用于細胞破碎和/或回收生物分子的微粒的制作方法
【專利說明】用于細胞破碎和/或回收生物分子的微粒
[0001] 發明技術領域
[0002] 本發明一般設及回收生物分子和細胞破碎的領域，特別設及從細胞懸浮液回收細 胞內生物分子諸如多膚或多聚核巧酸。它覆蓋從流體諸如生物流體中回收生物分子的方 法。在進一步方面，本發明設及細胞培養和從細胞培養中純化生物分子的領域。
[圓]發明背景
[0004] 盡管之前做了所有的努力來發展人工生產系統，生物實體如細胞在生產復雜物質 如抗生素、蛋白質和核酸方面的能力是無與倫比的。如今幾乎所有的工業生產的細胞起源 物質都是在細胞內產生隨后被排泄到環境中的細胞外產品。然而，一大部分潛在有用的物 質仍然保留在細胞內。為了釋放細胞內物質，細胞典型地通過機械、物理、化學或酶的方法 而被解體。有價值的細胞產品的回收效率同它們在生物系統內的形成、位置及其相互作用 密切聯系。在過去的數十年，對運些細胞系統內的分子結構和它們的功能的調查已經增強 了此類產品及其大規模加工的多元化。與此同時，特別是在醫療保健部口，對于產品質量的 需求使交付定義良好的、有效的和高純度物質成為必要。
[0005] 現行的細胞破碎方法包括機械和非機械方法。非機械方法包括物理(減壓、滲透休 克法、熱分解、冷凍干燥、微波）、化學(抗生素、馨合劑、洗涂劑、溶劑、堿金屬、超臨界C〇2)和 酶的（溶解、自溶、隧菌體)方法。另一方面，用于細胞破碎的機械途徑和設備包括玻珠研磨 機、拌勻器、空化(超聲波、水動力）和微射流機。只有一些細胞破碎方法(主要為機械工 業規模進行，其中它們通常集中在下游(如回收，凈化)處理。
[0006] 對于大規模而言，最常見的機械方法是玻珠研磨和高壓勻質化，它們典型地作為 標準操作來實施。當使用高壓勻質化時，在高壓下細胞溶液被強制通過一個狹窄的閥口。通 過閥口時細胞經受端流、空化，高剪切力和撕裂細胞排放時突然的壓力下降。建設時必須考 慮到閥口的應力和腐蝕，閥口的應力和腐蝕隨著均質壓力的增加而增加。進一步地，該溶液 溫度隨著壓力的增大而升高，致使該方法耗費能源，使該設備冷卻且必須暫停，特別是當釋 放了溫度不穩定的酶。大約超過90%的電力被拌勻器W熱量消散形式而消耗，冷卻成本占 細胞解體總成本的很大一部分。進一步地，為了達到足夠高的產量，經常需要連續的通道 化ula等人，"Purification of Proteins and the Disruption of Microbial Cells." Biotechnology Progress 1987)。
[0007] 玻珠研磨中，將珠加入生物流體中，隨后通過攬拌或振動來高速攬動。通過珠的碰 撞，細胞被破壞，細胞內內容物被釋放。玻珠研磨還產生熱量，需要冷卻。運是一個相當復雜 的過程，其受到各種包括玻珠研磨機的建設、操作參數和產品具體特性的參數的影響。玻珠 研磨機的建設和幾何結構是關鍵的過程變量。然而，通常較小型玻珠研磨機與工業規模玻 珠研磨機在幾何學上不相同，運促使從實驗室測試到批量處理的數據外推法變得復雜 化ula等人，"Purification of Proteins and the Disruption of Microbial Cells." Biotechnology Progress 1987)。
[000引機械破碎方法存在幾個缺點。由于細胞被完全破壞，所有的細胞內材料被釋放，由 此增加了中間產品的污染物含量。因此，必須將感興趣的產品從蛋白質、核酸和細胞片段的 復雜混合物中分離。此外，釋放的核酸可增加該溶液的粘度，可使隨后的處理步驟例如色譜 法變得復雜。通過機械解體產生的細胞碎片通常由小的細胞片段組成，運使溶液難W澄清。 完全的產品釋放通常要求多于一個穿過破壞裝置，其通過進一步減少片段尺寸使得運個問 題更加嚴重。由于該裝置的生產能力與顆粒直徑的平方成反比，運些都是很難通過連續離 屯、分離被除去。勻漿粘性性質和它對膜的污染傾向使過濾變得復雜。此外，機械方法要求定 期保養和昂貴的設備且是耗能的。它們產生熱量，要求大范圍冷卻W便能被用于溫度敏感 酶。進一步地，它們使細胞和由此提取的產品暴露于高剪切應力中。大部分產品將由于產生 的熱量而變性，除非該裝置經過充足的冷卻。
