人椎間盤組織的制作方法

專利名稱：人椎間盤組織的制作方法
技術領域：
本發明提供了髓核干細胞以及獲得且使其生長的方法。
背景技術：
由于退行性椎間盤病癥(degenerative disc disease)導致的背痛是發病 (morbidity)、失能(disability)以及喪失生產力的主要原因。背痛是45歲以下人群活 動受限的最常見因素，是醫生出診的第二位常見因素，是住院治療的第五位因素，以及是實 施手術的第三位最常見原因。因此，有15-45%的人每年發生一般性和虛弱型慢性背痛， 70-85 %的人在其一生中的一些時候發生慢性背痛。僅在美國，有關保健成本和社會工作小 時數損失方面的財政影響每年就在200億到500億美元之間。盡管對于繼發于退行性椎間盤病癥的下背痛患者在非手術和手術治療方法中 有持續改進，但是還沒有作為“魔術彈”的治療模式以消除或持續改善這種病癥。然而， 目前由于生物醫學工程學和分子科學的融合獲得了一些新的且令人興奮的機會改進治 療模式。目前我們比以往任何時候都更接近于產生新的治療模式和裝置，用以治療退 行性椎間盤病癥。近來生物科學中的進展及對臨床脊柱疾病的作用的實例包括開發 融合蛋白、全部椎間盤成形術(total disc arthroplasty)，以及更近期的髓核成形術 (nucleusarthroplasty)。融合蛋白，如重組人骨形態發生蛋白-2 (rhBMP-2)，是遺傳產生的 蛋白質，其具有刺激新骨生長的能力，使得在手術重建的情況中脊椎更可靠及迅速地融合。第一例全部椎間盤成形術由Fernstorm在二十世紀五十年代后期進行。盡管 最初有短期癥狀緩解，但是由于繼發植入體在脊椎內下沉而最終失敗。盡管在歐洲自從 二十世紀八十年代已經進行腰椎的全部椎間盤成形術，但是在美國直至2000年3月才 開始使用 SB Charite III (DePuy Spine，Raynham，MA). 10，11 導入。一些其他腰椎假 體(prostheses)己經導人體內，包括 Maverick (Medtronic Sofamor Danek, Memphis, TN)、ProDisc-L(SpineSolutions/Synthes，Paoli，PA)禾口 FlexiCore(Stryker Spine, Allendale, NJ)。這些修補物在支撐面、與骨的固定、關節數目、材料、約束(constraint) 以及旋轉中心的活動性等方面的設計均有所不同。除了腰椎椎間盤成形術之外，近年 來在美國已經開始頸椎椎間盤成形術實驗。頸椎成形術的模型包括BryanCervical Disk (Medtronic Sofamor Danek)、Prestige ST(Medtronic SofamorDanek)、 Porous Coated Motion artificial cervical disk(Cervitech, Rockaway, NJ)以 及 ProDisc-C(Spine Solutions/Synthes)。針對椎骨退行性疾病的髓核成形術(Nucleus arthroplasty)或者髓核置換裝置 如PDN Prosthetic Disc Nucleus與TDA相似，已經獲得成功結果。PDN 裝置由包在 聚乙烯套中的水凝膠核心組成，其在正常負荷及無負荷期間縮短和膨脹，允許椎間盤間隙 高度恢復，因此模擬健康人椎間盤。盡管全部椎間盤成形術和椎間盤等離子射頻消融髓核成形術(nucleoplasty)可 以替代體內椎體間脊柱融合術，但是這種方法也具有并發癥。主要的并發癥包括相鄰椎骨 疾病、下沉以及facet joint arthrosis。此外，近來的臨床實驗研究證實感染、椎體破裂、植入體位置不正、下沉、機械故障以及椎旁異位骨化等跡象。已經報道了更嚴重的并發癥，包 括植入體前脫位。此外，全部椎間盤成形術(TDA)的磨損顆粒問題及對于脊髓的潛在作用 仍未知。因此，盡管全椎間盤成形術是椎間盤退行性疾病的治療進展，但是最后的目標應是 用新的生物椎間盤置換退行性椎間盤，其不具有與機械部件相關的并發癥。在美國每年進行一百萬例以上的脊柱手術。此外，估計脊柱手術市場的腰椎融合 節段每年收益超過十億美元。發明概述在一個實施方案中，本發明提供了分離的椎間盤干細胞群。在另一個實施方案中，本發明提供了分離椎間盤干細胞的方法，包括將椎間盤干 細胞鋪板于無血清培養基中，產生包含髓核細胞的discosphere，從而分離椎間盤干細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了包含椎間盤干細胞的組合物。在另一個實施方案中，本發明提供了分離的discosphere。在另一個實施方案中，本發明提供了包含discosphere的組合物。在另一個實施方案中，本發明提供了包含髓核細胞的人工椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了產生人工椎間盤的方法，包括使discosphere 在椎間盤支架中生長，從而產生脊柱椎間盤置換裝置。在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有椎間盤脫出癥的對象的方法，包括 給予所述對象包含髓核細胞的人工椎間盤，從而治療患有椎間盤脫出癥的對象。附圖簡述說明書在權利要求書部分具體指出了要求保護的本發明的主題。但就結構和操作 方法及其目的、特征和優勢而言，參照說明書的詳細介紹以及附圖可獲得對本發明的最佳理解。

圖1示出在體外將人椎間盤干細胞移植進具有骨終板(bony end plate)的抽空 的兔髓核中之后，對于3個月椎間盤培養物的各個組織染色的顯微鏡下組織形態學評估。1 組示出顯微照片A、C和E (對照組)中兔椎間盤組織以及顯微照片B、D和F中培養的椎間 盤的蘇木精-伊紅染色的顯微照片。放大率1.25 X (A和B)、10X (C和D)以及20 X (E和 F)。顯微照片C和D示出髓核內與髓核外的過渡帶。顯微照片E和F示出髓核的內部區域 與各個髓核細胞。2組示出顯微照片G、I和K(對照組)中兔椎間盤組織以及顯微照片H、J 和L中培養的椎間盤的safranin染色的顯微照片。放大率1. 25X (G和H)、10X (I和J) 以及20X(K和L)。顯微照片I和J證實髓核內與髓核外的過渡帶。顯微照片K和L示出 髓核的內部區域與各個髓核細胞。3組示出顯微照片Μ、0和Q(對照組)中兔椎間盤組織 以及顯微照片H、J和L中培養的椎間盤的Von Kossa染色的顯微照片。放大率1.25 X (Μ 和Ν)、10Χ(0和P)以及20X(Q和R)。顯微照片0和P示出髓核內與髓核外的過渡帶。顯 微照片Q和R示出髓核的內部區域與各個髓核細胞。圖2示出在體外將人椎間盤干細胞移植進具有骨終板的抽空的兔髓核中之后，對 于3個月椎間盤培養物中II型膠原表達的顯微鏡下組織形態學評估。對照組(兔椎間盤 組織)(A、C、E)和培養的椎間盤(制備的纖維環基質，其中已經通過化學方法除去髓核，且 導入了人椎間盤干細胞制備物)(B、D、F)的II型膠原免疫染色顯微照片。放大率1. 25倍 (A和B)，10倍(C和D)以及20倍(E和F)。顯微照片C和D證實髓核內與髓核外之間的過渡區。顯微照片E和F證實髓核的內部區域和各個髓核細胞。圖3示出在體外將人椎間盤干細胞移植進具有骨終板的抽空的兔髓核中之后，對 于3個月椎間盤培養物中I型膠原表達的顯微鏡下組織形態學評估。對照組(兔椎間盤組 織)(A、C、E)和培養的椎間盤(制備的纖維環基質，其中已經通過化學方法除去髓核，且導 入了人椎間盤干細胞制備物)(B、D、F)的I型膠原免疫染色顯微照片。放大率1. 25倍(A 和B)，10倍(C和D)以及20倍(E和F)。顯微照片C和D證實髓核內與髓核外之間的過渡 區。顯微照片E和F證實髓核的內部區域和各個髓核細胞。圖4示出了在體外將人椎間盤干細胞植入具有骨終板的抽空的兔髓核中之后，在 3個月的椎間盤培養物中Ki-67表達的顯微鏡下組織形態學評價。對照組(兔椎間盤組織) (A、C、E)和培養的椎間盤(制備的纖維環基質，其中已經通過化學方法除去髓核，且導入了 人椎間盤干細胞制備物)(B、D、F)的Ki-67免疫染色顯微照片。放大率1. 25倍(A和B)， 10倍(C和D)以及20倍(E和F)。顯微照片C和D證實髓核內與髓核外之間的過渡區。顯 微照片E和F證實髓核的內部區域和各個髓核細胞。圖5示出了具有骨終板的椎間盤培養系統的示意圖。A 單細胞培養物在促進 discosphere (椎間盤干細胞群)生長的培養基和條件下制備。然后制備discosphere并注 射進從其椎間盤中除去所有細胞和髓核組織的健康兔的纖維環中。B:將具有骨終板的椎間 盤纖維環置于具有培養基和生長因子的培養容器中。在3個月結束時，椎間盤干細胞用椎 間盤樣結構填充先前空的纖維環。發明詳述在一個實施方案中，本發明提供了分離的椎間盤干細胞群。在另一個實施方案中， 本發明提供了可以形成discosphere的椎間盤干細胞富集的細胞群。在另一個實施方案 中，本發明提供了可以產生椎間盤祖細胞的椎間盤干細胞富集的細胞群。在另一個實施方 案中，本發明的分離的椎間盤干細胞群包含人椎間盤干細胞群。在另一個實施方案中，本發 明的分離的椎間盤干細胞群包含非人椎間盤干細胞群。在另一個實施方案中，本發明的分 離的椎間盤干細胞群包含哺乳動物椎間盤干細胞群。在另一個實施方案中，本發明的分離 的椎間盤干細胞得自對象的髓核。在另一個實施方案中，髓核細胞包含椎間盤干細胞。在另一個實施方案中，本發明的干細胞富集的細胞群包含人椎間盤干細胞群。在 另一個實施方案中，本發明的干細胞富集的細胞群包含非人椎間盤干細胞群。在另一個實 施方案中，本發明的干細胞富集的細胞群包含哺乳動物椎間盤干細胞群。在另一個實施方 案中，本發明的干細胞富集的細胞群得自對象的髓核。在另一個實施方案中，髓核細胞包含 椎間盤干細胞。在另一個實施方案中，髓核是在椎間盤中心的膠狀物。在另一個實施方案中，髓核 包含軟骨細胞、膠原纖維和蛋白聚糖aggrecan，其具有吸水的透明質酸長鏈。在另一個實施方案中，本發明的髓核細胞包含自體移植的髓核細胞。在另一個實 施方案中，本發明的髓核細胞包含同種異體移植的髓核細胞。在另一個實施方案中，本發明 的髓核細胞包含異種移植的髓核細胞。在另一個實施方案中，本發明的髓核細胞包含椎間盤干細胞。在另一個實施方案 中，本發明的髓核細胞包含椎間盤祖細胞。在另一個實施方案中，本發明的髓核細胞包含成 熟的椎間盤細胞。在另一個實施方案中，本發明的髓核細胞包含終末分化的椎間盤細胞。
在另一個實施方案中，本發明提供了分離椎間盤干細胞的方法，包括產生 discosphere培養物的步驟。在另一個實施方案中，本發明提供了分離椎間盤干細胞的方 法，包括將髓核細胞鋪板于無血清培養基中的步驟。在另一個實施方案中，本發明提供了產 生包含髓核細胞的球體的方法，包括使髓核細胞在無血清培養基中的培養物生長的步驟， 從而產生discosphere。在另一個實施方案中，本發明提供了包含髓核細胞的discosphere 是通過髓核干細胞在體外產生的自由浮動(free-floating)結構。在另一個實施方案中， 本發明提供了 discosphere是由髓核祖細胞在體外產生的自由浮動結構。在另一個實施方 案中，本發明提供了 discosphere是由髓核干細胞和祖細胞在體外產生的自由浮動結構。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤干細胞由其discosphere形成的能力 (ability或capacity)而定義。在另一個實施方案中，貼壁培養生長的這些椎間盤干細胞 在合適的分化條件下具有分化為成熟或者完全分化的能力。在另一個實施方案中，完全分 化的髓核細胞分泌額外的細胞基質成分。在另一個實施方案中，術語“分化”是指細胞從非 特化或低特化的前體細胞發育為具有特定結構和功能的細胞，包括細胞從前體細胞發育為 具有髓核細胞的結構和功能的細胞。在另一個實施方案中，術語“分化”是指細胞從椎間盤 干細胞發育為具有特定結構和功能的細胞。在另一個實施方案中，術語“分化”是指細胞從 椎間盤祖細胞發育為具有特定結構和功能的細胞。在另一個實施方案中，合適的分化條件 包括包含血清的培養基。
在另一個實施方案中，本發明的方法提供了得自對象髓核的椎間盤材料。在另一 個實施方案中，本發明的方法提供了椎間盤材料，其通過手術獲得且在實驗室中處理產生 髓核細胞的單細胞懸浮液(實施例1)。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了人椎間 盤材料，其通過手術獲得且在實驗室中處理產生髓核細胞的單一懸浮液。在另一個實施方 案中，本發明的方法提供了人髓核，其通過手術獲得且在實驗室中處理產生髓核細胞的單 細胞懸浮液。在另一個實施方案中，異種(heterogeneous)髓核細胞群是通過刮取對象的髓核 而獲得。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞以及分化 的髓核細胞。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群是通過刮取人對象的髓核而獲得。在 另一個實施方案中，本發明提供了將異種髓核細胞群以較低細胞密度鋪板于無血清培養基 中，使得髓核干細胞存活。在另一個實施方案中，術語“髓核干細胞存活”是指在包括無血 清細胞培養基的條件下髓核干細胞保持生存力的能力。在另一實施方案中，本發明提供了 髓核細胞(組織中的大多數細胞)由于不能耐受無血清條件而逐漸消逝，但是椎間盤干細 胞(或者髓核干細胞，組織中少數細胞)在這些條件下生長為discosphere。在另一個實施方案中，本發明提供了將異種髓核細胞群以較低細胞密度鋪板于無 血清培養基中，得以分離髓核干細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了將異種髓核細胞 群以較低密度鋪板于無血清培養基中，得以針對椎間盤干細胞富集髓核細胞群。在另一個 實施方案中，本發明提供了將異種髓核細胞群以較低細胞密度鋪板于包含干擾細胞附著的 物質的無血清培養基中，使得髓核干細胞存活。在另一個實施方案中，本發明提供了將異種 髓核細胞群以較低細胞密度鋪板于包含干擾細胞附著的甲基纖維素的無血清培養基中，使 得髓核干細胞存活。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群得自切成片狀的髓核活檢組織樣品。在另一個實施方案中，所述切片大小為0.5-10mm。在另一個實施方案中，所述切片大小為 0.5-20mm。在另一個實施方案中，所述切片大小為0. 5_3mm。在另一個實施方案中，所述切 片大小為3-6mm。在另一個實施方案中，所述切片大小為6_12mm。在另一個實施方案中，所 述切片大小為12-20mm。在另一個實施方案中，所述切片大小為l_6mm。在另一個實施方案 中，所述切片大小為3-5mm。在另一個實施方案中，所述切片大小為3_4mm(實施例1)。 在另一個實施方案中，異種髓核細胞群得自用膠原酶II溶液處理的髓核活檢組 織樣品(實施例1)。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群得自用0. 1% -1%梭菌膠原酶 (fforthington CLS II，140u/mg)處理的髓核活檢組織樣品。在另一個實施方案中，異種髓 核細胞群得自髓核活檢組織樣品，用膠原酶II溶液處理及隨后將該樣品置于搖瓶中，由此 獲得異種髓核細胞群。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群得自從患者椎間盤抽出的髓核活檢組織樣 品。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群得自從供體動物椎間盤抽出的髓核活檢組織樣 品。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群得自從供體哺乳動物椎間盤抽出的髓核活檢組 織樣品。在另一個實施方案中，異種髓核細胞群得自從患者的正常椎間盤抽出的髓核活檢 組織樣品。在另一個實施方案中，本發明提供了產生discosphere的方法，包括使髓核細胞 培養物在無血清培養基中生長，從而產生discosphere。在另一個實施方案中，本發明提供 了使髓核細胞的原代培養物在無血清培養基中生長，從而選擇髓核干細胞。在另一個實施 方案中，存活的分離的髓核干細胞培養物產生本發明的discosphere。在另一個實施方案 中，存活的椎間盤干細胞富集的髓核干細胞培養物產生本發明的discosphere。在另一個實施方案中，本發明的補加的無血清培養基僅使得髓核干細胞生長。在 另一個實施方案中，本發明的方法提供了富集的髓核干細胞群是當在補加生長因子的本發 明的無血清培養基中生長而產生的。在另一個實施方案中，本發明的方法提供的富集的髓 核干細胞群包含至少60%的髓核干細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法提供的富集 的髓核干細胞群包含至少70%的髓核干細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法提供的 富集的髓核干細胞群包含至少80%的髓核干細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法提 供的富集的髓核干細胞群包含至少85%的髓核干細胞。