專利名稱：：人卵巢癌腫瘤標志物he4酶聯免疫診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程及疾病檢測診斷試劑方法
技術領域：
，特別是HE4基因合成、載體構建、蛋白表達及純化，HE4用于ELISA試劑盒及其制法。
背景技術：
：卵巢癌發病隱匿，預后差，是女性最致命的惡性腫瘤之一。如果能在早期診斷卵巢癌將大大提高治愈率，但是卵巢癌患者發現時往往已經到了晚期。目前診斷卵巢癌和監測其復發最為敏感的指標是檢測血清CA125。晚期卵巢癌患者中有80。/。能檢測到CA125的升高，而在早期僅有50~60%，并且CA125在某些良性疾病中也會上升，導致一些不必要的手術，大大限制了它的臨床應用。于是，許多學者都致力于尋找更為有效的腫瘤標記物，以便早日確診卵巢癌。人附睪分泌蛋白4(humanepididymisprotein4,HE4)最早在人的附睪上皮細胞中發現。1999年，Schummer等發現HE4的mRNA在卵巢癌組織中高表達，而在正常組織中低表達或不表達。2003年，Hellstrom等發現HE4在卵巢癌患者的血清中的含量也比正常人有明顯增高。因而，HE4作為一個新的卵巢癌的腫瘤標志物，得到了人們更加深入的研究。Hellstrom等人證實，在特異性為100%的情況下，HE4檢測卵巢癌的靈敏度為60%，而經典卵巢癌腫瘤標記物CA125的靈敏度僅為13%，而且HE4檢測早期卵巢癌的敏感性也明顯優于CA125。為進一步證實和擴展HE4在卵巢癌的早期檢測和病程監控方面的應用前景，在美國已有近十項臨床研究和臨床試驗正在進行。
發明內容本發明的目的是提供一種HE4基因合成方法、蛋白表達，合成簡單，產品純度高，另外還提供人卵巢癌腫瘤標記物HE4的ELISA試劑盒制備方法，為卵巢癌早期診斷、療效觀察及預后判斷提供一種簡便快捷、經濟可靠的檢測方法。本發明所采用的技術方案是HE4基因合成根據Genbank中公布的人HE4的基因序列并結合大腸桿菌偏愛密碼子設計并合成八條PCR引物，通過重疊PCR方法獲得HE4基因。所述HE4蛋白表達將合成獲得的HE4基因克隆入pGEX-4Tl載體中，在大腸桿菌中表達并純化出重組GST-HE4蛋白。經凝血酶切割并純化得到HE4蛋白純品。所述試劑盒的制法純化HE4蛋白免疫新西蘭兔，制備并純化多克隆抗體，用純化HE4蛋白免疫小鼠，通過細胞融合獲得雜交瘤細胞株，以此雜交瘤細胞免疫小鼠，制備腹水，腹水中抗體經純化后用辣根過氧化物酶標記，以多克隆抗體作為捕獲抗體，以酶標記單克隆抗體作為檢測抗體，建立檢測人HE4雙抗體夾心ELISA的試劑盒。目前國內尚無HE4檢測試劑盒生產，本發明所研制的試劑盒可望替代進口同類產品，為國家節省大量外匯，可使我國卵巢癌的診斷檢測技術達到世界先進水平。本試劑盒具有高度穩定性、敏感性及特異性，操作簡單、快速，適合于卵巢癌的早期、快速診斷。較國外同類產品相比成本便宜，性價比高。圖1是本試劑盒的制備工藝流程圖。圖2是經重疊PCR獲得的HE4基因DNA片段及重組載體pGEX-4Tl-HE4的雙酶切鑒定結果圖。其中，1:HE4基因的PCR結果；2:MarkerDL2000;3:MarkerDL2000;4:pGEX-4Tl-HE4雙酶切結果。圖3是GST-HE4融合蛋白IPTG誘導表達的SDS-PAGE電泳(12%)，酶切后HE4蛋白的純化結果及免疫印跡鑒定結果圖。其中，1:pGEX-4Tl空載體誘導結果；2:pGEX-4Tl-HE4未誘導對照；3:pGEX-4Tl-HE4誘導結果；4:蛋白Marker;5:蛋白Marker;6:GST-HE4融合蛋白酶切去除GST后的純化結果；7:蛋白Marker;8:酶切并純化后HE4蛋白的免疫印跡結果。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動都將落入本發明的權利要求范圍之內。實施例l:HE4基因的構建、蛋白表達、純化及鑒定1.HE4基因的擴增根據Genbank中所提供的人HE4mRNA序列(NM一006103)，去除N末端30個信號肽，根據大腸桿菌偏愛密碼子，設計合成了8個引物，分別命名為P1P8，引物由大連寶生物公司合成。