專利名稱：：一種轉移柑橘胞質雄性不育性狀的方法
技術領域：
：本發明屬于植物新品種選育
技術領域：
，具體涉及一種轉移柑橘胞質雄性不育性、創造二倍體無核柑橘新品種的方法。
背景技術：
：柑橘是世界和我國南方最重要的果樹，目前我國柑橘栽培面積、產量均居世界首位。附橘產業覆蓋我國南方廣大山區、庫區，發揮著巨大的經濟、社會和生態效益。我國柑橘產業在取得突出成績的同時，也面臨著一些問題。品種方面，我國柑橘品種可分為兩類，一類是引進品種，這類品種在出口方面將面臨著巨大的競爭壓力；另一類為我國特色品種，我國是柑橘資源大國和起源中心，有很多特色品種，但唯一不足是多數品種果實有籽，影響其品質的進一步提高和出口競爭能力進一步提升。我國柑橘特色品種的無核化改良，幾十年來，一直是柑橘育種者努力的主要方向和目標。柑橘育種實踐表明，通過倍性育種，即培育三倍體可以達到無核。60年代，美國Soost等開始人工培育無核柑橘品種研究，通過二倍體與同源四倍體雜交，培育了'0roblanco'葡萄柚等三倍體無核品禾中(SoostRK，CaraeronJW,1980,0roblanco，atriploidpummelo—grapefruithybrid.HortSci，15:667-669)。但柑橘天然同源四倍體較少，人丄誘變也較為困難，而且同源四倍體往往育性較低，限制了該育種途徑的廣泛應用，而且這一途徑耗時長，Soost等培育以上品種花了近20年的時間。上世紀八十年代以來，柑橘細胞融合技術的發展和應用為柑橘無核育種提供了新思路。1985年Ohgawara等]獲得了柑橘屬間體細胞雜種(0hgawaraTetal.1985,Somatichybridplantsobtainedbyprotoplast.fusionbetweenCitrussinensisandPoncirustrifoliata.TheorApplGenet71:1-4)。迄今世界上已獲得200余個組合的種間、屬間異源四倍體體細胞雜種(GrosserJTV&FGGmitterJr.,2005.Applicationofsomatichybridizationandcybridizationincropimprovement,withcitrusasamodel.InVitroCellDevBiolPlant41:220-225)。柑橘細胞融合一般采ffl"懸浮系原生質體+葉肉原生質體"的模式，利用柑橘葉肉原生質體在目前體系下單獨培養或者共培養都不能分裂再生成株的特點，是一種半篩選體系。但部分融合組合中，再生植株除預期的異源四倍體體細胞雜種和懸浮系親本再生類型外，還再生了葉片形態類似葉肉親本的二倍體植株(鄧秀新，郭文武，余桂紅，2000，柑橘細胞融合再生9個組合一倍體葉肉親本類型植株。園藝學報，27(1):1-5)。這類植株已在近40例融合組合中出現，而且絕大多數是種間融合組合。部分融合組合的葉肉親本型植株經分子雜交、PCR—RFLP或SSR分析鑒定'表明其核DNA來自葉肉親本，mtDNA來自懸浮系親本，cpDNA隨機遺傳，即葉肉親本型植株實際上是雜種起源的，為胞質雜禾中(Moriguchi等1996.GenotypesandparentalcombinationinfluenceefficiencyofcybridinductioninCitrusbyelectrofusion.HortSci31:275-278;郭文武，鄧秀新'2000，柑橘胞質雜種及其胞質遺傳重組。園藝學報'27(增刊):487-491;Cabasson等2001.Non-randorainheritanceofmitochondrialgenomesinCitrushybridsproducedbyprotoplastfusion.PlantCellRep20:604-609;GuoW等，2006，Molecularanalysisrevealedautotetr即loid，diploidandtetraploidcybridplantsregeneratedfromaninterspecificsomaticfusioninCitrus.ScientiaHorticulturae108:162-166)。柑橘細胞對稱融合可以再生二倍體葉肉親本型胞質雜種的現象以及其分子水平上的組成特征為有針對性地選配融合組合、轉移由線粒體基因組控制的胞質雄性不育性狀、從而改良多籽柑橘品種提供了很好的實驗體系。