在另一個實施方案中，本發明的方 法提供的富集的髓核干細胞群包含至少90%的髓核干細胞。在另一個實施方案中，本發明 的方法提供的富集的髓核干細胞群包含至少95%的髓核干細胞。在另一個實施方案中，discosphere得自單一髓核干細胞。在另一個實施方案中， 當將髓核細胞鋪板于無血清培養基中時，僅椎間盤干細胞生長。在另一個實施方案中，當將 髓核細胞以低細胞密度鋪板時，僅椎間盤干細胞生長。在另一個實施方案中，當將髓核細胞 以低細胞密度鋪板于無血清培養基中時，僅椎間盤干細胞生長。在另一個實施方案中，僅髓 核干細胞作為自由浮動的孤立細胞可以生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含抑制細胞成熟的 化合物的無血清培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞 在包含抑制細胞成熟的FGF的無血清培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步 提供了椎間盤干細胞在包含維持細胞不成熟狀態的化合物的無血清培養基中生長。 在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含TGF-β超家族成員的培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含BMP 的培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明提供了 BMP抑制分化(Id)基因。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含IL6細胞因子家 族成員的培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明提供了椎間盤干細胞在包含白血病 抑制因子(LIF)的培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含促進細胞增殖的 化合物的無血清培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞 在包含促進細胞增殖的EGF的無血清培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步 提供了椎間盤干細胞在包含白細胞介素-2 (IL-2)的無血清培養基中生長。在另一個實施 方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含白細胞介素-6(IL-6)的無血清培養基 中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含干細胞因子(SCF) 的無血清培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含 白血病抑制因子(LIF)的無血清培養基中生長。在另一個實施方案中，本發明進一步提供 了椎間盤干細胞在包含轉化生長因子-β (TGF-β)的無血清培養基中生長。在另一個實施 方案中，本發明進一步提供了椎間盤干細胞在包含抑制細胞分化的化合物的無血清培養基 中生長(實施例1及材料與方法章節)。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤干細胞增殖并產生另外的干細胞。在另 一個實施方案中，本發明的椎間盤干細胞增殖并產生椎間盤祖細胞。在另一個實施方案 中，本發明的椎間盤干細胞增殖，因此形成discosphere。在另一個實施方案中，本發明的 discosphere包含排列成圓球形結構的髓核干細胞和髓核祖細胞。在另一個實施方案中， discosphere是個球體，其中單一的椎間盤細胞產生其自身克隆(對稱分裂)及祖細胞。在 另一個實施方案中，本發明的discosphere包含自由浮動的排列成圓球形的髓核干細胞和 髓核祖細胞。在另一個實施方案中，包含discosphere的髓核細胞彼此附著在一起。在另一個實施方案中，術語“髓核干細胞”和“椎間盤干細胞”可互換使用。在另 一個實施方案中，術語“髓核祖細胞”和“椎間盤祖細胞”可互換使用。在另一個實施方案中，術語“discosphere”包含這樣的細胞球體，其中單個的椎間 盤干細胞產生自身克隆(對稱分裂)和祖細胞。在另一個實施方案中，術語“祖細胞”是指 未成熟的具有可塑潛力和高增殖速度的干細胞樣細胞，其可以產生大多數終末分化的組織 細胞，但是不被定義為椎間盤干細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了制備單細胞懸浮液以通過產生一定的 環境條件而分離椎間盤干細胞。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了制備單細胞懸 浮液以通過產生一定的環境條件而產生discosphere。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在 37°C保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在 35°C保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在 36°C保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在 38°C保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在 39°C保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在 40°C保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在41°C保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在濕化培養箱中在 42°C保溫。
在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在進一步保持3-8% CO2條件的培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在進 一步保持4% CO2條件的培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細 胞懸浮液在進一步保持5% CO2條件的培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法 提供了將單細胞懸浮液在進一步保持6% CO2條件的培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在進一步保持 60-100%濕度條件的培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞 懸浮液在進一步保持70-100%濕度條件的培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明 的方法提供了將單細胞懸浮液在進一步保持80-100%濕度條件的培養箱中保溫。在另一 個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在進一步保持90-100%濕度條件的 培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液在進一步保持 95-100%濕度條件的培養箱中保溫。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液以低于IXlO6個細 胞/ml的終密度鋪板。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸浮液以低于 5X105個細胞/ml的終密度鋪板。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了將單細胞懸 浮液以低于IX IO5個細胞/ml的終密度鋪板。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了 將單細胞懸浮液以低于8X IO4個細胞/ml的終密度鋪板。在另一個實施方案中，本發明的 方法提供了將單細胞懸浮液以低于6X IO4個細胞/ml的終密度鋪板(實施例1)。在另一個實施方案中，本發明提供了包含椎間盤干細胞的組合物。在另一個實施 方案中，本發明包含具有富集的髓核干細胞的髓核細胞群的組合物。在另一個實施方案 中，所述組合物進一步包含合適環境，如本文所述那些環境，其中椎間盤干細胞可以被誘導 增殖并產生椎間盤干細胞后代。在另一個實施方案中，術語其中放置椎間盤干細胞后代的 環境是指外部或外在物理和/或化學條件的組合，其影響和改變椎間盤干細胞的生長和發 育。在另一個實施方案中，所述環境可以是離體或體內環境。在另一個實施方案中，椎間盤 支架可以作為體內環境，誘導椎間盤干細胞產生后代。在另一個實施方案中，所述環境是離 體環境，包括椎間盤干細胞置于培養箱中的細胞培養基中(實施例1)。在另一個實施方案中，本發明提供了包含椎間盤干細胞和培養基的組合物。在另 一個實施方案中，所述培養基是無血清培養基。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的 組合物進一步包含補加到培養基中的表皮生長因子(EGF)。在另一個實施方案中，包含椎間 盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的1-lOng/ml EGF。在另一個實施方案中， 包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的1-lOOng/ml EGF。在另一個實 施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的20-50ng/ml EGF。在 另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的50-100ng/ ml EGF。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 5-15ng/ml EGF。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養 基中的 8-12ng/ml EGF。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的FGF。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的成纖 維細胞生長因子2 (FGF2)。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補 加到培養基中的l-100ng/mlFGF2。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一 步包含補加到培養基中的20-50ng/ml FGF2。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組 合物進一步包含補加到培養基中的50-100ng/ml FGF2。在另一個實施方案中，包含椎間盤 干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的5-15ng/ml FGF2。在另一個實施方案中，包 含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的8-12ng/ml FGF2。 在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 胰島素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 1-100 μ g/ml胰島素(實施例1)。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一 步包含補加到培養基中的20-50μ g/ml胰島素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞 的組合物進一步包含補加到培養基中的50-100 μ g/ml胰島素。在另一個實施方案中，包含 椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的5-15 μ g/ml胰島素。在另一個實施 方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的8-12μ g/ml胰島素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 孕酮(實施例1)。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培 養基中的l-200ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含 補加到培養基中的20-200ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物 進一步包含補加到培養基中的50-150ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細 胞的組合物進一步包含補加到培養基中的lO-lOOng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含 椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的20-80ng/ml孕酮。在另一個實施方 案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的30-50ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 腐胺(實施例1)。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培 養基中的l-800ng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含 補加到培養基中的Ι-lOOng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進 一步包含補加到培養基中的100-300ng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞 的組合物進一步包含補加到培養基中的300-500ng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含椎 間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的500-800ng/ml腐胺。在另一個實施方 案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的150-250ng/ml腐胺。在另 一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的180-220ng/ml 腐胺。 在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 運鐵蛋白(實施例1)。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加 到培養基中的l-400ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進 一步包含補加到培養基中的Ι-lOOng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細 胞的組合物進一步包含補加到培養基中的100-200ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中， 包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的200-400ng/ml運鐵蛋白。