P1P8核苷酸序列組成Pl:tggttgtgctactttttgttctttacctaatgataaagaaggttcttgtcP2:ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatcaP3:tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttP4:ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaatP5:ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgatP6:caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttgP7:cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtaP8:ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgacaa在P7和P8引物的5'端分別引入BamHI和XhoI酶切位點，重疊PCR方法全人工合成HE4基因。第一輪反應將P1和P2配對，生成產物P12，第二輪PCR以P12作為模板，P3和P4作為引物生成產物P34，第三輪PCR以P34作為模板，P5和P6作為引物生成產物P56，第四輪PCR以P56作為模板，P7和P8作為引物生成HE4基因。PCR反應按常規方法進行，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。結果應用重疊PCR拼接方法，成功獲得了HE4基因，片段長度與預期一致。HE4基因核苷酸序列1gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt61tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt121ctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta181gtttatgtcgtgatca^tgtcaagttgattctcaatgtcctggtcaaatgaaatgttgt241cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt2822.pGEX-4Tl-HE4表達載體的構建載體pGEX-4Tl以及經瓊脂糖凝膠純化后的HE4基因片段，用BamHI和Xhol雙酶切處理，酶切產物經瓊脂糖凝膠純化后連接，得到重組質粒pGEX-4Tl-HE4，重組質粒經雙酶切鑒定，同時由大連寶生物公司測序。將重組質粒pGEX-4Tl-HE4轉化大腸桿菌，得到pGEX-4Tl-HE4的重組克隆菌落。結果，成功獲得了重組質粒pGEX-4Tl-HE4，酶切鑒定結果如圖2所示。重組質粒的測序結果經計算機分析，表明重組的HE4片段與設計序列完全一致。3.GST-HE4融合蛋白的表達pGEX-4Tl-HE4的重組克隆菌落在含100pg/ml氨芐青霉素的LB培養基中培養，A綱達到0.5左右時，加入IPTG誘導，IPTG終濃度為0.5mmol/L，誘導時間為3h，誘導溫度為37'C，收集菌體后取少量樣品經12%SDS-PAGE電泳觀察。結果，pGEX-4Tl-HE4的重組克隆菌誘導表達產物經12%SDS-PAGE電泳確定，表達的融合蛋白分子量約為37kD(圖3)。將該融合蛋白命名為GST-HE4。4.GST-HE4融合蛋白表達形式的分析誘導后的細菌4n，8000rpm離心10min，收集菌體，PBS洗滌一次，8000rpm離心10min，濕菌用PBS重懸，置于冰浴中，超聲破菌，12000rpm離心20min，上清和沉淀分別進行12%SDS-PAGE電泳。結果，12%SDS-PAGE電泳結果顯示，GST-HE4融合蛋白為胞漿可溶性表達。5.GST-HE4融合蛋白的純化和定量收集誘導后的細菌，PBS洗滌一次，濕菌沉淀用PBS重懸，置于冰浴中，超聲破碎，12000rpm離心20min，上清為待純化的蛋白樣品。將GST-SepharoseTM填料裝于純化柱中，將純化柱與Akta純化儀連接，用PBS緩沖液(按照說明書提供的方法配制)平衡5個柱體積，待純化的蛋白樣品以1.5ml/min速度上樣，上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用蛋白洗脫緩沖液洗脫，收集蛋白峰，洗脫液在PBS中4'C透析過夜，取小樣12%SDS-PAGE電泳分析純化效果。