即將不育品種的懸浮系原生質體與有籽品種的葉肉原生質體融合，再生出有籽品種的二倍體植株，但帶有了無籽品種的雄性不育胞質基因，有望改良有籽品種，使其不育，從而生產出無籽果實，實現二倍體水平上的無籽。大量有性雜交研究表明，溫州蜜柑的雄性不育性由核質基因互作引起，為細胞質雄性不育類型(CMS)(Yam咖oto等1997.AbortedanthersofCitrusresultfromgene-cytoplasmicalesterility.SciHortic70:9-14)。因此，有針對性地開展溫州蜜柑與其它多籽柑橘類型間的融合研究，具有重要意義。若能獲得二倍體葉肉親本型胞質雜種，則可能實現其胞質雄性不育性狀的有效轉移，從而可能一步獲得二倍體無核果實。在本發明做出以前，從未有人專門開展雄性不育溫州蜜柑與其它多籽柑橘類型間的融合，以期培育二倍體無籽柑橘胞質雜種的研究
發明內容本發明的目的在于克服已有技術的不足，通過細胞對稱融合，人工創造柑橘種間二倍體葉肉親本型胞質雜種，在1年內實現胞質雄性不育性狀的有效轉移，將有核品種改良為無核品種，同時不改變原品種的其農藝性狀。本發明是通過以下技術實現一種轉移柑橘胞質雄性不育性狀的方法，包括原生質體融合，胞質雜種培養，再生和倍性鑒定。本發明的技術方案是將雄性不育型的柑橘品種愈傷組織懸浮系原生質體與有核型柑橘品種的葉肉原生質體融合，通過再生，將雄性不育型懸浮系親本的線粒體基因組轉移到有核柑橘品種上，得到含雄性不育基因組的無核的二倍體柑橘葉肉品系。詳細的技術方案如下所示1)雙親材料的選擇以雄性不育溫州蜜柑愈傷組織為親本，取保存于MT固體基本培養基上的雄性不育的柑橘品種溫州蜜柑胚性愈傷組織于液體懸浮培養基進行懸浮培養，以12-14天為1個繼代培養周期，暗培養，溫度為28。C左右，搖床轉速控制在115rpin左右；繼代培養3個周期后進行原生質體分離，以有核柑橘為葉肉親本，將所述的溫州蜜柑愈傷組織或有核柑橘葉肉分別用添加有緩沖液A或緩沖液B的酶液進行原生質體分離和純化，得到原生質體；2)將步驟l)的原生質體用電融合法融合，得到融合產物；3)將步驟2)的融合產物離心，去掉上清，將沉淀轉入BH3培養基，培養大約20-30天，當原生質體分裂形成多細胞團時及時降低培養基的滲透壓至O.45M并擴大培養面，待細胞團長到直徑為O.5-1.0cm時，轉入胚狀體誘導培養基上誘導培養，使其分化出球形胚或心形胚，及時將所述的球形胚或心形胚轉移到胚狀體增殖培養基上使其轉綠和進一步發育成子葉形胚狀體；選取子葉形胚狀體轉入生芽培養基誘導生芽，將獲得的叢芽轉入生根培養基誘導生根；將生根的雜種植株移栽入溫室，得到胞質雜種材料；4)對步驟3)的胞質雜種材料，采用流式細胞儀進行倍性鑒定；以SSR和CAPS分子標記方法進行細胞核基因組和線粒體基因組分析；在本發明中步驟(1)所述的葉肉親本選自沙田柚、冰糖橙，暗柳橙，紅暗柳橙，雜種柚或日輝橘。培養基組成如下緩沖液A:MT基本培養基+0.7mol/L蔗糖+1500mg/LME，調pH至5.8;緩沖液B:MT基本培養基+0.6mol/L蔗糖+1500mg/LME,調pH至5.8;酶液0.6%纖維素酶R-10+0.6%離析酶R-IO+12.8%甘露醇+0.011%NaH2P04+0.12%MES+0.36%CaC12.2H20，調pH至5.8，酶液通過0.22um醋酸纖維微孔濾膜過濾滅菌；MT固體培養基MT基本培養基+40g/L蔗糖，調pH至5.8;;液體懸浮培養基MT基本培養基+500rag/LME+1.5g谷氨酰胺+40g/L蔗糖，補充蒸餾水至1L，調pH至5.8;BH3培養基配方(l升中含量)ME(酵母提取物)l.Og蔗糖51.34g甘露醇81.99g谷氨酰胺3.lgMgS047H200.37gK訓40.17gKC11.5gMT微量元素10mlMTCa+MTvit+MT鐵鹽各10ml水解酪蛋白0.25gYitStockA2.0mlVitStockB1.0mlKIStock1.0ml有機糖貯存液10ml有機酸貯存液10m椰子汁20ml定容到1000ml，pH5.8，過濾滅菌6#KIstock75nig/100ml#有機酸貯存液(mg/100ml)丙酮酸鈉鹽200檸檬酸400蘋果酸400延胡索酸400弁有機糖貯存液(mg/100邁l)果糖2500核糖2500木糖2500