在另 一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的20-150ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的80-200ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含 補加到培養基中的80-120ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 亞硒酸鈉(實施例1)。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加 到培養基中的l-400ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進 一步包含補加到培養基中的Ι-lOOng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細 胞的組合物進一步包含補加到培養基中的100-200ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中， 包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的200-400ng/ml亞硒酸鈉。在另 一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的20-150ng/ml 亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中 的40-180ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含 補加到培養基中的40-80ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 甲基纖維素(實施例1)。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補 加到培養基中的0. 5-10%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物 進一步包含補加到培養基中的0. 5-3%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細 胞的組合物進一步包含補加到培養基中的3-5%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含椎 間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的5-8%甲基纖維素。在另一個實施方案 中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的7-10%甲基纖維素。在另一 個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-2. 5%甲基 纖維素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 1-2. 5%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到 培養基中的1. 5-2. 5%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中 的抗生素(實施例1)。在另一個實施方案中，補加到培養基中的的抗生素是青霉素-鏈 霉素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 1000-10000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一 步包含補加到培養基中的1000-3000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含椎 間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的3000-6000U/ml青霉素-鏈霉素。在另 一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的6000-10000U/ ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到 培養基中的3000-8000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的 組合物進一步包含補加到培養基中的4000-6000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案 中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的5000U/ml青霉素-鏈霉素.在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 敲除(KO)血清替代品。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加 到培養基中的0. 5-30% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物 進一步包含補加到培養基中的5-30% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的3-5% KO血清替代品。在另一個實施方案中， 包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的5-15% KO血清替代品。在另一 個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的15-30% KO血清 替代品。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 10-20% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補 加到培養基中的15-25% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合 物進一步包含補加到培養基中的20% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養 基中的0. 1-10%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步 包含補加到培養基中的0.1-1%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的 組合物進一步包含補加到培養基中的1-5%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含椎 間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的5-10%非必需氨基酸。在另一個實施 方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的15-30%非必需氨基酸。 在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-1% 非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養 基中的0. 8-1. 2%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步 包含補加到培養基中的非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基 中的0. I-IOmM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含 補加到培養基中的0. l-5mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合 物進一步包含補加到培養基中的5-10mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤 干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的5-8mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中， 包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-2. 5mM L-谷氨酰胺。在另 一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的1. 5-3mM L-谷 氨酰胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 0. 5-1. 5mML-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加 到培養基中的0. 8-1. 2mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中 的β-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到 培養基中的0.01-lmMi3-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物 進一步包含補加到培養基中的0. 01-0. 5πΜβ-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含椎 間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的0.5-lmMi3-巰基乙醇。在另一個實 施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-0. SmM β-巰基 乙醇。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的 00. 5-0. 25πιΜβ-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含 補加到培養基中的0. 15-0.3mMi3-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的 組合物進一步包含補加到培養基中的0. 05-0. 15πιΜβ-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 08-0. 12πιΜβ -巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含具有Dulbecco' s 改良的Eagle' s培養基(DMEM)的培養基。在另一個實施方案中，包含discosphere的組 合物進一步包含具有DMEM/F12的培養基。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合 物進一步包含具有Hamm' s培養基的培養基。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的 組合物進一步包含具有Hamm' s/F12培養基的培養基。在另一個實施方案中，包含椎間盤 干細胞的組合物進一步包含具有ESGRO Complete Accutase 的培養基。在另一個實施 方案中，ESGRO Complete Accutase 是用于使得在用ESGROComplete 克隆級別培養基在 無血清培養條件下培養的干細胞脫離(detachment)的蛋白酶解和溶膠原酶的細胞脫離溶 液。在另一個實施方案中，在Dulbecco' s PBS中的1 X Accutase 酶包含0. 5mM EDTA *4Na 和3mg/L苯酚。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物進一步包含具有HEScGRO hES細胞培養基(Chemicon Temecula, CA)的培養基。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物用于將椎間盤干細胞鋪板于超 低附著板中。在另一個實施方案中，包含椎間盤干細胞的組合物用于將椎間盤干細胞鋪板 于用抗粘合物質預包被的超低附著板中。在另一個實施方案中，所述抗粘合物質是甲基丙 烯酸-2-羥乙酯。在另一個實施方案中，本發明提供了分離的discosphere。在另一個實施方案 中，本發明的椎間盤干細胞產生分離的discosphere。在另一個實施方案中，本發明的 discosphere是干細胞增殖的結果，其產生額外的干細胞和祖細胞。在另一個實施方案中， discosphere是由于干細胞增殖的結果而形成。在另一個實施方案中，本發明的分離的discosphere包含排列成圓球狀結構的髓 核干細胞和髓核祖細胞。在另一個實施方案中，分離的discosphere的這樣的細胞球狀物， 其中單個椎間盤干細胞產生自身克隆(對稱分裂)和祖細胞。在另一個實施方案中，本發 明的discosphere是排列成圓球狀結構的髓核干細胞和髓核祖細胞的自由浮動聚集體。在 另一個實施方案中，本發明的discosphere培養物包含孤立的自由浮動discosphere。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了分離本發明的discosphere可易于由 本領域技術人員在光學顯微鏡下進行。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了通過將椎間盤干細胞鋪板于無血清培 養基中及保溫制備單細胞懸浮液以分離椎間盤干細胞。在另一個實施方案中，本發明的 方法提供了通過將椎間盤干細胞鋪板于無血清培養基中及保溫制備單細胞懸浮液以產生 discosphere。在另一個實施方案中，本發明提供了產生discosphere的方法，包括在無血清培 養基中使髓核細胞培養物生長的步驟，從而產生discosphere。在另一個實施方案中，本發 明提供了使無血清培養基中髓核細胞原代培養物生長，從而選擇髓核干細胞。在另一個實 施方案中，剩余的分離的髓核干細胞培養物產生本發明的discosphere。在另一個實施方 案中，剩余的富集的髓核干細胞培養物產生本發明的discosphere。在另一個實施方案中， 根據本發明的方法產生的discosphere在本發明的組合物中生長。在另一個實施方案中， 根據本發明的方法產生的discosphere在補加的本發明培養基中生長。在另一個實施方案 中，根據本發明的方法產生的discosphere在不允許細胞_基質附著的條件下生長。在另一個實施方案中，不允許細胞-基質附著的條件包括例如向本發明的細胞培養基中加入大 約0. 2-2%甲基纖維素。在另一個實施方案中，本發明提供包含discosphere的組合物。在另一個實施方 案中，本發明的組合物包含一個discosphere。在另一個實施方案中，本發明的組合物包含 至少IX IO2個discosphere。在另一個實施方案中，本發明的組合物包含至少IX IO3個 discosphere。在另一個實施方案中，本發明的組合物包含至少1 X IO4個discosphere。在 另一個實施方案中，本發明的組合物包含至少IX IO5個discosphere。在另一個實施方案 中，本發明的組合物包含至少IX IO6個discosphere。