透析后的純化蛋白用Bradford法測定蛋白濃度。結果，GST-HE4融合蛋白經GST親和純化后，SDS-PAGE電泳顯示，在分子量37kD左右有單一條帶，與預期值相符，凝膠薄層掃描顯示蛋白純度達90%以上，Bradford法測定蛋白濃度為2mg/ml。6.GST-HE4融合蛋白的酶切與純化按10U/mg的濃度向純化的GST-HE4融合蛋白中加入凝血酶，22。C酶切16h，經GlutathioneSepharose4B瓊脂糖凝膠柱純化，收集流出液，流出液進一步純化去除其中的凝血酶，得到高純度的HE4蛋白，取小量樣品用12%SDS-PAGE進行電泳分析。結果，酶切后得到高純度的HE4蛋白，分子量10kD左右(圖2)，Bradford法測定蛋白濃度為lmg/ml。7.酶切后HE4蛋白的免疫印跡鑒定參照《分子克隆》中所述方法進行。電轉移條件為100V電泳lh，封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST，一抗為商品化的鼠抗人HE4的單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體，通過ECL顯色系統進行免疫印跡分析。結果，酶切后的HE4蛋白能與鼠抗人HE4的單克隆抗體發生免疫反應(圖3)。實施例2:兔抗人HE4多克隆抗體的制備1.動物免疫取純化后的HE4蛋白500^(約500嗎)，與等量弗氏完全佐劑充分乳化，采用背部皮下多點免疫法免疫新西蘭大耳白兔，以后隔兩周免疫一次，蛋白免疫劑量為300嗎，佐劑為弗氏不完全佐劑，全程共免疫4次，末次免疫后七天兔耳緣靜脈采血。間接ELISA方法測定抗體效價后，頸動脈放血，收集血清，-20。C凍存。2.兔抗人HE4多克隆抗體的純化及效價鑒定采用ProteinG親和層析純化兔血清，血清用結合緩沖液(20mM的磷酸鈉)按一定比例稀釋，上樣后用結合緩沖液洗5~10個柱體積，之后用洗脫緩沖液(O.lM的甘氨酸pH2.53.0)洗脫，收集洗脫峰，迅速向每毫升收集的洗脫液中加入100pl的1M的Tris-HCl(pH9.0)，以使抗體處于中性環境。收集的洗脫液在PBS中4"透析過夜。經ProteinG純化的兔抗人HE4多克隆抗體再采用偶聯有HE4蛋白的溴化氰活化的瓊脂糖(CNBr-activedsepharose4B)柱純化，間接ELISA方法檢測純化前后抗體效價(包被抗原為純化的HE4蛋白)，紫外分光光度計測定抗體濃度，抗體經0.22pm濾膜過濾除菌后，-70°(:保存。結果，間接ELISA檢測顯示，血清純化前效價為l:128萬，純化后效價為h64萬，表明獲得了高效價的兔抗人HE4多克隆抗體，抗體濃度為lmg/ml。實施例3:鼠抗人HE4單克隆抗體的制備1.動物免疫取純化的HE4蛋白300(al(約300嗎)與等量弗氏完全佐劑充分乳化，背部皮下多點注射BALB/c小鼠，共免疫3只小鼠，每只小鼠免疫抗原劑量為100pg，兩周后每只小鼠以50ng抗原劑量加等量弗氏不完全佐劑充分乳化后背部皮下多點注射，以后隔兩周免疫一次，每只小鼠免疫劑量為50嗎，不用佐劑，免疫途徑為腹腔注射，從第二次免疫開始，每次免疫后的第七天尾靜脈采集小鼠血，間接ELISA方法檢測血清效價(包被抗原為純化的HE4蛋白)，效價達到1:50000以上后準備融合，融合前3天，尾靜脈注射加強免疫一次，抗原劑量50^g。2.雜交瘤細胞株的建立2.1細胞融合免疫小鼠經眼球放血后，無菌摘取小鼠的脾臟，分離脾細胞，經臺盼蘭染色計數，取約"108個脾細胞，約3xlO"個SP2/0骨髓瘤細胞，將兩種細胞混合于50ml無菌離心管中，1200rpm離心5min，棄上清，輕彈管底，使沉淀細胞松散成均勻糊狀。于37"C水浴中，一手輕輕轉動離心管，另一手用滴管在1min內勻速緩慢滴入1ml50%PEG4000，然后依次在1min內勻速滴入1mlRPMI-1640無血清培養基，2min內勻速滴入2mlRPMI-1640無血清培養基，5min內勻速滴入10mlRPMI-1640無血清培養基。細胞懸液于800rpm離心8min，棄上清，用HAT選擇培養重懸浮并混勻。將細胞懸液加入96孔細胞培養板中，100pl/孔，于37°C，含5%C02的細胞培養箱中培養。第10天換HT選擇培養基，第14天換含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基。