甘露醇2500鼠李糖2500纖維二糖2500半乳糖2500甘露醇2500#VitstockAMg/100ml生物素1核黃素10葉酸20對氨基蘋果酸1氯化膽堿50VC100Caloiumpantathenase50#VitStockBMg/100ml維生素(Vit)A1維生素(Vit)D31維生素(Vit)B122胚狀體誘導培養基MT基本培養基+50g/L蔗糖+500mg/LME，補充蒸餾水至1L，調pH至5.8;胚狀體增殖培養基MT基本培養基+50g/L蔗糖+1500mg/LME'補充蒸餾水至1L,調pH至5.8;7生芽培養基MT基本培養基+0.5mg/LKT+0.5mg/LBA+0.1mg/LIM+30g/L蔗糖，補充蒸餾水至1L,調pH至5.8;生根培養基1/2MT基本培養基+0.5mg/LNM+0.1mg/LIBA+0.5g/L活性炭+20g/L蔗糖，補充蒸餾水至lL,調pH至5.8;更詳盡的技術方案參見《具體實施方式》所述。本發明的積極效果是本發明的效果是通過細胞融合技術和現代分子生物學檢測技術，人工創造了一批柑橘種間二倍體葉肉親本型胞質雜種植株，這些植株含有相應懸浮系親本的線粒體基因組，即含有胞質雄性不育基因。本發明對改良我國有籽柑橘品種具有積極的意義。與有性雜交轉移溫州蜜柑的胞質雄性不育性相比，本發明具有如下優點胞質雜種在l年內就可創造再生，效率大大提高。圖l:是本發明的技術流程和植株再生情況，圖中a.為愈傷原生質體b.為葉肉原生質體C.為電場誘導原生質體融合。d.為融合產物再生愈傷組織團；e.為再生的胞質雜種胚狀體；f.為胚狀體誘導再生芽；g.再生芽誘導生根h.完整再生苗移栽；Bars=1cm(1-4)圖2:采用流式細胞儀用于再生原生質體雜種進行倍性測定圖中A.為二倍體對照B.為再生產物圖3圖中a為溫州蜜柑(國慶l號)+沙田柚再生植株細胞核基因組的SSR分析；圖中b為溫州蜜柑(國慶l號)+冰糖橙再生植株細胞核基因組的SSR分析(a，b:引物為TAA15);圖中c為溫州蜜柑(國慶l號)+沙田柚再生植株的mtDNA來源分析；圖中d為溫州蜜柑(國慶l號)+冰糖橙國慶1號+沙田柚再生植株的mtDNA來源分析。具體實施例方式實施例l1、雙親材料的準備柑橘胚性懸浮系建立挑出保存于MT固體培養基(培養基成分參考《
發明內容》)上生長旺盛、顆粒細小、顏色淡黃及組織疏松的溫州蜜柑胚性愈傷組織于液體懸浮培養基上培養(MT基本培養基+500mg/LME(Maltextract)+1.5g谷氨酰胺+40g/L蔗糖，ph為5.8)中進行液體懸浮培養。繼代周期為12-14d，培養條件為暗培養，溫度控制在28'C左右，搖床轉速控制在115rpra左右。繼代3次后用于親本原生質體分離。葉肉親本制備取表1所述有核柑橘品種成熟種子，先用WNaOH浸泡5-10rain,中間用玻璃棒攪拌多次以除去果膠洗凈NaOH后，經l-3呢NaC10表面消毒10min，無菌蒸餾水清洗3-5次，去種皮，接種于MT基本培養基(含30g/L蔗糖和7.5克瓊脂，ph為5.8)，播種后25天左右取充分展開的葉片分離原生質體。每年的5-11月份均可采集溫室植株新鮮、完全展開及顏色濃綠的葉片用于葉肉原生質體分離。分離原生質體前，先將葉片在自來水下沖洗15-30min以除去表面污垢，然后用1%NaC10表面消毒15min,無菌蒸餾水洗凈后存放于4'C冰箱中備用。表l有核柑-瞎葉肉親本及其來源<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、柑橘原生質體的分離與純化柑橘親本原生質體分離參見郭文武等報道的方法(郭文武，鄧秀新，史永忠.柑橘細胞電融合參數選擇及種間體細胞雜種植株再生.植物學報，1998,40(4):417-424)。具體方法是(1)溫州蜜柑愈傷組織原生質體的酶解在溫州蜜柑愈傷懸浮系繼代的4-7天內，用長吸管吸取約lg愈傷組織于60mmX15mm小培養皿中，將此培養皿中的液體懸浮培養基吸干后，加入1.5mL左右的緩沖液A(MT基本培養基+0.7mol/L蔗糖+1500mg/L酵母提取物(ME),ph5.8)，再加入等體積的酶液(0.6%纖維素酶R-10+0.6%離析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011%NaH2P04+0.12%2,(N-嗎啡啉)-乙基磺酸(MES)+0.36%CaCl22H20，調pH為5.8，酶液通過0.22Mm醋酸纖維微孔濾膜過濾滅菌)，培養皿用Parifilm封口后在暗培養箱中靜置酶解16-20h.。