在另一個實施方案中，本發明的組合物包含discosphere和培養基。在另一個實 施方案中，所述培養基是無血清培養基。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物 進一步包含補加到培養基中的EGF。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一 步包含補加到培養基中的1-lOng/ml EGF。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合 物進一步包含補加到培養基中的1-lOOng/ml EGF。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的20-50ng/ml EGF。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的50-100ng/ml EGF。在另一個實施方 案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的5-15ng/ml EGF。在另一個 實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的8-12ng/ml EGF。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中 的FGF。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 FGF2。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 l-100ng/ml FGF2。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培 養基中的20-50ng/mlFGF2。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含 補加到培養基中的50-100ng/ml FGF2。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物 進一步包含補加到培養基中的5-15ng/ml FGF2。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的8-12ng/mlFGF2。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中 的胰島素(實施例2及材料與方法章節)。在另一個實施方案中，包含discosphere的 組合物進一步包含補加到培養基中的l-100yg/ml胰島素。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的20-50 μ g/ml胰島素。在另一個實施 方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的50-100 μ g/ml胰島素。 在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的5_15μ g/ ml胰島素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中 的3-7μ g/ml胰島素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 孕酮。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 l-200ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培 養基中的20-200ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含 補加到培養基中的50-150ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物 進一步包含補加到培養基中的lO-lOOng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的20-80ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的15-25ng/ml孕酮。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的腐胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中 的l-800ng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加 到培養基中的Ι-lOOng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一 步包含補加到培養基中的100-300ng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的300-500ng/ml腐胺。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的500-800ng/ml腐胺。在另一個實施方 案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的150-250ng/ml腐胺。在另 一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的140-160ng/ml 腐胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基 中的l-400ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包 含補加到培養基中的Ι-lOOng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含discosphere的 組合物進一步包含補加到培養基中的100-200ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包 含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的200-400ng/ml運鐵蛋白。在另一 個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的20-150ng/ml運 鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 80-200ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加 到培養基中的30-70ng/ml運鐵蛋白。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基 中的l-400ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包 含補加到培養基中的Ι-lOOng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含discosphere的 組合物進一步包含補加到培養基中的100-200ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包 含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的200-400ng/ml亞硒酸鈉。在另一 個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的20-150ng/ml亞 硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 40-180ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加 到培養基中的20-40ng/ml亞硒酸鈉。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基 中的0. 5-10%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含 補加到培養基中的0. 5-3%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物 進一步包含補加到培養基中的3-5%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的5-8%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的7_10%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-2. 5%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的1_2. 5%甲 基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中 的0. 6-1%甲基纖維素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 抗生素。在另一個實施方案中，補加到培養基中的的抗生素是青霉素-鏈霉素。在另一 個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的1000-10000U/ ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加 到培養基中的1000-3000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的3000-6000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施 方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的6000-10000U/ml青霉 素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基 中的3000-8000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物 進一步包含補加到培養基中的4000-6000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包 含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的5000U/ml青霉素-鏈霉素。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養 基中的0.5-30% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一 步包含補加到培養基中的5-30% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的3-5% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的5_15% KO血清替代品。在另一個實施 方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的15-30% KO血清替代品。 在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的10_20% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養 基中的15-25% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步 包含補加到培養基中的20% KO血清替代品。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養 基中的0. 1-10%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步 包含補加到培養基中的0. 1-1%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的1-5%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的5_10%非必需氨基酸。在另一個實施 方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的15_30%非必需氨基酸。 在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-1 % 非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養 基中的0. 8-1. 2%非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步 包含補加到培養基中的非必需氨基酸。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的0. I-IOmM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步 包含補加到培養基中的0. l-5mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的5-10mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的5_8mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方 案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-2. 5mM L-谷氨酰胺。 在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的1. 5_3mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基 中的0. 5-1. 5mM L-谷氨酰胺。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包 含補加到培養基中的0. 8-1. 2mM L-谷氨酰胺。
在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 β -巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基 中的0. Ol-ImM β-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包 含補加到培養基中的0. 01-0. 5πιΜβ -巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含discosphere 的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5-1πιΜβ-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含 discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的0. 5_0. 8mMβ -巰基乙醇。在另一個 實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的00. 5-0. 25πιΜβ -巰 基乙醇。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補加到培養基中的 0. 15-0. 3mM β-巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含補 加到培養基中的0. 05-0. 15πιΜβ -巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含discosphere的組 合物進一步包含補加到培養基中的0. 08-0. 12πιΜβ -巰基乙醇。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含具有Dulbecco' s 改良的Eagle' s培養基(DMEM)的培養基。在另一個實施方案中，包含discosphere的組 合物包含進一步包含DMEM/F12的培養基。在另一個實施方案中，包含discosphere的組 合物包含進一步包含ESGRO CompleteTMAccutaseTM的培養基。在另一個實施方案中，ESGRO Complete Accutase 是用于使得在用ESGRO Complete 克隆級別培養基在無血清培養條 件下培養的干細胞脫離(detachment)的蛋白酶解和溶膠原酶的細胞脫離溶液。在另一個 實施方案中，在 Dulbecco' s PBS 中的 1 X Accutase 酶包含 0. 5mMEDTA · 4Na 和 3mg/L 苯 酚。在另一個實施方案中，包含discosphere的組合物進一步包含具有HEScGRO hES細胞 培養基(Chemicon Temecula, CA)的培養基。在另一個實施方案中，本發明提供了進一步擴增通過本發明的方法獲得的 discosphere。在另一個實施方案中，本發明提供了通過在補加膠原酶的DMEM/F12培養基 中在37°C保溫解離discosphere。在另一個實施方案中，本發明提供了解離的細胞通過將 其再置于基于甲基纖維素培養基中擴增。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當椎間盤組織生長時，在培養基中補 加8-20%胎牛血清(FBS)。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當椎間盤組織在支 架中生長時，在培養基中補加8-20%胎牛血清(FBS)。在另一個實施方案中，所述培養基包 含30-70%得自原代人包皮成纖維細胞培養物的培養基，或者其組合物。在另一個實施方案 中，本發明的方法提供了當椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其組合細胞生長時，培養基中 不含血清。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其組合細胞生長時，培養基中不含血清替代品。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了 當椎間盤干細胞生長時，培養基中不含FBS。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當 髓核干細胞生長時，培養基中不含FBS。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當祖細 胞生長時，培養基中不含ras。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當髓核祖細胞生長時，培養基中不含FBS。