結果，細胞融合后第7天可見融合的細胞克隆，融合率達90%以上。2.2陽性克隆的篩選與克隆化細胞融合后23周，當雜交瘤細胞長至孔底面積1/5以上時，用純化的HE4蛋白作為檢測抗原，通過間接ELISA方法進行篩選，篩選出能與HE4蛋白反應的雜交瘤細胞(以與陰性血清A450的比值大于2.1判為陽性)，用有限稀釋法連續亞克隆3次(第1次亞克隆用HT選擇培養液，第2和第3次改用普通RPMI-1640完全培養基)，每次亞克隆后7-10天進行篩選，直至單克隆細胞陽性孔率為100%時，挑取單克隆進行擴大培養后液氮凍存。結果，共獲得3株能穩定分泌抗人HE4蛋白的雜交瘤細胞株，分別命名為Hl、B6禾卩F4。2.3單抗亞型的鑒定應用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(購自Hycultbiotechnology公司)鑒定單抗亞型，按操作說明將三株雜交瘤上清分別用PBS(pH7.4)適當稀釋，至抗體濃度1-50pg/ml，加500^試劑盒中提供的稀釋液至含一條k型試紙條的檢測管中，再加500pl稀釋好的待檢樣品至檢測管中，將試紙條完全浸入并輕輕攪動，再向檢測管中加入lml試劑盒中提供的RAM-kappa，使試紙條打印面朝下，室溫振蕩30min左右，觀察結果。結果，三株雜交瘤上清的單抗亞型均鑒定為IgGl類，輕鏈亞型均為k鏈。3.腹水制備與純化弗氏不完全佐劑致敏BALB/c小鼠，500pl/只。致敏一周后腹腔注射雜交瘤細胞懸液(選擇H1雜交瘤細胞株，細胞數5xl06~lxl07)，710天后采集小鼠腹水，12000rpm,離心5min收集上清。二氧化硅吸附法對腹水進行預處理，采用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法進行純化將預處理過的腹水與醋酸緩沖液(0.06mol/L,pH5.0)按體積比1:2混合，用1mol/L的HC1調pH至4.8;按每毫升混合液加11^辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30min內加完，4°C靜置2h，12000rpm離心30min，上清經125pm尼龍篩過濾后加入1/10體積的PBS，用1mol/L的NaOH調pH至7.2;在4匸下加入飽和硫酸銨，靜置1h;12000rpm離心30min，棄上清，沉淀溶于適量PBS(含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA)中，用100倍以上體積的PBS，4"C透析過夜，最后12000rpm離心30min，收集上清，紫外分光光度計測定純化后單克隆抗體含量，0.22pl濾膜過濾后于-70。C保存。結果，紫外分光光度計測定抗體濃度為15mg/ml。4.純化后鼠抗人HE4單克隆抗體的間接ELISA鑒定以純化的HE4蛋白作為檢測抗原，將純化后的小鼠腹水倍比稀釋，以1:200稀釋的正常小鼠血清作為陰性對照，應用間接ELISA方法檢測，以與陰性血清的比值大于2.1判段為陽性，計算單抗效價。結果，純化的小鼠腹水的效價達到1:256000。5.辣根過氧化物酶標記純化的單克隆抗體用過碘酸鹽氧化法獲得酶標二抗溶解5mg辣根過氧化物酶于1.2ml超純水中，加入新配制的0.1mol/L的過碘酸鈉0.3ml,室溫靜置20min，將上述溶液在1mmol/L的醋酸鈉中4。C透析24h，期間每4h更換透析液。用0.02mol/L的碳酸鈉溶液制備單抗樣品至10mg/ml，將0.5ml制備好的抗體溶液加入經透析的辣根過氧化物酶溶液中，室溫靜置2h，在混合液中加入100pl硼氫化鈉(4mg/ml的水溶液)，4'C反應2h，向混合液中加入等體積的飽和硫酸銨，4°。反應30min后12000rpm離心15min，棄上清，沉淀溶于1ml的PBS中，在PBS中透析過夜，次日12000rpm離心15min后取上清加入等體積的甘油，分裝后-70'C保存。取少量酶標二抗，用純化的HE4作為包被抗原，間接ELISA方法檢測。結果，經間接ELISA方法檢測酶標單抗可在1:10000稀釋下獲得良好的檢測效果。實施例4:人卵巢癌腫瘤標志物HE4雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立1.