專利名稱：甘蔗細胞懸浮液制備方法
技術領域：
本發明涉及甘蔗細胞工程育種領域，尤其是一種甘蔗細胞懸浮液制備方法。 技術背景
植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中 進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。由于液體培養基的旋轉和 震蕩，使得愈傷組織上分裂的細胞不斷游離下來。液體培養基中的培養物是混 雜的，既有游離的單個細胞，也有較大的細胞團，還有接種殘渣。目前植物細 胞懸浮培養技術已經廣泛應用于植物細胞的形態、生理、遺傳、凋亡等研究工 作，特別是為基因工程在植物細胞水平上及植物化學誘變育種的操作提供了理 想的材料和途徑。遺傳轉化或者化學誘變的植物細胞經過誘導分化形成植株， 即可獲得攜帶有目標基因的或者誘變后變異的個體。目前采用的植物細胞懸浮 液制備方法通常為直接對外植體進行液體振蕩培養，或者以第一代愈傷組織， 即第一次從外植體分化的愈傷組織作為振蕩培養材料，這種類型需要較長的液 體振蕩培養多個周期，每個周期12 18天，需要時間長。而且，每個周期必須 進行液體培養基的更換，以達到細胞數增殖的目的。由于進行液體培養基的更 換操作必須在無菌條件下進行，操作不當，容易造成培養材料受污染，與固體 培養相比較，操作難度更大，培養材料容易在更換液體培養基的過程中被污染。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能簡便高效地獲得甘蔗細胞懸浮液的制備方法。
本發明通過以外植體、第一代愈傷組織、第二代愈傷組織、第三代愈傷組 織和顆粒狀愈傷組織等多種類型材料作為液體振蕩培養材料，試驗了 90rpm/min, 120rpm， 180rpm及220rpm/min等多個搖床轉速，對不同2. 4-W農度
液體培養基進行了比較研究，最終獲得了簡便制備甘蔗細胞懸浮液的方法。
本發明以生長旺盛期的甘蔗新葉作為外植體，通過三次固體培養，使得培 養材料愈傷組織數量得到大量增殖。第一次采用[化+2.4-0(3!1^/1)+瓊脂(7§幾)+ 蔗糖(30g/L) +活性碳(0.5g/L)]固體培養基培養，即采用較高的2.4-D濃度，培養15 20天，使得外植體快速分化獲得甘蔗愈傷組織。第二次和第三次繼代 培養均采用以上相同的培養基，僅降低2.4-D濃度至2mg/L和減去了活性碳，每 次培養時間為25 30天，使得第一次培養分化出的愈傷組織充分增殖并風化為 顆粒狀愈傷組織，即再經過兩次[N6+2.4-D(2mg/L)+瓊脂7(g/L) +蔗糖(30§/1)] 的固體培養基培養，獲得顆粒狀甘蔗愈傷組織。以此愈傷組織作為懸浮培養材 料，以2.4-D濃度為lmg/L的液體培養基作為培養液，在搖床上振蕩培養，搖床 轉速為120rpm/min，搖床溫度為28'C，培養12天后，培養液中的顆粒狀愈傷組 織即分散為較均勻的細胞小團塊，團塊細胞數目在1 200之間。在無菌條件下， 將此懸浮液轉接到離心管中，在轉速為5000rpm的轉速下離心20分鐘，去除上清 液；將得到的細胞或者細胞團溶解于N6液體培養基中，在搖床轉速為 120rpm/min，搖床溫度為28。C，培養48小時，即可得到分散均勻的甘蔗細胞懸 浮液。
所述的外植體是指拔節期無病蟲危害健康植株的甘蔗新葉，經過75%酒精消 毒處理后，切割為2 3毫米長作為外植體。
所述N6液體培養基是指[Ne+2.4-D (lmg/L) +蔗糖(30g/L)]。 有益效果
懸浮培養獲得的甘蔗細胞團是進行甘蔗基因工程育種、誘變育種、細胞學 研究的理想材料。特別是在甘蔗化學誘變育種中，與采用塊狀愈傷組織或者幼 嫩新葉作為誘變受體相比較，采用懸浮細胞系作為誘變受體能夠有效提高誘變 效率。本發明提出的甘蔗細胞懸浮液制備方法采用三次固體培養基培養，使得 外植體分化的愈傷組織得到了充分增殖，僅采用了一個12天的液體振蕩培養周
期和一個2天的細胞分散培養；簡化了液體培養過程中多次更換液體培養基以達 到細胞數量增殖的操作過程，縮短了液體振蕩培養周期，不需要多次更換液體 培養基，降低了材料因多次更換液體培養基導致污染的風險；該細胞懸浮液制 備方法可作為甘蔗科研單位或相關育種機構借鑒利用。
具體實施例方式
一種甘蔗細胞懸浮液制備方法，實施中用到的儀器設備有超凈工作臺、滅 菌鍋、控溫搖床和超速離心機等，其詳細實施步驟如下
1、愈傷組織培養在甘蔗拔節以后，選擇無病蟲危害的健康植株，采取幼嫩新葉，用自來水洗凈，以75%酒精擦洗消毒，在無菌工作臺內剝去外層老葉，