在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當分離椎間盤干細胞或者椎間盤祖細 胞時，培養基中不含血清或者血清替代品。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當針 對椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其組合富集異種細胞群時，培養基中不含血清或者血 清替代品。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞 或者其組合的discosphere生長時，培養基中不含血清或者血清替代品。在另一個實施方 案中，本發明的方法提供了當擴增包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其組合的培養物 時，培養基中不含血清或者血清替代品。在另一個實施方案中，本發明的方法提供了當擴增 富集椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其組合時，培養基中不含血清或者血清替代品。在另一個實施方案中，本發明提供了包含髓核細胞的椎間盤置換裝置。在另一個 實施方案中，本發明提供了包含髓核細胞的人工椎間盤。在另一個實施方案中，所述椎間盤 置換裝置是椎骨間椎間盤置換裝置。在另一個實施方案中，椎骨間椎間盤位于相鄰的椎體 終板的凹面關節面之間。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤置換裝置允許如屈、伸、側屈和旋轉等運動。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤置換裝置用于修復和/或置換受 傷或損壞的椎間盤。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤置換裝置提供了修復的椎間盤， 其組合支持患者脊柱高負荷的穩定性以及為患者提供足夠的運動性和正確脊柱負荷分布 的靈活性。在另一個實施方案中，所述椎間盤置換裝置包含椎間盤支架。在另一個實施方案 中，所述支架包含形狀記憶合金。在另一個實施方案中，形狀記憶合金可以在其馬氏體相 (martensite phase)期間變形，但是當其在高于一定溫度如奧氏體相(austenite phase) 溫度加熱時恢復期原始形狀。在另一個實施方案中，本發明的形狀記憶合金呈現出超彈性 性質，從而能承受較大變形而不破壞其結構。在另一個實施方案中，所述椎間盤置換裝置包含剛性部分，從椎骨接觸面伸出的 凸起充填于脊椎之間，并伸入椎體中。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含椎間盤關 節成形術裝置以置換椎間盤。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含球窩使得可以旋 轉。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含中間層，使得上下關節之間可以運動。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含兩個終板，其錨定椎骨的上下表面。在 另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含兩個金屬終板，其錨定椎骨的上下表面。在另一個 實施方案中，所述金屬是鈷-鉻合金。在另一個實施方案中，所述終板用髓核粘附分子包 被。在另一個實施方案中，所述終板用促進髓核生長的分子包被。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含陶瓷。在另一個實施方案中，椎間盤置 換裝置包含可注射液體。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含水凝膠。在另一個實 施方案中，椎間盤置換裝置包含在柔性的、無彈性的機織聚乙烯護套中的水凝膠核心。在另 一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含聚乙烯醇材料。在另一個實施方案中，椎間盤置換 裝置包含可膨脹物。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含彈性線圈(elasticcoil)。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含拉長的彈性記憶盤繞螺旋(memory-coiling spiral)。在另一個實施方案中，拉長的彈性記憶盤繞螺旋由聚碳酸酯聚氨酯制成。在另一 個實施方案中，椎間盤置換裝置包含連體的凸起表面的陶瓷或金屬植入體，其作為半關節 成形術錨定下位椎體。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含由聚氨酯制成的氣囊樣 植入體。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置包含蛋白質水凝膠。在另一個實施方案中， 椎間盤置換裝置包含熱聚合物。在另一個實施方案中，椎間盤支架包含ECM成分。在另一個實施方案中，所述ECM 成分是結構蛋白。在另一個實施方案中，椎間盤支架包含膠原。在另一個實施方案中，所述 結構蛋白是彈性蛋白。在一些實施方案中，所述ECM成分是特化蛋白質。在另一個實施方案 中，所述特化蛋白質是微纖維蛋白。在另一個實施方案中，所述特化蛋白質是纖連蛋白。在 另一個實施方案中，所述特化蛋白質是層粘蛋白(Iaminin)。在一些實施方案中，所述ECM 成分是蛋白聚糖。在一個實施方案中，蛋白聚糖由蛋白質核心及與其附著的稱作糖胺聚糖 (GAG)的長鏈重復二糖單位組成，形成極復雜的高分子量成分。在另一個實施方案中，膠原是I型膠原。在另一個實施方案中，I型膠原包含 [al(I)]2[a(I)]鏈。在另一個實施方案中，I型膠原得自皮膚、肌腱或者骨。在另一個實施方案中，膠原是II型膠原。在另一個實施方案中，II型膠原包含 [al(II)]3鏈。在另一個實施方案中，II型膠原得自軟骨或者玻璃體液。在另一個實施方 案中，II型膠原原纖維在基質中通過IX型膠原與蛋白聚糖交聯。在另一個實施方案中，膠原是III型膠原。在另一個實施方案中，III型膠原包含 [al(III)]3鏈。在另一個實施方案中，III型膠原得自皮膚或肌肉，通常與I型膠原一起被 發現。在另一個實施方案中，膠原是IV型膠原。在另一個實施方案中，IV型膠原包含 [al(IV)2[a2(IV)]鏈。在另一個實施方案中，IV型膠原得自基膜。在另一個實施方案中，膠原是V型膠原。在另一個實施方案中，V型膠原包含 [al(V)][a2(V)][a3(V)]鏈。在另一個實施方案中，V型膠原得自與I型膠原相關的間質組織
在另一個實施方案中，膠原是VI型膠原。在另一個實施方案中，VI型膠原包含 [al (VI) ][a2 (VI) ][a3 (VI)]鏈。在另一個實施方案中，VI型膠原得自與I型膠原相關的間 質組織。在另一個實施方案中，VI型膠原由長度為大約60nm的相對短的三螺旋區域組成， 由長度為大約40nm的球狀區域間隔。在一些實施方案中，純VI型膠原的原纖維形成與串 珠相似結構。在一個實施方案中，膠原是VII型膠原。在一個實施方案中，VII型膠原包含 [al(VII)]3鏈。在另一個實施方案中，VII型膠原得自上皮。在另一個實施方案中，膠原是VIII型膠原。在另一個實施方案中，VIII型膠原包 含[al(VIII)]3鏈。在另一個實施方案中，VIII型膠原得自內皮細胞。在另一個實施方案中，膠原是IX型膠原。在另一個實施方案中，IX型膠原包含 [al (IX) ][a2 (IX) ][a3 (IX)]鏈。在另一個實施方案中，IX型膠原得自與II型膠原相關的 軟骨。在另一個實施方案中，膠原是X型膠原。在另一個實施方案中，X型膠原包含[al(X)]3鏈。在另一個實施方案中，X型膠原得自肥厚性軟骨(hypertrophic cartilage) 禾口礦化軟骨(mineralizing cartilage)。 在另一個實施方案中，膠原是XI型膠原。在另一個實施方案中，XI型膠原包含 [al (XI) ][a2 (XI) ][a3 (XI)]鏈。在另一個實施方案中，XI型膠原得自軟骨。在另一個實施方案中，膠原是XII型膠原。在另一個實施方案中，XII型膠原包含 al (XII)鏈。在另一個實施方案中，XII型膠原得自I型和III型膠原存在的部位。在另一個實施方案中，I型膠原分子并排包在一起，形成直徑為50-200nm的原纖 維。在一些實施方案中，原纖維，相鄰膠原分子互相置換67nm，大約為它們的長度的四分之 一。在一些實施方案中，I、II、III和V型膠原通過并行相互作用形成桿狀三螺旋。在另一個實施方案中，本發明的膠原得自牛。在另一個實施方案中，本發明的膠原 得自患者自體脂肪或者透明質酸。在另一個實施方案中，膠原是已經修飾的膠原樣物質，通過將膠原溶解于水中并 且修飾該溶解的膠原使其表面電荷與修飾前相比更加陽性。在另一個實施方案中，這種材 料為本領域熟知，在例如美國專利No. 4，238，480中揭示。在另一個實施方案中，凍干修飾 的膠原以形成固體凝膠。在一些實施方案中，固體凝膠可以是桿狀、條帶、薄膜或者薄片形 狀。在另一個實施方案中，適用于本發明中的其它形式的膠原包括SemedF，這是在天 然纖維形式中不經任何化學或酶修飾生產的膠原制備物，以及Semed S，這是從新鮮牛皮中 提取的凍干的膠原粉末。在另一個實施方案中，SemedF材料是I型膠原(高于95%)，而 Semed S是I型膠原與III型膠原的混合物，其中原膠原的形狀和尺寸以其自然螺旋方向保
&3 甶ο在另一個實施方案中，待凍干的液體中膠原的濃度可以是0.5-10%，要選1-5%， 濃度越低則形成較低密度或不連續的固體。在另一個實施方案中，在0. 5-1%的較低濃度， Semed F形成近似蜘蛛網密度的結構。在另一個實施方案中，也可以單獨或者摻入可塑劑一起使用天然膠原薄膜，其中 薄膜強度得以保持，且膠原聚合物的三螺旋結構得以完整保持。在另一個實施方案中，利用凝膠或者其它水溶形式膠原。在另一個實施方案中，可 溶形式膠原在體溫易于聚合形成穩定的皮下凝膠。在另一個實施方案中，當將可溶形式的 膠原植入機體中時，聚合材料迅速群聚植入其中的髓核細胞并形成成纖維細胞。在一些實 施方案中，該材料血管化且可以保持組織學穩定性。在另一個實施方案中，該材料血管化且 可以保持組織學穩定性至少4個月。在另一個實施方案中，該材料血管化且可以保持組織 學穩定性至少6個月。在另一個實施方案中，該材料血管化且可以保持組織學穩定性至少 8個月。在另一個實施方案中，該材料血管化且可以保持組織學穩定性至少10個月。在另 一個實施方案中，該材料血管化且可以保持組織學穩定性至少12個月。在另一個實施方案 中，該材料血管化且可以保持組織學穩定性至少15個月。在另一個實施方案中，該材料血 管化且可以保持組織學穩定性至少18個月。在另一個實施方案中，本發明提供了本發明各種類型膠原的混合物，以獲得每個 級別最希望的特征。在另一個實施方案中，纖連蛋白是2個相似肽的二聚物。在另一個實施方案中，纖連蛋白的每個鏈的長度為60-70nm，厚度為2-3nm。在另一個實施方案中，纖連蛋白含有至 少6個緊密折疊的結構域，每個結構域對于不同底物具有高親和性，所述底物如硫酸類肝 素、膠原(I、II和III型膠原的單獨結構域)以及纖維蛋白和細胞表面受體。在另一個實施方案中，層粘蛋白(Iaminin)分子是由α、β和Y鏈裝配的異源三聚體。在一些實施方案中，層粘蛋白形成單獨的網，且通過entactin核perlecan與IV型 膠原網關聯。在一些實施方案中，層粘蛋白有助于細胞生存力、附著和分化、細胞形狀和運 動、維持組織表型以及促進組織存活。在另一個實施方案中，蛋白聚糖包含硫酸軟骨素和硫酸皮膚素鏈。在另一個實施方案中，蛋白聚糖包含硫酸肝素和硫酸類肝素鏈。在另一個實施方案中，蛋白聚糖包含硫酸 角質素鏈。在另一個實施方案中，蛋白聚糖是aggrecan，是軟骨中的主要蛋白聚糖。在另一 個實施方案中，蛋白聚糖是versican，存在于許多成人組織包括血管和皮膚中。在另一個實 施方案中，蛋白聚糖是小型富含亮氨酸重復蛋白多糖(SLRP)。在另一個實施方案中，SLRP 包括核心蛋白多糖、雙糖鏈蛋白多糖、纖調蛋白和基膜聚糖。在另一個實施方案中，胞外基質成分是分碎的(morselized)。在另一個實施方案 中，分碎的胞外基質蛋白增加髓核細胞附著的表面積。在另一個實施方案中，分碎的胞外基 質蛋白增加discosphere附著的表面積。在另一個實施方案中，分碎的胞外基質蛋白增加 椎間盤干細胞附著的表面積。在另一個實施方案中，分碎的胞外基質蛋白增加椎間盤祖細 胞附著的表面積。在另一個實施方案中，分碎的胞外基質蛋白增加表面積，因此有助于營養 物質和廢物從一個移植體擴散至另一個移植體。在另一個實施方案中，分碎的胞外基質蛋 白使得髓核細胞可以通過針頭或者小套管導入椎間盤支架中。在另一個實施方案中，分碎 的胞外基質蛋白使得discosphere可以通過針頭或者小套管導入椎間盤支架中。在另一個 實施方案中，可以做一小切口以插入椎間盤支架中進行細胞附著。在另一個實施方案中，本發明提供了椎間盤支架得自動物或人。在另一個實施方 案中，本發明提供了椎間盤支架是椎骨終板保持完整的椎間盤。在另一個實施方案中，本發 明提供了椎間盤支架是椎骨終板保持完整的兔椎間盤(實施例3)。在另一個實施方案中， 本發明提供了椎間盤支架是椎骨終板保持完整的狗椎間盤。在另一個實施方案中，本發明 提供了椎間盤支架是椎骨終板保持完整的馬椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了 椎間盤支架是椎骨終板保持完整的猴椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了椎間盤 支架是椎骨終板保持完整的豬椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了椎間盤支架是 椎骨終板保持完整的牛椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了包含膠原的椎間盤支 架進一步包含額外的材料如陶瓷或金屬。在另一個實施方案中，本發明提供了椎間盤置換裝置包含髓核細胞。在另一個實 施方案中，本發明提供了椎間盤置換裝置包含人髓核細胞。在另一個實施方案中，本發明 提供了椎間盤置換裝置包含髓核干細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了椎間盤置換 裝置包含髓核祖細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了椎間盤置換裝置包含本發明的 discosphere。在另一個實施方案中，椎間盤置換裝置進一步包含培養基。在另一個實施方案中， 所述培養基包含本發明的細胞培養基(實施例3)。在另一個實施方案中，本發明提供了產生人工椎間盤的方法，包括discosphere在椎間盤支架中生長的步驟。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝 置的方法，包括discosphere在椎間盤支架中生長的步驟。在另一個實施方案中，將 discosphere給予在椎間盤支架上。在另一個實施方案中，將discosphere給予在椎間盤 支架中包含膠原的層中。在另一個實施方案中，將discosphere給予在椎間盤支架中包 含膠原的層上。