檢測方法在本實施例中，應用實施例2中獲得的兔抗人HE4多克隆抗體為捕獲抗體，以實施例3中獲得的辣根過氧化物酶標記的鼠抗人HE4單克隆抗體作為檢測抗體，建立檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4的多抗和單抗雙抗體夾心ELISA方法。2.酶標板包被用包被液(0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，pH9.6)將兔抗人HE4多克隆抗體稀釋成10pg/ml，混勻，96孔酶標板中每孔加入100pl稀釋好的多抗溶液，將酶標板密封于4t:過夜。3.酶標板封閉用含有3%魚明膠和5%蔗糖的PBS作為封閉液。將包被過夜的酶標板拍干，每孔加入200pl封閉液，37'C封閉lh，用洗板液(TBST)洗板3次后將酶標板拍干。酶標板干燥后密封入裝有干燥劑的金屬箔袋內，4"C保存。4.被檢血清的處理被檢血清用樣品稀釋液(含1%BSA和0.05%吐溫-20的PBS)做適當比例的稀釋。100^1/孔，37"C反應lh后用洗板液洗板3次后將酶標板拍干。5.酶標二抗的處理酶標二抗保存于含50%甘油的PBS中，用pH7.2的PBS做1:10000稀釋后使用，現用現配。100pl/L，37'C反應30min后用洗板液洗板3次后將酶標板拍干。6.顯色和終止用TMB顯色系統進行顯色。顯色液配制A液(0.05mol/L的檸檬酸，0.1mol/L的磷酸氫二鈉)6ml+B液(含2mg/mlTMB的無水乙醇中)0.3ml+C液(0.75%H202)20^1，現用現配，50(!l/孔，37"C避光反應15min，之后加入2M的硫酸，50pl/孔。7.檢測結果本實驗結果以ELISA實驗的A45o值表示。8.對照陰性對照孔的檢測樣品為不加血清的樣品稀釋液，純化好的HE4蛋白作為陽性標準品。實施例5:人卵巢癌腫瘤標志物HE4雙抗體夾心ELISA試劑盒的組成1.ELISA板已包被好純化的兔抗人HE4多克隆抗體并已進行了封閉。2.待檢樣品稀釋液含l。/。BSA和0.05。/c)吐溫-20的PBS。3.酶標二抗:辣根過氧化物酶標記的鼠抗人HE4單克隆抗體，保存于含50%甘油的PBS。4.酶標二抗稀釋液pH7.2的PBS5.10x洗板液0.2mol/L的Tris-HCl，1.5mol/L的NaCl，0.5%的吐溫漏206.顯色液A液為0.05mol/L的檸檬酸和0.1mol/L的磷酸氫二鈉，B液為含2mg/mlTMB的無水乙醇，C液為0.75%H202。7.終止液2M的硫酸。8.陽性標準品純化的HE4蛋白。實施例6:人卵巢癌腫瘤標志物HE4雙抗體夾心ELISA試劑盒的實驗性能1.試劑盒的檢測區間取包被好兔抗人HE4多克隆抗體并已進行了封閉的酶標板，每個樣品做三復孔，加入用樣品稀釋液梯度稀釋的HE4蛋白標準品，100pl/L，37"C反應1h，洗板液洗板3次，將酶標板拍干，加入l:10000稀釋的酶標二抗，100^1/孔，37"C反應30min，洗板液洗板3次，將酶標板拍干，加入顯色液50|il/L37°C避光反應15min，之后加入2M的硫酸，50pl/孔。酶標儀檢測A45Q，以不同濃度的HE4標準品蛋白為橫坐標，以相應的A^值為縱坐標，繪制標準曲線。結果，本試劑盒具有良好線性關系的檢測區間為15pM~900pM，如果被檢血清的HE4濃度高于次測量范圍，則應使用樣品稀釋液稀釋樣品后再檢測。2.試劑盒的精密度采用4份人血清標本進行測試，每份標本復孔檢測，在20天內每天不同時間內進行2次檢測。本檢測試劑盒精密度的總CV值〈10n/。，此項研究的數據結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.試劑盒的檢測限檢測限代表區別于零濃度的可檢測到的HE4抗原的最低濃度。采用不含HE4蛋白的樣品稀釋液和4份來源于健康人的血清，后者用樣品稀釋液稀釋至5pM，在兩個獨立日內進行4次檢測，每次重復24次檢測。結果，本試劑盒的檢測限〈5pM。4.試劑盒的回收率將己知濃度的HE4蛋白加入到正常人血清標本中，對標本進行稀釋，測定HE4的濃度。％回收率=測得的HE4濃度(pM)/(內源性HE4濃度(pM)+加入的HE4濃度(pM))*100%。計算本試劑盒的回收率為(100±15)%，此項研究的數據結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>5.