葉肉原生質體的酶解取MT培養基上充分展開或采于溫室的滅過菌的有核柑橘品種葉片，用無菌手術刀片將葉片切成1-2mm的條狀，然后放入預先加入了1.5mL左右的緩沖液B(MT基本培養基+0.6mol/L蔗糖+1500mg/LME,ph5.8)培養基的60mmX15mm培養皿中，最后加入等體積的酶液(酶解試管苗和溫室葉片所用酶液分別包括0.75%纖維素酶R-10+0.75%離析酶R-10和1%纖維素酶R-10+1%離析酶R-IO，其它組分及濃度與酶解愈傷組織原生質體所用酶液相同)，最后操作同于酶解愈傷組織原生質體。酶解完成后的原生質體通過孔徑為45Wn的不銹鋼篩網過濾，以除去殘留材料和大細胞團，然后用CPW13(配方見表2)洗滌篩網以充分收集原生質體；將濾液倒入10mL的離心管中離心7-8min，棄上清液，將沉淀物與1.0mL的CPW13混勻，然后將此混合液用吸管輕輕地轉移到預先加入了3mLCPW26(配方見表2)的10mL離心管中，經CPW13/CPW26界面密度梯度離心純化2-3min后，用吸管將兩液面間的原生質體帶吸出，用電融合液離心洗滌1-2次，每次6-8min。純化后的原生質體懸浮于電融合液(0.7mol/L甘露醇+0.25mmol/LCaCl2)中，用血球計數板將愈傷組織原生質體密度調整為1X1()6個/niL左右，葉肉原生質體調整到2XK)6個AnL左右。表2CPW鹽配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>MgS042.5gKI0.002gCuS04_0.00003g_CPW13(100ml):CPffstockI1ml+CPWstockII1ml+13g甘露醇CPW26(100ml):CPWstockI1ml+CPWstockII1ml+26g蔗糖3、原生質體融合采用日本島津公司SSH-2型(ShimadzuSomaticHybridizer-2，Japan)融合儀，融合小池為FTC-04(1.6mL,4:腿)，融合室為FTC-04(容積為1.6mL，電極距離為0.4cm)。柑橘親本原生質體融合方法參見郭文武等報道的方法(郭文武，鄧秀新，史永忠.柑橘細胞電融合參數選擇及種間體細胞雜種植株再生.植物學報，1998,40(4):417-424)。具體方法是融合前先用無菌吸管吸取一定量的電融合液于融合小池環形槽中，洗錄1-2次，以防原生質體集聚于電極兩側的角落里。然后將調整了密度的雙親原生質體等體積混合，用長吸管吸取1.6mL原生質體混合液于環形槽中，輕輕晃動融合小池使混合液均勻分布于環形槽。槽中央加幾滴融合液用于保濕，用Parifilm封口后靜置5-10min。待大量原生質體處于同一平面后開始融合，融合參數為AC100V/cm,AC作用時間60s;DC1250V/cm，DC印加時間40-45Hs;脈沖間隔0.5s，脈沖5次。融合后靜置15-20min,以利于融合子的圓球化。最后輕輕吸出融合產物于10mL離心管，用HB3培養基離心洗滌1-2次，原生質體沉淀用朋3液體培養基(具體配方參見文獻GrosserJW,GmitterFGJr.Protoplastfusionandcitrusimprovement.PlantBreedingRev,1990,8:339-374)懸浮。4、融合產物培養本試驗采用在BH3培養基中進行液體淺層培養法。具體方法為輕輕吸出融合產物于10ml離心管中離心5-6鐘，原生質體培養采用液體淺層培養或固體包埋培養法。原生質體培養在暗培養箱中進行，3-10天后原生質體再生細胞壁，并開始第一次產分裂。等原生質體分裂形成多細胞團時(大約20-30天)，開始降低培養基的滲透壓，具體1)各加入5-10滴0.6MBH3和0.3MEME培養基，降壓至0.45M;2)7-15天后再各加入5-IO滴O.6M朋3和0.3MBH3培養基，降壓至O.3M;3)此后要及時稀釋，降低細胞團濃度，以利于胚狀體的發生，等細胞團長到一定大小時，轉入到胚狀體誘導培養基上誘導胚狀體的發生；4)細胞團長出球形胚、心形胚時，及時轉入到胚狀體增殖培養基培養基上以利于胚狀體的進一步發育和轉綠；5)將發育到子葉胚期的胚狀體轉入生芽培養基(MT基本培養基+0.5mg/L細胞分裂素(KT)+0.5mg/L硫酸腺嘌呤(BA)+0.1mg/L吲哚乙酸(IAA)+30g/L蔗糖，ph5.8)誘導生芽；6)將獲得的叢芽轉入生根培養基(1/2MT基本培養基+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+0.1rag/L吲哚丁酸(IBA)+0.5§幾活性炭+208幾蔗糖，ph5.8)誘導生根或進行試管嫁接，具體方法參見文獻(伊華林.