在另一個實施方案中，將discosphere注射進椎間盤支架中(實施例4)。 在另一個實施方案中，將discosphere注射在椎間盤支架上。在另一個實施方案中，將 discosphere注射進椎間盤支架中包含膠原的層中。在另一個實施方案中，將discosphere 注射在椎間盤支架中包含膠原的層上。在另一個實施方案中，將本發明的discosphere與 本發明的組合物一起應用于或者注射進椎間盤支架中或其上。在另一個實施方案中，將本 發明的discosphere與補加10% F CS的DMEM/F1培養基一起應用于或者注射進椎間盤支架 中或其上。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括髓核細胞 在椎間盤支架中生長的步驟。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的 方法，包括discosphere在椎間盤支架中生長的步驟，從而產生椎間盤組織。在另一個實 施方案中，本發明的椎間盤組織包含本發明的椎間盤支架。在另一個實施方案中，本發明 的椎間盤組織包含本發明的髓核細胞。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤組織包含本 發明的椎間盤支架。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤組織包含在本發明的椎間盤支 架上生長的本發明的髓核細胞。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤組織包含本發明的 椎間盤支架。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤組織包含得自附著于本發明椎間盤支 架的本發明discosphere的成熟髓核細胞。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤組織包 含得自附著于本發明椎間盤支架的本發明椎間盤干細胞的成熟髓核細胞。在另一個實施 方案中，本發明的椎間盤組織包含成纖維細胞和得自附著于本發明椎間盤支架的本發明 discosphere的成熟髓核細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明 的椎間盤支架用髓核細胞生長因子包被。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤 置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架用髓核細胞粘附因子包被。在另一個實施方 案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架用髓核細胞 分化因子包被。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本 發明的椎間盤支架置于包含髓核細胞生長因子、粘附因子和分化因子的培養基中。在另一 個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架置 于包含髓核細胞生長因子、粘附因子和分化因子的細胞培養基中。在另一個實施方案中， 本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架置于包含DMEM/F12 培養基的培養基中。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括 將本發明的椎間盤支架置于包含具有DMEM/F12培養基和10%胎牛血清(FCS)的培養基中 (實施例3)。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明 的椎間盤支架在本發明的培養基中在35-42°C保溫。在另一個實施方案中，本發明提供了產 生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架在本發明的培養基中在36-38°C保 溫。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架在本發明的培養基中在37°C保溫。
在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明 的椎間盤支架在本發明的培養基中在保持4-10% CO2的條件下保溫。在另一個實施方案中， 本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架在本發明的培養基 中在保持4-8% CO2的條件下保溫。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝 置的方法，包括將本發明的椎間盤支架在本發明的培養基中在保持5% CO2的條件下保溫。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明 的椎間盤支架在本發明的培養基中在培養箱中保溫2-12個小時。在另一個實施方案中，本 發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架在本發明的培養基中 在培養箱中保溫3-10個小時。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的 方法，包括將本發明的椎間盤支架在本發明的培養基中在培養箱中保溫6-10小時。在另一 個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括將本發明的椎間盤支架在 本發明的培養基中在培養箱中保溫8小時。在另一個實施方案中，本發明提供了將本發明的椎間盤支架在培養箱中本發明的 培養基中保溫，包括在將髓核細胞應用于椎間盤支架中或其上之前制備椎間盤支架的步 驟。在另一個實施方案中，本發明提供了將本發明的椎間盤支架在培養箱中的本發明的培 養基中保溫，使得本發明的髓核細胞在椎間盤支架上貼壁、生長和分化。在另一個實施方 案中，本發明提供了將本發明的椎間盤支架在培養箱中的本發明的培養基中保溫，使得本 發明的discosphere髓核細胞在椎間盤支架上貼壁、生長和分化。在另一個實施方案中，本 發明提供了將本發明的椎間盤祖細胞在培養箱中的本發明的培養基中保溫，使得本發明的 髓核細胞在椎間盤支架上貼壁、生長和分化。在另一個實施方案中，本發明提供了將本發明 的椎間盤支架在培養箱中的本發明的培養基中保溫，使得本發明的椎間盤干細胞在椎間盤 支架上貼壁、生長和分化。在另一個實施方案中，本發明提供了將本發明的椎間盤支架在培 養箱中的本發明的培養基中保溫，使得本發明的髓核細胞、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞、 discosphere或者其任何組合在椎間盤支架上貼壁、生長和分化。在另一個實施方案中，本發明提供了收獲自體移植的髓核細胞、培養并注射進 椎間盤支架中心(實施例4)。在另一個實施方案中，本發明提供了收獲同種異體移植 (allograft)的髓核細胞、培養并注射進椎間盤支架中。在另一個實施方案中，本發明提供 了收獲異種移植的髓核細胞、培養并注射進椎間盤支架中心。在另一個實施方案中，本發明提供了將髓核干細胞、髓核祖細胞、discosphere或 者其組合物植入椎間盤支架中形成活的髓核。在另一個實施方案中，將得自細胞培養物的 髓核干細胞、髓核祖細胞、discosphere或者其組合物植入椎間盤支架中形成活的髓核。在另一個實施方案中，將椎間盤干細胞給予椎間盤支架上。在另一個實施方案中， 將椎間盤干細胞給予椎間盤支架中包含膠原的層中。在另一個實施方案中，將椎間盤干細 胞給予椎間盤支架中包含膠原的層上。在另一個實施方案中，將椎間盤干細胞注射進椎間 盤支架中。在另一個實施方案中，將椎間盤干細胞注射進椎間盤支架上。在另一個實施方 案中，將椎間盤干細胞注射進椎間盤支架中包含膠原的層中。在另一個實施方案中，將椎間 盤干細胞注射進椎間盤支架中包含膠原的層上。在另一個實施方案中，將本發明的椎間盤 干細胞與本發明的組合物一起應用于或者注射進椎間盤支架中或其上。在另一個實施方案中，將本發明的椎間盤干細胞與具有10% FCS的DMEM/F12培養基一起注射進椎間盤支架中或其上。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括使髓核原 代細胞在椎間盤支架中生長。在另一個實施方案中，將椎間盤原代細胞給予椎間盤支架上。 在另一個實施方案中，將椎間盤原代細胞給予椎間盤支架中包含膠原的層中。在另一個實 施方案中，將椎間盤原代細胞給予椎間盤支架中包含膠原的層上。在另一個實施方案中，將 椎間盤原代細胞注射進椎間盤支架中。在另一個實施方案中，將椎間盤原代細胞注射進椎 間盤支架上。在另一個實施方案中，將椎間盤原代細胞注射進椎間盤支架中包含膠原的層 中。在另一個實施方案中，將椎間盤原代細胞注射進椎間盤支架中包含膠原的層上。在另 一個實施方案中，將椎間盤原代細胞與本發明的組合物一起應用于或者注射進椎間盤支架 中或其上。在另一個實施方案中，將椎間盤原代細胞與具有10% FCS的DMEM/F12培養基一 起應用于或者注射進椎間盤支架中或其上。在另一個實施方案中，本發明提供了產生椎間盤置換裝置的方法，包括通過本領 域技術人員已知的方法從本發明的細胞培養基中收集discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤 祖細胞或者其混合物，并且將該細胞置于DMEM/F12中。在另一個實施方案中，本發明提供 了首先洗滌discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物，除去細胞-基質粘 附抑制因子。在另一個實施方案中，本發明提供了首先洗滌discosphere、椎間盤干細胞、椎 間盤祖細胞或者其混合物，除去甲基纖維素。在另一個實施方案中，本發明提供了將洗滌后基本無細胞-基質粘附抑制因子的 discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物置于細胞培養基中。在另一個實 施方案中，本發明提供了將洗滌后基本無細胞-基質粘附抑制因子的discosphere、椎間盤 干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物置于DMEM中。在另一個實施方案中，本發明提供了將 洗滌后基本無細胞_基質粘附抑制因子的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者 其混合物置于DMEM/F12中。在另一個實施方案中，本發明提供了將洗滌后基本無細胞-基 質粘附抑制因子的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物置于包含血清 的 DMEM/F12 中。在另一個實施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物 被導入在本發明細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中，discosphere、椎間 盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物被導入在包含重組產生的形態發生蛋白的細胞培養 基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞 或者其混合物被導入在包含PDGF的細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中， discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物被導入在包含TGF-β的細胞培 養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞 或者其混合物被導入在包含EGF/TGF-α的細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實施 方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物被導入在包含IGF-I的 細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤 祖細胞或者其混合物被導入在包含β-FGF的細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實 施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物被導入在包含水凝膠 的細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物被導入在包含可吸收的或者不可再吸收的合成或天然聚合物的細胞培養基中的椎間盤支架中，所述聚合物例如但不限于膠原、纖維蛋白、聚乙醇酸、聚乳 酸或者聚四氟乙烯。在另一個實施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或 者其混合物被導入在包含抗生素的細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中， discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物被導入在包含抗炎藥物的細胞培 養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中，discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞 或者其混合物被導入在包含免疫抑制藥物的細胞培養基中的椎間盤支架中。在另一個實施方案中，本發明提供了纖維環的膠原纖維排列成5-50層或片。在另 一個實施方案中，本發明提供了纖維環的膠原纖維排列成10-40層或片。在另一個實施方 案中，本發明提供了纖維環的膠原纖維排列成20-30層或片。在另一個實施方案中，本發明提供了纖維環的纖維在層間交替改變方向。在另一 個實施方案中，本發明提供了可以加壓使鈍端針頭或者套管通過纖維環。在另一個實施方 案中，本發明提供了在注射移植的髓核細胞或discosphere之后撤回針頭時，纖維環的分 開的纖維恢復至其正常位置，封閉纖維環。在另一個實施方案中，本發明提供了針頭可以插 入椎間盤支架的前面或側面。在另一個實施方案中，本發明提供了本領域技術人員意識到 可以在透視指導(fluourscopic guidance)下將針頭經皮插入椎間盤側面以及經腹腔鏡將 針頭插入椎間盤前面。在另一個實施方案中，本發明提供了本發明的髓核細胞的接受者是提供者。在另 一個實施方案中，本發明提供了本發明髓核細胞的接受者至少部分與提供者至少部分相 關。在另一個實施方案中，本發明提供了本發明的髓核細胞的提供者是一個提供者。在另 一個實施方案中，本發明提供了多個提供者為一個接受者提供本發明的髓核細胞。在另一 個實施方案中，本發明提供了多個提供者為多個接受者提供本發明的髓核細胞。在另一個 實施方案中，本發明提供了使用胎兒來源。在另一個實施方案中，本發明提供了本發明的髓 核細胞的提供者優選與接受者具有家族關系，以使得免疫抑制最小化或者不存在。在另一 個實施方案中，本發明提供了本發明的髓核細胞的提供者優選與接受者具有家族關系，以 使得免疫抑制物質的需要最小化或者不需要。在另一個實施方案中，本發明提供了組織獲 得的指導，包括切除手術技術、提供者死亡與組織獲得之間的時間，以及檢測提供者的感染 性疾病等指導，這些為本領域技術人員熟知。在另一個實施方案中，本發明提供了注射進椎間盤支架中或其上的髓核細胞沉 積胞外基質成分。在另一個實施方案中，本發明提供了注射進椎間盤支架中或其上的 discosphere沉積椎間盤胞外基質成分。在另一個實施方案中，本發明提供了這些胞外基質 成分形成適合椎間盤隨后的生理學功能的形狀。在另一個實施方案中，本發明提供了這些 胞外基質成分形成適合椎間盤隨后生物機械學功能的形狀。在另一個實施方案中，本發明 提供了通過第2周保溫，證實椎間盤組織對壓力具有抗性。在另一個實施方案中，本發明提 供了通過第3周保溫，證實椎間盤組織對壓力具有抗性。在另一個實施方案中，本發明提供 了對于壓力具有抗性表明該椎間盤成熟。在另一個實施方案中，本發明提供了對于壓力具 有抗性表明該椎間盤獲得拉伸性質。在另一個實施方案中，本發明提供了在第8周證實椎 間盤組織最大厚度和壓力抗性。在另一個實施方案中，本發明提供了在第9周證實椎間盤 組織最大厚度和壓力抗性。在另一個實施方案中，本發明提供了在第10周證實椎間盤組織最大厚度和壓力抗性。在另一個實施方案中，本發明提供了全部椎間盤置換方法。在另一個實施方案中，本發明提供了部分椎間盤置換方法。在另一個實施方案中，部分椎間盤置換方法包括置換 髓核。