每剝一層，以75%酒精擦洗消毒一次，最后一層新葉無需再進行消毒。選擇自 甘蔗莖尖生長點2 3厘米長的新葉作為外植體，將其切為2 3毫米長后，接 種到固體培養基上[Ne+2.4-D (3mg/L) +瓊脂(78幾)+蔗糖(30g/L) +活性碳 (0.5g/L)]，每個培養皿培養8 10個外植體，在暗環境，溫度28 30'C下培 養時間為15 20天，即可得到第一次由外植體分化的愈傷組織。
2、 顆粒狀愈傷組織培養顆粒狀愈傷組織培養包含兩次繼代過程。首先， 在無菌條件下，將步驟1所得到的愈傷組織接種到[N6+2.4-D (2mg/L) +瓊脂 (7g/L)+蔗糖(30g/L)]的固體培養基上。接種過程中，選擇分化良好的愈傷組 織進行繼代培養，去除褐化及死亡的外植體或者愈傷組織。每個培養皿接種6 8塊大小適中的愈傷組織，自然光，室溫培養25 30天，使愈傷組織充分分化； 然后，在無菌條件下將得到的甘蔗愈傷組織接種到如上述相同的固體培養基中， 自然光室溫下繼續培養25 30天，即可以得到活性較好、黃綠色的顆粒狀愈傷 組織。
3、 顆粒狀愈傷組織懸浮培養在無菌條件下，將按照步驟2所述得到的顆 粒狀愈傷組織接種到N6液體培養基中[艮+2，4-D (lmg/L) +蔗糖(30g/L)]，在 搖床上振蕩培養12天，搖床轉速為120rmp/min，溫度為28°C。因為用于振蕩 培養的愈傷組織己經為小的顆粒狀，因此，經過12天的振蕩培養后即均勻分散 為小的細胞團塊，懸浮于液體培養基中。液體振蕩培養的目的在于將固體培養 階段得到的顆粒狀愈傷組織分散為均勻更小的細胞團塊。
4、 懸浮物離心在無菌條件下，將步驟3所述的小細胞團塊溶液轉接到離 心管中進行離心，離心機轉速設置為5000rpm/min，離心20min。在無菌條件下， 去除上清液，留下離心沉積物。
5、 細胞懸浮液的獲得在無菌條件下，將步驟4所得到的離心沉積物轉接 到如步驟3所述的液體培養基中，在轉接的過程中，去除褐化、死亡的小細胞 團塊和大的細胞團塊。搖床上振蕩培養2天，搖床轉速為120rmp/min。即可得 到分散均勻的甘蔗細胞懸浮液。
權利要求
1、一種甘蔗細胞懸浮液制備方法，其特征在于以甘蔗新葉作為外植體，采用三次固體培養基培養得到顆粒狀甘蔗愈傷組織，第一次培養時間15～20天，第二次和第三次培養時間各為25～30天；顆粒狀甘蔗愈傷組織接種到N6液體培養基中，在轉速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養12天后，將培養液中的懸浮液轉接到離心管中，在轉速為5000rpm的轉速下離心20分鐘，去除上清液；留下的離心沉積物轉接到N6液體培養基中，在轉速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養48小時，即可得到分散均勻的甘蔗細胞懸浮液。
2、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述三次固體培養基 培養時，第一次采用[N6+2. 4-D (3mg/L) +瓊脂(7^0+蔗糖(30g/L) +活性碳(0. 5g/L)]固體培養基，第二次和第三次采用[N6+2. 4-0(211^/0+瓊脂(78/1) + 蔗糖(30g/L)]固體培養基。
3、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的外植體選擇自 甘蔗莖尖生長點2 3厘米長的新葉，經過75%酒精消毒處理后，切割為2 3 毫米長作為外植體。
4、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的N6是指[N6+2.4-D (lmg/L) +蔗糖(30g/L)]液體培養基。
全文摘要
甘蔗細胞懸浮液制備方法，以甘蔗新葉作為外植體，采用三次固體培養基培養得到顆粒狀甘蔗愈傷組織，甘蔗愈傷組織接種到N6液體培養基中，在轉速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養12天后，將培養液中的懸浮液轉接到離心管中，在轉速為5000rpm的轉速下離心20分鐘，去除上清液；留下的離心沉積物轉接到N6液體培養基中，在轉速為120rpm/min、溫度為28℃的搖床上振蕩培養48小時，即可得到分散均勻的甘蔗細胞懸浮液；本發明簡化了液體培養過程中多次更換液體培養基以達到細胞數量增殖的操作過程，縮短了液體振蕩培養周期，不需要多次更換液體培養基，降低了材料因多次更換液體培養基導致污染的風險。
文檔編號C12N5/04GK101434932SQ200810233740
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月22日 優先權日2008年12月22日
發明者侯朝祥, 杰 催, 劉家勇, 劉新龍, 吳才文, 坤 楊, 俊 趙, 趙培方, 陳學寬 申請人:云南省農業科學院甘蔗研究所