試管嫁接提高柑桔三倍體組培苗成苗率試驗.中國果樹，2000(4):2829)將再生苗移植于溫室中。5、胞質雜種的鑒定l)倍性分析:倍性分析由德國Partec公司生產的流式細胞儀完成。操作程序參照Guo等(GuoWW,ChengYJ'ChenCL,DengXX(2006)Molecular腿lysisrevealedautotetr即loid，diploidandtetraploidcybridplantsregeneratedfromaninterspecificsomaticfusioninC/tr"s.ScientiaHorticulturae10108:162-166);2006)報道的方法，本發明略有修改，具體是將新鮮少量的原生質體雜種葉片或0.05g溫州蜜柑愈傷組織置于一個干凈的55mm塑料培養皿中，加入400HL細胞裂解液(購置PartecHR-A公司)，用刀片切碎后放置30s，接著通過含有30Wn微孔濾膜的過濾器(購自Partec公司，貨號:Celltrics)將樣品過濾到測試管，加入1.0mLDNA染色液Partec服-B(購自Partec公司)，染色30-60秒后，上樣于Partec倍性分析儀，測定樣品單個細胞核的DNA總量。DNA含量的分布曲線由倍性分析儀自動生成。2)原生質體胞質雜種分子標記鑒定具體方法參見文獻(CaiXD，FuJ，DengXX，Guo冊.ProductionandmolecularcharacterizationofpotentialseedlesscybridplantsbetweenpollensterileSatsu腿隱darinandtwoseedyCitruscultivars.PlantCellTissOrg,2007,90:275-283)。分另ij應用SSR、CAPS和cpSSR等分于標記對獲得的原生質體雜種核基因組、線粒體基因組進行分析。總DNA制備總DNA提取及檢測所有樣品均采用CTAB法微量提取DNA,具體方法參見《分子克隆試驗指南》(第三版)。CTAB提取緩沖液的組成為:0.1mol/LTris-HCl(pH8.0);1.5mol/LNaCl;0.05mol/LEDTA(pH8.0);1%PVP;2.0%CTAB;1.O呢的巰基乙醇。(1)取O.15g左右幼嫩葉片、愈傷組織或胚狀體，置于1.5mL離心管底；(2)用鑷子夾住離心管置于液氮中15s后，用事先滅過菌的尖頭玻璃棒將材料戳到管底，先壓后碾磨；(3)碾碎后加入600uL預熱到65"C的CTAB提取液，再繼續碾磨片刻使其懸浮均勻；(4)在65'C水浴鍋中溫浴60-90min，每隔30min取出上下輕輕顛倒幾次；(5)水浴之后，加入700uL氯仿異戊醇(體積比為24:1)，上下顛倒晃動10min以上，臺式離心機10000-12000rpm離心8min;(6)將上清液轉至另一1.5mL離心管，重復步驟5)—次；(7)吸取上層液至另一1.5mL離心管，加入60"L5mol/LNaCl和1inL預冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒15次，混合均勻后置于-2(TC冰凍30min或過夜沆淀DNA;(8)在8000-10000rpm離心5min，使DNA緊貼在管底上；(9)棄酒精后加入lmL70%酒精，浸泡2h后換一次酒精，然后浸泡過夜；(10)棄去酒精，在超凈工作臺上風干后加50uL1XTE充分溶解，然后每管加5uL5mg/mLRnase，37'C水浴6h或過夜。