[0009] 如上所述，更多選擇性的釋放方法包括物理、化學或酶處理。化學處理包括應用 EDTA、離液劑、有機溶劑、抗生素、酸、堿金屬和表面活性劑。除了過量化學品的廢物處理的 問題，運些方法是相當昂貴的，因此不適合大規模應用。另一個缺點是該類化學品對預期產 品有污染。有些化學物質的選擇性不強，往往會損害敏感蛋白、酶和細胞壁。
[0010] 當應用于具有幾個不同的層如細菌細胞壁的復雜細胞結構時，酶細胞破碎更為具 體但是通常有限。此外，運受限于酶和緩沖液的成本。因此，酶處理不適用于大規模或工業 規模。另一個缺點是，酶對預期產品有潛在污染。
[0011] 物理透化作用通過凍融或滲透壓沖擊處理來完成。凍融需要多次循環來實現有效 產品的釋放，該過程可能相當漫長。另一方面，滲透壓沖擊處理可能不足W破壞具有堅固細 胞壁結構的細胞。
[0012] 總而言之，運些方法的劣勢包括成本相對高、大規模的實用性低、效率低、重現性 差，釋放后需要去除所添加的物質。
[0013] 考慮到細胞生產系統的潛力，需要回收生物分子的替代方法，特別是從細胞懸浮 液中回收生物分子的易于處理的、具有成本效益的和可擴展的替代方法。此外，該方法對敏 感性生物分子應足夠溫和，能夠回收高選擇性的生物分子從而生產低污染的產品。因此本 發明的一個目的是提供一種能克服一個或多個上述缺點的方法或系統。
[0014] 必須指出的是，除非上下文有其它明確指示，本文所使用的單數形式"一 (a)"、"一 (an)" W及"所述(the)"包括復數描述。因此，例如，提及的"試劑"包括一種或多種運種不同 的試劑，提及的"所述方法"包括本領域普通技術人員已知的等效的步驟和方法，其可W被 修改或替代本文所述的方法。
[0015] 除非另有說明，一系列元素之前的術語"至少"將被理解為是指該系列中的每一個 元素。本領域技術人員將承認或僅使用常規實驗能夠確定本文所述的具體實施方案的許多 等價方案。運種等價方案意圖包含在本發明中。
[0016] 術語"和/或"無論在本文何處使用均包括"和"、"或"和"該術語所連接的元素的全 部或任何其它組合"。
[0017] 本文使用的術語"紛'或"近似"意為在給出的值或范圍的20%內，優選為10%內， 更優選為給出的數值或范圍的5%內。然而它還包括具體數目例如約20包括20。
[0018] 術語"小于"或"大于"包括具體數目。例如，小于20意為小于或等于20。同樣地，多 于或大于分別意為多于或等于、或大于或等于。
[0019] 本發明全文及其所附的權利要求中，除非上下文有其它要求，詞語"包括 (comprise)" W及變形詞語諸如"包括(comprises)"和"包括（comprising)"將被理解為意 指包括陳述的整數或步驟、或整數或步驟的集合，但并不排除任何其它的整數或步驟、或整 數或步驟的集合。當本文使用術語"包括komprising)"時能夠術語"含有(con化ining)"或 "包含(including)"替代，或有時本文使用時會W術語"具有"替代。
[0020] 當本文使用"由…組成"意為排除了權利要求要素中未規定的任何元素、步驟或成 分。當本文使用"本質上由…組成"并不排除實質上不影響權利要求的基本特征和新穎性特 征的材料或步驟。
[0021] 本文每一個實例中，術語"包括"、"本質上由…組成"和"由…組成"中的任意一個 可被其它兩個術語中的任意一個替代。
[0022] 應該理解的是，本發明并不限于本文所述的具體的方法學、方案、材料、試劑和物 質等，因為運些能夠改變。本文所使用的術語只用于描述特定實施方案的目的而并不意在 限制本發明的范圍，本發明的范圍僅由權利要求限定。
[0023] 本說明書全文所引用的所有出版物和專利(包括所有的專利、專利申請、科學出版 物、制造商說明書、指導書等），無論在前還是在后，其W全文并入本文。由于在先發明，本文 不能被解釋為承認本發明不早于運樣的公開物。在一定程度上，通過引入方式并入的材料 或與本說明書矛盾或不一致，本說明書將取代任何運樣的材料。
[0024] 發明簡述