在另一個實施方案中，本發明提供了通過10_25mm椎旁切口以最小微創方式除去 破裂的椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了通過10-20mm椎旁切口以最小微創方 式除去破裂的椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了通過15-18mm椎旁切口以最小 微創方式除去破裂的椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了通過16-20mm椎旁切口 以最小微創方式除去破裂的椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了將預先制備的支架插入椎間盤間隙中。在另 一個實施方案中，本發明提供了將預先制備的包含膠原的支架插入椎間盤間隙中。在另一 個實施方案中，本發明提供了將預先制備的支架插入椎間盤間隙中且膨脹充填該間隙。在另一實施方案中，接受者接受本發明的椎間盤置換裝置。在另一實施方案中，接 受者接受本發明的髓核細胞。在另一實施方案中，接受者接受局部麻醉。在另一實施方案 中，接受者接受全身麻醉。在另一實施方案中，精確的麻醉方案由本領域技術人員確定。在另一實施方案中，損壞的椎間盤通過本領域技術人員已知的方法從接受者體內 除去。在另一個實施方案中，本發明的椎間盤置換裝置代替損壞的椎間盤。在另一個實施 方案中，預處理的本發明的椎間盤支架代替損壞的椎間盤。在另一個實施方案中，包含膠原 的預處理的本發明的椎間盤支架代替損壞的椎間盤。在另一個實施方案中，包含本發明各 型膠原的預處理的本發明的椎間盤支架代替損壞的椎間盤。在另一個實施方案中，包含各 種ECM成分的預處理的本發明的椎間盤支架代替損壞的椎間盤。在另一個實施方案中，在將本發明的椎間盤支架通過手術置于受體中之后，將髓 核細胞給予該椎間盤支架。在另一個實施方案中，術語“髓核細胞”包含椎間盤干細胞、椎 間盤祖細胞或者其組合。在另一個實施方案中，通過鈍端針頭給予髓核細胞。在另一個實 施方案中，通過套管給予髓核細胞。在另一個實施方案中，壓迫髓核細胞通過纖維環。在另 一個實施方案中，髓核細胞通過插入椎間盤前面或后面的針頭給予。在另一個實施方案中， 本領域技術人員認識到可以在透視指導(fluourscopic guidance)下將針頭經皮插入椎間 盤側面以及經腹腔鏡插入椎間盤前面。在另一個實施方案中，本發明的髓核細胞加入患者的髓核中。在另一個實施方案 中，使用標準技術除去患者的椎間盤。在另一個實施方案中，可以使用標準酶促技術除去患 者的椎間盤。在另一個實施方案中，可以使用木瓜凝乳蛋白酶除去患者的椎間盤。在另一 個實施方案中，可以借助于激光除去患者的椎間盤。在另一個實施方案中，可以借助于抽吸 裝置除去患者的椎間盤。在另一個實施方案中，可以借助于剃刀除去患者的椎間盤。在另 一個實施方案中，可以借助于任何其它可用的手術器械除去患者的椎間盤。在另一個實施 方案中，如果除去髓核，纖維環開口必須較小，且緊鄰切口端。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的治療物質。在另一個實施方案 中，在移植的椎間盤支架中加入額外的治療物質。在另一個實施方案中，在移植的本發明的 椎間盤置換裝置中加入額外的治療物質。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的可再吸收的培養基。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的組織生長或因子。在另一個實施方案中，在移植的 髓核中加入額外的組織分化因子。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的重組 產生的形態發生蛋白。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的PDGF。在另一個 實施方案中，在移植的髓核中加入額外的TGF-β。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加 入額外的EGF/TGF-α。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的IGF-I。在另一 個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的FGF。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加 入額外的水凝膠。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的不可再吸收的合成或 天然聚合物。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的膠原。在另一個實施方案 中，在移植的髓核中加入額外的纖維蛋白。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外 的聚乙醇酸。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的聚四氟乙烯。在另一個實 施方案中，在移植的髓核中加入額外的抗生素。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入 額外的抗炎藥物。在另一個實施方案中，在移植的髓核中加入額外的免疫抑制藥物。 在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的可再吸收的培養基。在 另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的組織生長或因子。在另一個實施方 案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的組織分化因子。在另一個實施方案中，在移植的 椎間盤支架中加入額外的重組產生的形態發生蛋白。在另一個實施方案中，在移植的椎 間盤支架中加入額外的PDGF。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的 TGF-β。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的EGF/TGF-α。在另一個 實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的IGF-I。在另一個實施方案中，在移植的椎 間盤支架中加入額外的FGF。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的水凝 膠。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的不可再吸收的合成或天然聚 合物。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的膠原。在另一個實施方案 中，在移植的椎間盤支架中加入額外的纖維蛋白。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支 架中加入額外的聚乙醇酸。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的聚四 氟乙烯。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的抗生素。在另一個實施 方案中，在移植的椎間盤支架中加入額外的抗炎藥物。在另一個實施方案中，在移植的椎間 盤支架中加入額外的免疫抑制藥物。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的可再吸收的培養 基。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的組織生長因子。在另一個 實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的組織分化因子。在另一個實施方案中， 在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的重組產生的形態發生蛋白。在另一個實施方案中， 在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的PDGF。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換 裝置中加入額外的TGF-β。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的 EGF/TGF-α。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的IGF-I。在另一 個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的FGF。在另一個實施方案中，在移植 的椎間盤置換裝置中加入額外的水凝膠。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置 中加入額外的不可再吸收的合成或天然聚合物。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置 換裝置中加入額外的膠原。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的 纖維蛋白。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的聚乙醇酸。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的聚四氟乙烯。在另一個實施方案 中，在移植的椎間盤置換裝置中加入額外的抗生素。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤 置換裝置中加入額外的抗炎藥物。在另一個實施方案中，在移植的椎間盤置換裝置中加入 額外的免疫抑制藥物。
在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖 細胞或者其混合物中加入額外的可再吸收的培養基。在另一個實施方案中，在本發明的 移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的組織生長 因子。在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖 細胞或者其混合物中加入額外的組織分化因子。在另一個實施方案中，在本發明的移植 的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的重組產生的形 態發生蛋白。在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎 間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的PDGF。在另一個實施方案中，在本發明的移植的 discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的TGF-β。在另一個 實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物 中加入額外的EGF/TGF-α。在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤 干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的IGF-I。在另一個實施方案中，在本發明 的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的FGF。在 另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其 混合物中加入額外的水凝膠。在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間 盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的不可再吸收的合成或天然聚合物。在 另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其 混合物中加入額外的膠原。在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間 盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的纖維蛋白。在另一個實施方案中，在 本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的 聚乙醇酸。在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤 祖細胞或者其混合物中加入額外的聚四氟乙烯。在另一個實施方案中，在本發明的移植的 discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的抗生素。在另一個 實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物 中加入額外的抗炎藥物。在另一個實施方案中，在本發明的移植的discosphere、椎間盤干 細胞、椎間盤祖細胞或者其混合物中加入額外的免疫抑制藥物。在另一個實施方案中，將具有關鍵營養素的基質配制的椎間盤干細胞制備物 (matrix formulated disc stem cell preparation) SMiiIifS] fS]PlCΦ
時間后生長為椎間盤組織結構，從而恢復損壞的椎間盤(實施例4)。在另一個實施方案中， 基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含可再吸收的培養基。在另一個實施方案中，基 質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含組織生長因子。在另一個實施方案中，基質配制 的椎間盤干細胞制備物進一步包含組織分化因子。在另一個實施方案中，基質配制的椎間 盤干細胞制備物進一步包含重組產生的形態發生蛋白。在另一個實施方案中，基質配制的 椎間盤干細胞制備物進一步包含PDGF。在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制 備物進一步包含TGF-β。在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含EGF/TGF-α。在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含IGF-I。 在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含FGF。在另一個實施方案 中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含水凝膠。在另一個實施方案中，基質配制的 椎間盤干細胞制備物進一步包含不可再吸收的合成或天然聚合物。在另一個實施方案中， 基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含膠原。在另一個實施方案中，基質配制的椎間 盤干細胞制備物進一步包含纖維蛋白。在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制 備物進一步包含聚乙醇酸。在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步 包含聚四氟乙烯。在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含抗炎 藥物。在另一個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含抗生素。在另一 個實施方案中，基質配制的椎間盤干細胞制備物進一步包含免疫抑制藥物。 在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有椎間盤脫出癥的對象的方法，包括 給予對象包含髓核細胞的人工椎間盤。在另一個實施方案中，所述對象是人。在另一個實 施方案中，所述對象是家畜。在另一個實施方案中，所述動物是寵物。在另一個實施方案中，本發明提供了給予對象人工椎間盤，包括為對象移植人工 椎間盤。在另一個實施方案中，本發明提供了包含來自一個供體的經處理的生物學組織的 置換裝置。在另一個實施方案中，本發明提供了包含來自是需要人工椎間盤的患者的一個 供體的經處理的生物學組織的置換裝置。在另一個實施方案中，本發明提供了包含經處理 的生物學組織組合人工材料的置換裝置。在另一個實施方案中，本發明提供了包含經處理 的生物學組織組合基于塑料材料的置換裝置。在另一個實施方案中，本發明提供了包含經 處理的生物學組織組合陶瓷的置換裝置。在另一個實施方案中，本發明提供了包含經處理 的生物學組織組合金屬的置換裝置。在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有椎間盤脫出癥的對象的方法。在另 一個實施方案中，本發明提供了治療患有椎間盤退行性疾病(DDD)的對象的方法。在另一 個實施方案中，本發明提供了治療在一個腰椎(L3-S1)具有DDD的對象的方法。在另一個 實施方案中，本發明提供了治療不超過1度脊椎前移的對象的方法。在另一個實施方案中， 本發明提供了治療超過1度脊椎前移的對象的方法。在另一個實施方案中，本發明提供了 治療不超過1度脊椎前移的對象的方法，該患者在非手術治療至少6該月后具有不緩解的 疼痛。在另一個實施方案中，本發明提供了給予對象恢復椎間盤高度的人工椎間盤。在 另一個實施方案中，本發明提供了給予對象可以減輕疼痛的人工椎間盤。在另一個實施方 案中，本發明提供了給予對象在植入之處恢復運動水平的人工椎間盤。在另一個實施方案 中，本發明提供了在椎間盤切除術后進行后外側部分纖維環切除術(armulotomy)。實驗詳述部分材料和方法用于擴增椎間盤干細胞/祖細胞形成discosphere的基于甲基纖維素的培養基擴增包含椎間盤干細胞/祖細胞的discosphere的基于甲基纖維素的培養基含有 基本的DMEM/F12培養基，補加了 2 %甲基纖維素、10 μ g/ml胰島素、40nM孕酮、200 μ M腐 胺、100 μ g/ml運鐵蛋白、60nM亞硒酸鈉、10ng/ml重組FGK，以及10ng/ml重組EGF。 用于擴增包含椎間盤干細胞/祖細胞的discosphere的基于甲基纖維素的培養基