DNA檢測采用UV-1601型紫外分光光度計測定DNA原液濃度及樣品DNA質量，取DNA原液5uL，用超純水稀釋到3.0ml，測定280nm、260nra及230nm的吸光值，按公式DNA濃度(ng/u1)=30000X0D260計算DNA原液濃度，此外OD260/0D280的比值在1.7-2.0的范圍認為DNA樣品純度較高，而0D260/0D230大于2.0則認為樣品DNA含鹽類少；用1XTAE作為緩沖液，將3-5uLDNA樣品在0.8%瓊脂糖凝膠上穩壓2V/cm電泳30min進行質量檢測，如果有明顯的主帶，沒有拖尾現象，則DNA可用于以后的實驗。將DNA樣品稀釋至25ng/uL，貯存于-2(TC冰箱中備用。原生質體雜種核基因組分析原生質體雜種核基因組的SSR分析按照Cheng等(2003)的方法進行(ChengYJ,GuoWW,DengXX.MolecularcharacterizationofcytoplasmicandnucleargenomesinphenotypicallyabnormalValenciaorange(Citrussinensis)+Meiwakumquat(Fortunellacrassifolia)irvterge匿icsomatic,hybrids.PlantCellR印，2003,21:445-451),并做適當修改。本實施例中所用的SSR引物參見表5，該引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR擴增采用20uL反應體系，包括100ng總DNA，1.5咖ol/LMgC12，0.2mmol/LdNTP，1.0UTaqDNA聚合酶(試劑盒由Promega公司生產)，0.1nmol/L正向引物，0.1umol/L反向引物，1Xbuffer及滅菌超純水(表5)，擴增前每小管中加一滴礦物油。PCR擴增程序如下94。C變性5iiiin;接著是32個循環94'C，1min，55'C，30s，72°C,1miri;最后72'C延伸4min，4'C保存。擴增反應結束后，取4uLPCR擴增產物在O.8%瓊脂糖膠上檢測擴增效果，如果產物為一條橫跨溴酚蘭的Smear，則可以進行下一步實驗。1)擴增產物92-95'C變性3-5min后，在6%(W/V)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE膠)上電泳1.5-2h，變性膠顯色參照Promega公司的產品說明書進行銀染；2)或者在1XTAE緩沖液中，擴增產物在3%MetaPhore瓊脂糖膠上穩壓2V/cm電泳l.5-2h，隨后在UV下觀察并拍照。具體操作方法參照MetaPhore瓊脂糖膠參照說明書。_表31XTAE緩沖液的配制(1L):_Tris-HCl4.084gEDTA-Na2.H200.744g冰醋酸1.142ml加水定容到1L，調ph為8.5表4本發明應用的柑橘原生質體核基因組SSK引物的序列引物代號引物序列參考文獻LocuscodePri鵬rsequenceReferenceTAA15,GACAACATCMCAACAGCMGAGC3'Kijas等，19975'MGMGMGAGCCCCCATTAGC3'TM155'G嵐GGGTTACTTGACCAGGC3，Kijas等，19975'CTTCCCAGCTGCCACMGC3'TM275'GGATGAMMTGCTCAAAATG3，Kijas等，19975'TAGTACCCACAGGGMGAGAGC3'TM335'GGTACTGATAGTACTGCGGCG3，Kijas等，19975'GCTAATCGCTACGTCTTGGC3'TM415'AGGTCTACATTGGCATTGTC3'Kijas等，19975'ACATGCAGTGCTATMTGMTG3'TM455'GCACCTTTTATACCTGACTCGG3'Kijas等，19975'TTCAGCATTTGAGTTGGTTACG3'具體文獻為(KijasJMH，ThomasMR,FowlerJCS,RooseML.Integrationoftrinucleotidemicrosatellitesintoalinkagemapofcitrus.7ear粉/fe威，1997'94:701-706)表5SSR反應體系成分Gomponent工作液濃度Workconcentration體積/管(Hi)Volume/tube模板DNA20ngM4Buffer10X2.0藩P2咖ol/L2.0MgCl225mmol/L1.2Taq酶5,0.2正向引物10Wnol/L0.2反向引物10(%ol/L0.2ddH2