[0025] 本發明提供新型的獲得生物分子的方法，也被稱為克服了上述一個或多個缺點的 生物分子回收方法。該方法能夠被用于從液體和流體中獲得生物分子，該液體和流體為例 如細胞培養、細胞勻漿、細胞裂解液、細胞懸浮液、發酵液、培養液、發酵上清液、培養上清 液、細胞上清液，諸如大腸桿菌、畢赤酵母和C冊細胞培養。此外，本發明設及細胞破碎的方 法，該方法能夠用于釋放包含于細胞中的生物分子。如將在說明書中顯示的，本發明特別用 于破壞細胞和回收細胞內生物分子。本文公開的方法簡單、具有成本效益，可擴展為工業應 用。該方法提供一種簡單的選擇性回收生物分子的過程，其中除了緩沖液和鹽之外，既不需 要復雜的設備，也不需要可溶性添加劑。如前述，從細胞懸浮液回收生物分子的現有技術設 及或是機械應力和/或是化學添加劑。與如今應用于工業規模的常規方法相比，本發明的方 法溫和，不需要將所述細胞和/或所預期的生物分子產品置于苛刻條件下。因此，本文公開 的方法減少了污染的碎片量，對預期生物分子所施加的潛在的有害機械和物理應力較小。
[0026] 本發明人已經驚奇地發現，包含磨碎的樹脂的帶電荷微粒或疏水微粒能夠從生物 流體中回收(本文還稱之為"萃取"）生物分子。此外，在一些實施方案中，當向細胞懸浮液中 加入帶電荷微粒時，該帶電荷微粒能破壞細胞，同時還能吸附從細胞中釋放的生物分子。因 而，一個方面，所述微粒能夠用于破壞細胞并釋放生物分子，進一步W簡單、可擴展的方式 吸附生物分子。某些方面所述微粒已經被發現能與細胞和/或生物分子和/或帶相反電荷的 微粒相互作用而形成絮凝物，并能容易地從生物流體中被分離出去。因而，通過分離絮凝物 和絮凝物上所吸附的生物分子能夠容易地回收所釋放的生物分子。因此本發明進一步提供 簡單的方法，其中，下游處理中的細胞破碎步驟和生物分子萃取步驟被合并。運種技術被稱 為膠體固相萃取(CSPE)。不受理論的約束下，可假設來源于陽離子交換樹脂的帶正電荷微 粒通過吸附至帶負電荷的細胞表面而與細胞形成了絮凝物，由此置換了陽離子，特別是巧 和/或儀離子，運些離子與特別是細菌細胞的常規帶負電荷細胞表面相互關聯。因此，該構 造細胞膜的分子的排列（lining up)在某種程度上不穩定，由此該細胞開始滲漏。
[0027] 在來源于馨合陽離子交換樹脂的帶負電荷顆粒的情況下，假設該顆粒結合了陽離 子，特別是巧和/或儀離子，由此減弱了建立細胞膜的分子排列的穩定性。對于疏水微粒，也 發現其形成絮凝物。
[0028] 通過W低片段細胞結構（如細胞壁)溫和地"打開"細胞，是目前萃取細胞內生物分 子的唯一的方法，其減少了污染水平。同時，該項新技術允許選擇性萃取生物分子，其可與 本領域已知的機械破壞離子方法如高壓勻質化和玻珠研磨相比，但在效率方面，其提供了 較高的選擇性和較低的污染水平。同時，利用本文公開的該項新技術，可能在保持細胞的完 整性的情況下回收所預期的生物分子。因此，"打開"細胞意為該細胞無論如何優選不被完 全破壞。相應地來說，優選地所述"打開"意為該細胞開始滲漏而由此釋放它們的細胞質成 分。
[0029] 第一方面，本發明提供帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒用于回收生物分子 的新用途，其中所述帶正電荷的微粒包括磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，其中所述帶負電 荷的微粒包括磨碎的聚合的陽離子交換樹脂。在一個實施方案中，只使用帶正電荷的微粒。 在另一個實施方案中，只使用帶負電荷的微粒。在進一步的實施方案中，既使用帶正電荷的 微粒也使用帶負電荷的微粒。
[0030] 本發明的第二方面，所述組合物包含疏水微粒。運些疏水微粒尤其能夠吸附膚或 多膚，還吸附其它生物分子。用于吸附的機制被認為首先是基于所吸附的配體如膚或多膚 的疏水部分和微粒的聚合物表面之間的疏水(范德華，倫敦型）引力。
[0031] 如本文所述，該微粒可通過研磨樹脂獲得(能夠獲得），例如，通過研磨離子交換樹 脂并任選對該磨碎的樹脂進行調節。本發明中運些顆粒被稱為"微粒"、"吸附性顆粒"、"吸 附劑"、"顆粒"、"磨碎的顆粒"或"磨碎的樹脂"。運些術語交替使用。優選地，所述微粒通過 研磨常規的大直徑小孔隙的微粒來獲得，該類顆粒通常意圖用于例如水的去離子化和廢水 處理。
