泛應用的轉基因產品檢測方法有兩類一類是基于核酸水平的檢測，另一類是基于蛋白質水平的免疫學檢測。基于核酸的聚合酶鏈反應(PCR)檢測技術因具有高靈敏度和特異性強的優點，已成為目前最重要、應用最廣泛的遺傳改良作物及其產品檢測技術。不論采用基于核酸或蛋白質的方法，在進行轉基因檢測時都應使用標準物質作為陽性對照，以確保檢測過程的有效和檢測結果的可靠性。目前，用于轉基因檢測的陽性標準物質主要是用純合的轉基因植物材料配置的，位于比利時的歐盟聯合研究中心下屬的 fe^^M%IlJ(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM) 專業配制和提供用于轉基因定量PCR檢測的陽性標準品。到目前為止僅得到了十幾種遺傳改良作物的標準物質，在市場上銷售。但這類來源于農產品的標準物質，其必須有專門的研究機構來制備，貯存和測定過程受很多因素影響，很難維持恒定的量，價格昂貴，而且，這些標準物質的轉基因含量范圍一般是從0. 1%到5%，而實際檢測的樣品中的轉基因含量可能會超出這個范圍。標準物質的缺乏已成為檢測方法建立和應用的瓶頸，阻礙了轉基因產品標識制度的順利實施。標準質粒分子是一種重組質粒分子，其中一般包含轉基因作物檢測的外源基因片段或品系特異性片段以及物種特異性片段。標準質粒分子的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，純度較高；且操作容易，穩定性高，同一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因和內標準基因，經濟高效。近年來，越來越受到各國轉基因檢測專家和學者們的重視，并逐漸取代傳統陽性標準品用于轉基因品系及其加工產品的PCR檢測。轉基因大豆DP-356043品系由先鋒公司研發，已先后在美國、加拿大和日本三國批準環境釋放，并在澳大利亞、韓國、菲律賓、墨西哥等8個國家和地區批準用于食品和飼料的加工原料。我國雖然不種植轉基因大豆，但每年都進口幾千萬噸轉基因大豆用于食品或飼料加工原料。迄今為止，還沒適用于轉基因大豆DP-356043品系檢測的標準質粒分子的報道。
發明內容
為了給中國轉基因大豆品系監管提供必要的技術支撐，開發適用于轉基因大豆 DP-356043品系特異性檢測的、穩定可靠的標準質粒分子，本發明提供了一種特異性檢測轉基因大豆品系DP-356043的標準質粒分子及其應用。本發明所提供的標準質粒分子，其包含以下序列片段DP_356043品系特異性片段和大豆內源標準基因Lectin的特異序列片段。所述的DP-356043的品系特異性序列，指的是轉基因大豆品系DP-356043的外源插入載體與大豆基因組鄰接區的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示。所述大豆內源標準基因Lectin特異性片段，指的是大豆凝集素基因片段，其DNA 序列如SEQ ID NO:2所示。所述的標準質粒分子的骨架質粒是PMD18-T。所述的用于轉基因大豆檢測的標準質粒分子，其中用于構建標準質粒分子的引物序列如下(表1)
表1構建標準質粒分子的PCR引物
權利要求
1.一種特異性檢測轉基因大豆DP-356043的標準質粒分子，其特征在于其序列如SEQ ID No:8 所示。
2.如權利要求1所述的一種特異性檢測轉基因大豆DP-356043的標準質粒分子的構建方法，其特征在于包括以下步驟①以轉基因大豆品系DP-356043基因組DNA為模板進行PCR擴增；反應體系為總體積為50 μ 1，其中10倍的PCR反應液5 μ 1，dNTPs 4μ 1,上下游引物20 μ M各1 μ 1，模板 5 μ 1, Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，用 ddH20 補足至 50 μ 1 ；反應程序為94°C 5分鐘；然后進入以下循環94°C 50秒，55°C 50秒，72°C 60秒，共 30 個循環；最后 72°C延伸 5 分鐘；產物記為Pdp356043 SEQ ID No: 1、PLectin SEQ ID No:7 ；②將PDP35_和Pwin克隆進PMD18-T載體，分兩步進行第一步采用PMD18-T為基礎載體將上步PCR擴增的Pdp356ci43片段SEQ ID No: 1采用 T-A克隆的方式連接到載體中；第二步用限制性內切酶歷fli/ III和I將P^tin片段SEQ ID No: 7和含有Pdp356q43 片段的PMD18-T重組質粒分別進行雙酶切；然后用T4連接酶將二者連接；獲得將轉基因大豆品系DP-356043品系特異性序列片段及大豆內源標準基因Lectin特異性片段融合在 PMD18-T上的標準質粒分子，將其命名為pMD-DP356043，其序列如SEQ ID No:8所示，將 PMD-DP356043導入大腸桿菌JM109即可長期保存使用。
3.如權利要求2所述的一種特異性檢測轉基因大豆DP-356043的標準質粒分子的構建方法，其特征在于所述的引物序列如下DP356-F :AACGGATTTGGACCATTGCGTC SEQ ID NO:3DP356-R :GTAATTGTTAATGCTTCGGAAG SEQ ID NO:4LN-F GCAAGCTTAAGGCAAACTCAGCGGAAAC SEQ ID NO:5LN-R :AACTGCAGAGTGTCAAACTCAACAGCGAC SEQ ID NO:6。
4.如權利要求1所述的一種特異性檢測轉基因大豆DP-356043的標準質粒分子在檢測轉基因大豆DP-356043品系中作為陽性標準物質的應用。
全文摘要
本發明涉及一種特異性檢測轉基因大豆DP-356043的標準質粒分子及其應用，構建了適用于轉基因DP-356043品系特異性檢測的標準質粒分子，其包含轉基因大豆DP-356043的品系特異性序列和大豆內源標準基因Lectin的特異性片段，對所述的標準質粒分子在轉基因大豆PCR檢測中的適用性進行了驗證表明，所述的標準質粒分子高度特異于轉基因大豆DP-356043品系的檢測。
文檔編號C12N15/63GK102533832SQ201210058620
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月8日 優先權日2012年3月8日
發明者李文華, 楊正友, 田園, 趙鳳春 申請人:山東農業大學