010.2總體積20胞質基因組分析胞質基因組分析采用CAPS標記分析雜種線粒體DNA的遺傳方式，操作程序參照Cheng等(2003)的方法(ChengY丄GuoWW,DengXX.MolecularcharacterizationofcytoplasmicandnucleargenomesinphenotypicallyabnormalValenciaorange(Citrussinensis)+Meiwakumquat(Fortimellacrassifolia)intergenericsomatichybrids.PlantCellR印，2003，21:445-451),并適當修改釆用3個線粒體基因組通用引物對(表6)對總DNA進行PCR擴增，PCR反應在PTC-200Thermocycler(USA)中進行。反應體系為25uL:模板DNA100ng,0.2mmol/LdNTP,2鵬ol/LMgC12'1Xbuffer，1.0UTaqDNA聚合酶(Promega),正反向引物各O.2Umol/L以滅菌的超純水(表7)。擴增程序為94'C變性3min;接著94。C變性1min,55。C退火40s，72'C延伸2min，32個循環；最后72。C延伸10min，4'C保存。取4nL擴增產物在O.8%的瓊脂糖凝膠上檢測后，將擴增產物進行酶切，20uL酶切體系為擴增產物8uL，10U/uL內切酶0.5uL，buffer2uL，滅菌雙蒸水9.5uL。37。C水浴3-4h后，在2.0%瓊脂糖膠(含0.5ug/mLEB)中2.5V/cm電泳l-1.5h，在紫外燈下觀察并拍照。表6線粒體基因組通用引物的序列和來源引物l引物2參考文獻Primer1Primer2Referencenad1exonB(mt)nad1exonC(mt)D柳ssurs等，5'-GCATTACGATCTGCAGCTCA-3'5'-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3'199518Sr腿(mt)5SrRNA(mt)Al-Janabi等，5,-GTGTTGCTGAGACATGCGCC-3'5'-ATATGGCGCAAGACGATTCC-3'簡nad4exonl'(mt)nad4exon2(mt)D6I116SUr6等，5'-CAGTGGGTTGGTCTGGTATG-3'5'-TCATATGGGCTACTGAGGAG-3'簡具體文獻為(A1-JanabiSM，McclellandM，PetersenC，SobralBWS.PhylogeneticanalysisoforganellarDNAsequences'intheAndropogoneae:Saccharinea.TheoApplGenet，1994，88:933-944;DemesureB，SodizN，PetitRJ".AsetofuniversalprimersforamplificationofpolymorphicnoncodingregionsofmitochondrialandcpDMinplants.MolecEcol，1995,4:129-131)表7CAPS反應體系成分Component工作液濃度Workconcentration體積/管(W)Volume/tube模板DNA25ngM4Buffer10X2.5d鮮2mmol/L2.5MgCl225mmol/L1.5Taq酶5,0.2正向引物10Wnol/L0.2反向引物10Wnol/L0.2ddH2013.9總體積25表8本發明獲得的無核柑橘二倍體葉肉親本型胞質雜種融合組合(學名)育成年份溫州蜜柑(國慶l號)+雜種柚(Satsumamandarin+Hybridpummelo)2004溫州蜜柑(國慶1號)+日輝橘(Satsumamandarin+Sunbursttangerine)2004溫州蜜柑(國慶l號)+李橘(Satsumamandarin+Leetangerine)2004溫州蜜柑(國慶l號)+沙田柚(Satsumamandarin+Shatianpummelo)2007溫州蜜柑(國慶1號)+冰糖橙(Satsumamandarin+Bingtangorange)2007溫州蜜柑(國慶1號)+佩奇橘柚(Satsumamandarin+Pagetangelo)2008溫州蜜柑(國慶1號)+紅暗柳橙(Satsumamandarin+redAnliuorange)2008與已有技術相比，本發明優點如下1)與非對稱方法相比，方法簡單、易再生；2)與有性雜交相比，胞質雜種在1年內可創造再生，效率大大提高。