[0032] 所述帶正電荷的微粒能夠通過研磨陰離子交換樹脂來制備。該陰離子交換樹脂可 W是弱堿性或強堿性。同樣地，陽離子交換樹脂能夠被用來制備所述帶負電荷的微粒。該陽 離子交換樹脂可是弱酸性或強酸性。本發明的一些實施方案中，所述陽離子交換樹脂和/或 陰離子交換樹脂可W是馨合樹脂。
[0033] 根據本發明的離子交換樹脂能夠基于任何適當的材料。優選地，所述樹脂為聚苯 乙締基的、甲基丙締酸徑乙醋化EMA)基的、甲基丙締酸二甲氨基乙醋(DMAEMA)基的、聚甲基 丙締酸二甲氨基乙醋(pDMAEMA)基的、聚丙締酷胺基的、甲基丙締酸(MAA)基的。更優選地， 所述樹脂為W二乙締基苯(DVB)交聯的聚苯乙締。
[0034] 優選地，所述微粒為磨碎顆粒的形式，該顆粒平均粒徑小于約ΙΟμπι，例如小于約扣 ΓΠ 〇
[0035] 根據本發明的微粒能夠通過研磨陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂而獲得。陰離 子交換樹脂可W是，例如Amberlite IRA-400、Ambe;rlite IRA-485、Dowex lX2-100、Dowex l-8-100、DIAI0N SA 20A、Marathon A2或其它本領域所知的陰離子交換樹脂；陽離子交換 樹脂可W是，例如Amberlite IRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex 50WX8-100、DIAI0N SK 110、Marathon MSC或其它本領域所知的陽離子交換樹脂。優選的陰離子交換樹脂包括 Amberlite IRA-458和Marathon A2。優選的陽離子交換樹脂包括Amberlite IRC-748。
[0036] 在另一方面，本發明提供了帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒或本文公開的 疏水微粒吸附生物分子的用途，所述生物分子優選蛋白質或多聚核巧酸，諸如DNA如源于流 體的質粒DNA、粘粒DNA、BAC DNA、YAC DNA、微環DNA。所述流體是生物流體，諸如細胞勻漿、 發酵上清液、發酵液、培養液、培養上清液、細胞裂解液或細胞懸浮液。
[0037] 進一步地，本發明提供本文所公開的微粒用于細胞破碎的用途。優選地，該破碎的 細胞釋放吸附于微粒上的生物分子。運些被破壞的細胞包括真核細胞和原核細胞。在一個 實施方案中，所述細胞是原核細胞。該細胞可選自但不限于W下:腸桿菌科、假單胞菌科、乳 酸菌科或芽抱桿菌科。在一個優選的實施方案中，該細胞為大腸桿菌。
[0038] 在進一步的方面，本發明提供一種獲得生物分子的方法，該方法包括將帶正電荷 的微粒和/或帶負電荷的微粒或本文所公開的疏水微粒加入生物流體中并從該生物流體中 回收所述生物分子。在一些實施方案中，該方法進一步包括允許所述微粒形成絮凝物，從所 述生物流體中去除該絮凝物，W及從該絮凝物中解吸生物分子。在某些情況下，根據所要回 收的生物分子，所述微粒可被用來和不想要的細胞結構一起形成絮凝物，去除該絮凝物后， 所述流體中的生物分子被回收。通過例如離屯、或過濾能夠從生物流體中去除絮凝物。在一 個實施方案中，在加入所述微粒期間或之后，和/或從所述絮凝物或所述生物流體中解吸生 物分子期間，攬拌生物流體。
[0039] 本發明進一步提供一種破壞細胞的方法，該方法包括向細胞懸浮液中加入帶電荷 的微粒和/或疏水微粒。所述帶電荷的微粒可W是帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒。 在某些方面，該方法進一步包括從所述細胞中釋放生物分子。此外，本發明還提供一種生物 流體和帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒或疏水微粒。