用于擴增包含椎間盤干細胞/祖細胞discosphere的基于甲基纖維素的培養基含 有基本的DMEM/F12培養基，補加了 0. 8 %甲基纖維素、5 μ g/ml胰島素、20nM孕酮、100 μ M 腐胺、50μ g/ml運鐵蛋白和30ηΜ亞硒酸鈉。每3天加入10ng/ml FGF2和10ng/ml EGFb0組織化學 蘇木精_伊紅染代如下所述對得自通過實施例3所述方法產生的椎間盤的活檢組織進行蘇木精-伊 紅染色將福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片(5μπι)相繼去石蠟及再水合。然后將玻片 用Harris'蘇木精染色10分鐘、并在流動的自來水中洗滌及藍化1分鐘，在酸性乙醇(1% 鹽酸于70%乙醇中)中分化10秒鐘，在流動的自來水中洗滌及藍化5分鐘，用伊紅染色4 分鐘，最后在自來水中洗滌，通過梯度乙醇脫水及用二甲苯中透明。von Kossa 染餼如下所述對得自通過實施例3所述方法產生的椎間盤的活檢組織進行von Kossa 染色將福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片(5μπι)相繼去石蠟及再水合。將切片與 硝酸銀溶液在置于紫外光下的透明玻璃科普林缸(coplin jar)中保溫20分鐘。然后將切 片在蒸餾水中漂洗幾次，隨后用5%硫代硫酸鈉處理5分鐘以除去未反應的銀。然后將切片 在蒸餾水中漂洗幾次，用核固紅(nuclear fast red)復染5分鐘。最后，將切片在蒸餾水 中漂洗幾次，通過梯度乙醇脫水及用二甲苯透明。會目織中ι型膠原、π型膠原或者Ki67m^mum^mw如下所述在得自實施例3的椎間盤活檢組織上進行I型膠原、II型膠原或者 Ki67免疫組織化學染色。對福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片(5μπι)相繼脫蠟、再水 合以及封閉內源過氧化物酶活性，之后在Trilogy unmaskingsolution(Cell Marque, Hot Springs AR)中在95°C抗原提取25分鐘。將玻片用生物素封閉、血清封閉及使用山羊ABC Elite 試劑盒(Vector Labs, Burlingame, CA)免疫染色。I 型膠原的抗體(cat. # :63170， MP Biomedicals, Solon, OH)、II 型膠原的抗體(cat. # :MAB 1330，Chemicon, Billerica, MA)或者 Ki67 的抗體(cat. # :MAB4062，Chemicon, Billerica, MA)以 1 : 100 稀釋度在室 溫使用1小時。陽性染色使用DAB(3，3' -Diaminobenzidene)檢測。使用Bio-Rad共聚焦 顯微鏡觀測免疫反應性，并且將圖像收集在計算機上以進行后續分析。對軟骨的Safranin 0染代這種方法用于檢測福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片上的軟骨。軟骨被染成橙 色至紅色，核被染成黑色。背景被染成綠色。從兩個原液中制備Weigert' s鐵蘇木精溶 液。原液A :lg蘇木精，100ml 95%乙醇。原液B :4ml 29%于水中氯化鐵，95ml蒸餾水，Iml 鹽酸。混合等份原液獲得Weigert' s鐵蘇木精溶液。混合0. Ig Safranin 0，C. I. 50240 與 IOOrnl 蒸餾水制備 0. 1% Safranin 0 溶液。 然后將玻片脫蠟及與蒸餾水水合，隨后用Weigert' s鐵蘇木精工作溶液染色10分鐘。隨 后將玻片用流動的自來水漂洗10分鐘，及用快綠(FCF)溶液染色5分鐘，用乙酸溶液迅 速漂洗10秒鐘，以及在0. Safranin 0溶液中染色5分鐘。然后將玻片用95%乙醇、無 水乙醇和二甲苯脫水及透明，每種試劑更換2次，每次2分鐘。最后用樹脂封固玻片。實施例1 生長DISCOSPHERE的方法 將人髓核活檢組織樣品切成大小為大約2_3mm的碎片，移至50mlfalCOn管中，該管中含有30ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，補加標準抗生素和抗真菌劑(標準青霉素/鏈霉素溶液(GIBCO BRL)，濃度 1 100)。抽取PBS并將30ml Dulbecco' s改良的Eagle培養基與含有300U/ml膠原酶II溶液的F12(DMEM/F12)培養基加入該50ml試管中。將該試管以水平位置置于搖床中，在37°C以100RPM保溫2_3小時直至片段完全解罔。將該細胞懸浮液通過尼龍網過濾進50ml falcon管中，用fire-polished巴斯德移液管粉碎以形成單細胞懸浮液。在該點進行細胞計數儀確定細胞濃度。然后將細胞懸浮液在室溫以400g離心4分鐘，隨后通過抽吸除去上清。將細胞重懸于DMEM/F12培養基中，該培養基中補加了胰島素(10yg/ml)、孕酮(40nM)、腐胺(200 μ M)、運鐵蛋白(100 μ g/ml)、亞硒酸鈉(60nM)，終密度為120，000個細胞 /ml。向細胞懸浮液中加入等于先前獲得的最終體積的在DMEM/F12培養基中的2%甲基纖維素溶液，并渦旋混合。加入生長因子EGF和FGF2至終濃度為lOng/ml，再次混合。最后，將細胞/培養基懸浮液以大約2ml/孔加入6孔平板中，每孔包含大約 120，000個細胞，在37°C在5% CO2條件下保溫。每個孔預先用抗粘附物質(例如聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯(#P-3932 Sigma)抗粘附涂層)根據廠商建議進行包被。每3天加入一次生長因子。大約2周后，在培養物中形成discosphere。實施例2 擴增DISCOSPHERE細胞培養物的方法將通過實施例1所述方法獲得的discosphere通過在補加膠原酶II (300U/ml)的DMEM/F12培養基中在37°C保溫進行解離。將解離的細胞在6孔平板中擴增，通過使用如實施例1所述相同鋪板和培養技術 傳代細胞進行。實施例3 獲得椎丨旬盤膠Jj!支奧(鄉千維環)的方法通過解剖取出死尸(兔尸體)椎間盤，椎骨終板保持完整。將該椎間盤樣品在室溫浸于4M異硫氰酸胍中24小時以除去椎間盤內生物材料。24小時后，椎間盤內生物材料液化。抽吸該液體，將剩余的椎間盤支架用室溫PBS洗滌3次。在此階段，椎間盤支架可以貯存在4°C PBS中直至一年。實施例4 獲得人工椎間盤的方法將通過實施例3所述方法獲得的椎間盤支架置于組織培養皿中，用具有10% FCS的DMEM/F12培養基洗滌3次，并在37°C在5% CO2條件下保溫8小時。從培養物中集合discosphere并收集在DMEM/F12中。然后用DMEM/F12洗滌該discosphere至沒有甲基纖維素，將其懸浮于200 μ 1DMEM/F12培養基中。將懸浮的discosphere注射進在37°C、5% CO2條件下保溫8小時的支架中心。然后將該椎間盤組織培養容器填充DMEM/F12培養基，在37°C、5% CO2條件下保溫。每3天更換一次培養基。
MS從患者供體收集髓核細胞，如實施例1所述制備單細胞懸浮液。大約2周后，收集 discosphere并準備注射進預處理的兔纖維環中。然后將這個含有椎間盤干細胞的椎間盤 支架置于組織培養容器中培養3個月。每3天更換一次培養基。每天在每個椎間盤組織中 施加向下壓力以誘導生物力學調節的分化程序。牛物力學件質椎間盤細胞使椎間盤的胞外基質成分下沉(laid down)，其轉而形成適合椎間盤隨后的生理學和生物力學功能的形狀。在第3周，椎間盤組織開始證實對于壓力的抗性，表 明其成熟及獲得可拉伸性質。在第10周，椎間盤組織證實最大厚度和壓力抗性。比較組織學在培養3個月后，從培養物中取出椎間盤組織，用低溫恒溫器切片。使用選擇的組 織染色和免疫組織化學方法完成基本的組織學分析。如圖1示出(1組)，蘇木精-伊紅染色表明從椎間盤干細胞中生長的人椎間盤組 織的大體結構和細胞形態學與得自健康兔椎間盤組織的椎間盤組織的結構和形態相似。此 夕卜，safranin染色(圖1，2組)證實豐富的硫酸蛋白聚糖軟骨基質由椎間盤干細胞分泌進 胞外基質中，并且與分析時健康兔椎間盤組織相似。Von Kossa染色(圖1，3組)證實在這 個培養系統中體外椎間盤干細胞無任何成骨性分化。最后，用II型膠原(圖2)和I型膠 原(圖3)進行的免疫組織化學染色證實分別為高和低表達，表明該椎間盤組織的成熟，且 再次發現與健康對照組相似。組織中缺乏增殖的證實為了進一步表明該椎間盤組織是成熟的且因此不含有任何不成熟和/或增殖細 胞，對該組織進行Ki67(增殖標記物)免疫染色。如圖4所示，在對照組織或者在從人椎間 盤干細胞中生長的椎間盤組織中均無增殖細胞。
權利要求
分離的椎間盤干細胞群。
2.權利要求1的分離的椎間盤干細胞群，其中所述椎間盤干細胞群是人椎間盤干細胞群。
3.權利要求1的分離的椎間盤干細胞群，其中所述椎間盤干細胞群得自對象的髓核。
4.分離椎間盤干細胞的方法，所述方法包括如下步驟(a)將髓核細胞鋪板于無血清培養基中；(b)產生包含髓核細胞的discosphere； 從而分離椎間盤干細胞。
5.權利要求4的方法，其中所述discosphere包含人髓核細胞。
6.權利要求4的方法，其中產生所述discosphere的步驟包括使髓核細胞在無血清培 養基中的培養物生長的步驟。
7.權利要求6的方法，其中所述培養基進一步包含？6 2丄6 、50 、11^-6、11^-236 -3、 LIF，或者其組合。
8.權利要求6的方法，其中使所述髓核細胞培養物生長的步驟包括將髓核細胞以低于 1 X IO6個細胞/ml的密度鋪板。
9.權利要求6的方法，其中使所述髓核培養物生長的步驟包括使未附著的髓核細胞生 長的步驟。
10.包含富集的椎間盤干細胞群的組合物。
11.權利要求10的組合物，其中所述椎間盤干細胞是人椎間盤干細胞。
12.權利要求10的組合物，其中所述椎間盤干細胞得自對象的髓核。
13.權利要求10的組合物，其中所述組合物進一步包含椎間盤祖細胞。
14.權利要求10的組合物，其中所述組合物進一步包含培養基。
15.權利要求14的組合物，其中所述培養基是無血清培養基。
16.權利要求15的組合物，其中所述培養基進一步包含FGF2、EGF、SCF、IL_6、IL-2、 TGF-β、LIF，或者其組合。
17.分離的discosphere。
18.權利要求17的分離的discosphere，其中所述discosphere包含椎間盤干細胞。
19.權利要求17的分離的discosphere，其中所述discosphere包含椎間盤祖細胞。
20.權禾Ij要求17的分離的discosphere，其中所述discosphere是人discosphere。
21.產生discosphere的方法，包括使髓核細胞在無血清培養基中的培養物生長的步 驟，從而產生discosphere。
22.權利要求21的組合物，其中所述髓核細胞是人髓核細胞。
23.權利要求21的組合物，其中所述discosphere包含源自單一椎間盤干細胞的細胞。
24.權利要求21的組合物，其中所述discosphere包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞， 或者其混合物。
25.權利要求21的方法，其中所述培養基進一步包含FGF2、EGF、SCF、IL_6、IL-2、 TGF-β、LIF，或者其組合。
26.權利要求21的方法，其中使所述髓核細胞的培養物生長的步驟包括將所述髓核細 胞以低于IXlO6個細胞/ml的密度鋪板的步驟。
27.權利要求24的方法，其中使所述髓核細胞的培養物生長的步驟包括使未附著的髓 核細胞生長。
28.包含discosphere的組合物。
29.權利要求28的組合物，其中所述discosphere包含髓核細胞。
30.權利要求28的組合物，其中所述髓核細胞是人髓核細胞。
31.權利要求28的組合物，其中所述discosphere包含源自單一椎間盤干細胞的細胞。
32.權利要求28的組合物，其中所述discosphere包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞， 或者其混合物。
33.權利要求28的組合物，其中所述組合物進一步包含培養基。
34.權利要求33的組合物，其中所述培養基是無血清培養基。
35.權利要求34的組合物，其中所述培養基進一步包含FGF2、EGF、SCF、IL_6、IL-2、 TGF-β、LIF，或者其組合。
36.人工椎間盤，其包含髓核細胞。
37.權利要求36的人工椎間盤，其中所述椎間盤置換裝置進一步包含椎間盤支架。
38.權利要求43的如人工椎間盤，其中所述椎間盤支架是位于椎骨間的椎間盤支架。
39.權利要求37的人工椎間盤，其中所述椎間盤支架包含膠原。
40.權利要求36的人工椎間盤，其中所述髓核細胞是人髓核細胞。
41.權利要求36的人工椎間盤，其中所述髓核細胞包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞， 或者其混合物。
42.權利要求36的人工椎間盤，其中所述椎間盤置換裝置進一步包含培養基。
43.產生人工椎間盤的方法，包括使discosphere在椎間盤支架中生長的步驟，從而產 生脊椎椎間盤置換裝置。
44.權利要求43的方法，其中使所述discosphere在所述椎間盤支架中生長的步驟包 括將所述discosphere注射進所述椎間盤支架中的步驟。
45.權利要求44的方法，其中所述注射是注射至所述椎間盤支架的中心。
46.權利要求43的方法，其中所述椎間盤支架是椎間盤支架。
47.權利要求43的方法，其中所述椎間盤支架包含膠原。
48.權利要求43的方法，其中所述discosphere包含得自對象的髓核細胞。
49.權利要求43的方法，其中所述discosphere包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞，或 者其混合物。
50.治療患有椎間盤脫出癥對象的方法，包括給予所述對象包含髓核細胞的人工椎間 盤，從而治療患有椎間盤脫出癥的對象。
51.權利要求50的方法，其中所述椎間盤置換裝置包含椎間盤支架。
52.權利要求50的方法，其中所述椎間盤支架是椎間盤支架。
53.權利要求50的方法，其中所述椎間盤支架包含膠原。
54.權利要求50的方法，其中所述髓核細胞是人髓核細胞。
55.權利要求50的方法，其中所述髓核細胞包含椎間盤干細胞、椎間盤祖細胞，或者其 組合物。
全文摘要
本發明提供了分離的椎間盤干細胞群、組合物以及獲得并使其生長的方法。此外，本發明提供了分離的discosphere、組合物以及獲得并使其生長的方法。本發明提供含有本發明細胞的人工椎間盤以及生產其的方法。本發明也提供了利用本發明的細胞和方法治療患有椎間盤脫出的對象的方法。
文檔編號C12N5/077GK101802175SQ200880106682
公開日2010年8月11日 申請日期2008年7月7日 優先權日2007年7月12日
發明者C·丁奇, T·伊甘托娃, V·屈克考夫 申請人:迪斯克基因公司