1權利要求1、一種轉移柑橘胞質雄性不育性狀的方法，包括原生質體融合，胞質雜種培養，再生和倍性鑒定，其特征在于，將雄性不育型的柑橘品種愈傷組織懸浮系原生質體與有核型柑橘品種的葉肉原生質體融合，通過再生，將雄性不育型懸浮系親本的線粒體基因組轉移到有核柑橘品種上，得到雄性不育二倍體葉肉品系。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于如下步驟-1)雙親材料的選擇以雄性不育溫州蜜柑愈傷組織為親本，取保存于MT固體基本培養基上的雄性不育的柑橘品種溫州蜜柑胚性愈傷組織于液體懸浮培養基進行懸浮培養，以12-14天為l個繼代培養周期，暗培養，溫度為28i:左右，搖床轉速控制在115rpm左右；繼代培養3個周期后進行原生質體分離，以有核柑橘為葉肉親本，將所述的溫州蜜柑愈傷組織或有核柑橘葉肉分別用添加有緩沖液A或緩沖液B的酶液進行原生質體分離和純化，得到原生質體；2)將步驟l)的原生質體用電融合法融合，得到融合產物；3)將步驟2)的融合產物離心，去掉上清，將沉淀轉入BH3培養基，培養大約20-30天，當原生質體分裂形成多細胞團時及時降低培養基的滲透壓至0.45M并擴大培養面，待細胞團長到直徑為0.5-1.0cm時，轉入胚狀體誘導培養基上誘導培養，使其分化出球形胚或心形胚，及時將所述的球形胚或心形胚轉移到胚狀體增殖培養基上使其轉綠和進一步發育成子葉形胚狀體；選取子葉形胚狀體轉入生芽培養基誘導生芽，將獲得的叢芽轉入生根培養基誘導生根；將生根的雜種植株移栽入溫室，得到胞質雜種材料；4)對步驟3)的胞質雜種材料，采用流式細胞儀進行倍性鑒定；以SSR和CAPS分子標記方法進行細胞核基因組和線粒體基因組分析；其中緩沖液A:MT基本培養基+0.711101^蔗糖+1500mg/LME，滲透調節劑0.7mol/LEME，調pH至5.8;緩沖液B:MT基本培養基+0.611101/1>蔗糖+1500mg/LME,滲透調節劑0.6mol/LEME，調pH至5.8;酶液0.6%纖維素酶R-10+0.6%離析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011%NaH2P04+0.12%MES+0.36%CaC12.2H20，調pH至5.6，酶液通過0.22ym醋酸纖維微孔濾膜過濾滅菌；MT固體培養基MT基本培養基+40g/L蔗糖，調pH至5.8;液體懸浮培養基MT基本培養基+500mg/LME+1.5g谷氨酰胺+40g/L蔗糖，補充蒸餾水至1L，調pH至5.8;胚狀體誘導培養基MT基本培養基+50§化蔗糖+500mg/LME，補充蒸餾水至1L，調pH至5.8;胚狀體增殖培養基MT基本培養基+50§1蔗糖+1500mg/LME，補充蒸餾水至1L，調pH至5.8;生芽培養基MT基本培養基+0.5mg/LKT+0.5mg/LBA+0.1mg/LIAA十30g/L蔗糖，補充蒸餾水至1L，調pH至5.8;生根培養基1/2MT基本培養基+0.5mg/LNAA+0.1mg/LIBA+0.5g/L活性炭+20g/L蔗糖，補充蒸餾水至1L，調pH至5.8;3、根據權利要求1所述的方法，其中步驟(1)所述的葉肉親本選自沙田柚、冰糖橙，暗柳橙，紅暗柳橙，雜種柚或日輝橘。全文摘要本發明屬于植物新品種選育
技術領域：
，具體涉及一種轉移柑橘胞質雄性不育性狀的方法。其特征在于，根據柑橘細胞對稱融合可以再生二倍體葉肉親本型胞質雜種的現象及其分子水平上的組成特征，提出了通過融合組合選配、經培養獲得胞質雜種、轉移由線粒體基因組控制的胞質雄性不育性狀、從而改良二倍體有核或多核柑橘品種。發明了胞質雄性不育溫州蜜柑與中國特色有核或多核柑橘類型之間的對稱融合，成功地創造了一批二倍體胞質雜種，實現了溫州蜜柑線粒體基因組的有效轉移，為二倍體無核柑橘選育提供了新方法及新種質材料。文檔編號C12N15/05GK101475933SQ20081023743公開日2009年7月8日申請日期2008年12月26日優先權日2008年12月26日發明者婧付,程運江,蔡小東,鄧秀新,郭文武申請人:華中農業大學