[0040] W下將通過描述和實施例來使本領域技術人員了解本發明的確切性質及優點。本 發明并不限于所公開的優選實施方案或實施例。本領域技術人員能夠容易地根據本發明所 教導的內容從而獲得其它的實施方案和應用。
[004。附圖簡要說明
[0042] 圖l:Marathon MSC(MMSC)、Marathon A2(MA2)、Amberlite IRC748和Amberlite IRA458的官能團和它們與聚合物基體的結合位點的化學結構示意圖。
[0043] 圖2 :Marathon A2微粒的細胞體積濃度、樹脂與細胞的體積比率對從培養（50mM TRIS，抑8.0) 1小時的GFP表達的大腸桿菌中回收GFP的影響。
[0044] 圖3:Marathon A2微粒的樹脂與細胞的體積比率對從培養(50mM TRIS，pH 8.0)1 小時的GFP表達的大腸桿菌（10 % v/v)中回收GFP的影響。
[0045] 圖4: WMarathon A2微粒(樹脂與細胞的體積比率為100 %、70%、50%、30%、0%) 在抑值(7.5、8.0、8.5)下靜態培養0.2-3小時，pH、培養時間W及樹脂與細胞的體積比率對 從包含GFP表達的大腸桿菌的細胞培養液中回收GFP的影響。
[0046] 圖5:經Marathon A2微粒(樹脂與細胞的體積比率為100 %、70 %、50 %、30 %、0 % ) 在不同的化Cl濃度（500mM、100mM、50mM、0mM)下培養（50mMTRIS，pH8.0)l小時并經lM NaCl洗脫后，鹽濃度對從GFP表達的大腸桿菌(10 % v/v)中回收GFP的影響。
[0047] 圖 6:在不同濃度的化 Cl(500mM、100mM、50mM、0mM)下靜態培養（50mMTRIS，pH 8.0)并經1M NaCl洗脫后，通過在Marathon A2微粒(樹脂與細胞的體積比率為100%、70%、 50%、30%、0%)上吸附而從大腸桿菌細胞（10%v/v)所萃取的GFP的平衡容量。通過經lM NaCl洗脫前和后的巧光性來量化水相中的GFP。不同的GFP量被認為吸附在樹脂上。趨勢符 合標準的"蘭繆爾"方程式。
[004引圖7:經馨合Amberlite IRC748微粒(樹脂與細胞的體積比率為70%、30%)-起攬 拌（1-2小時，50mM TRIS，pH 8.0)，不經過1M化C1洗脫，該培養條件對從GFP表達的大腸桿 菌(5%v/v)中回收GFP的影響。
[0049] 圖8:經馨合Amberlite IRC748微粒(樹脂與細胞的體積比率為100%、70%、30%) 2小時靜態培養(50mM TRIS，pH 8.0)，經過或不經過1M化C1洗脫后，樹脂與細胞的體積比 率和洗脫對從GFP表達的大腸桿菌(5 % v/v)中回收GFP的影響。
[0050] 圖9:經馨合Amberlite微粒(樹脂與細胞的體積比率為70% )2小時攬拌培養(50mM TRIS，pH 8.0)后，GFP表達的大腸桿菌的細胞體積濃度(20 %、15 %、10 %、5 % v/v)對回收 GFP的影響。
[0051 ]圖10:經馨合Amberlite微粒（樹脂與細胞的體積比率為70% )2小時攬拌培養 (50mM TRIS，pH 8.0)后，不同細胞體積濃度(20 %、15 %、10 %、5 % v/v)下GFP表達的大腸桿 菌的GFP萃取動力學。
[0化2] 圖11:經丙締酸IRA 458微粒比率(樹脂與細胞的體積比率100%、70%、50%v/v) 靜態培養1-3小時并經不同濃度的化Cl (1.0M、0.5M、0M)洗脫后，樹脂與細胞的體積比率對 從SOD表達的大腸桿菌（10% v/v)中回收SOD的影響。通過SDS-化ge密度測定法確定SOD的 量。
[0053] 圖12:經丙締酸Amberlite IRA 458微粒（樹脂與細胞的體積比率100%、70%、 50 % v/v)短暫混合并培養(50mM TRIS，pH 7.7)，并經不同濃度的NaCl (1.0M、0.5M、0M)洗脫 后，從10%v/v細胞懸浮液中獲得的大腸桿菌勻漿中回收SOD。通過SDS-化ge密度測定法確 定SOD的量。
[0