試劑盒的應用實例使用本試劑盒共檢測了65例女性血清中HE4的含量，其中健康者20例,術前經確診為卵巢癌患者45例。在本研究中，95。/。的健康女性個體的HE4檢測值位于或低于150pM，而卵巢癌患者血清中，HE4含量顯著升高，95.6%達到300pM以上，本檢測結果與臨床資料有很高程度的一致性，與國內外相關文獻的報道相符。SEQUENCELISTING<110>大連美億德生物科技有限公司<120>人卵巢癌腫瘤標志物HE4酶聯免疫診斷試劑盒<130>AnovelmultiplemarkerbioassayutilizingHE4andCA125forthepredictionofovariancancerinpatientswithapelvicmass<160>10<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物PI<400>1tggttgtgctac臓gttctttacctaatgataaagaaggttcttgtc50<210>2<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物P2<400>2ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatca50<210>3<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物P3<400>3tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctacttt<210>4<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物P4<400>4ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaat<210>5<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物P5<400>5ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgat<210>6<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物P6<400>6caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttg<210>7<211>54<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物P7<400>7cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgta54<210>8<211>61<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成HE4引物P8<400>8ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgaca60361<210>9<211>282<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據大腸桿菌偏愛密碼子人工合成引物后，采用重疊PCR法拼接的HE4基因序列<400>9gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt60tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt120tctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta180ggtttatgtcgtgatcaatgtcaagttgattctcaatgtcctggtcaaatgaaatgttgt240cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt282<210>10<211>94<212>PRT<213>human<300><301>Hellstrom，I.，Raycraft,J.，Hayden-Ledbetter，M.，Ledbetter,J.A.,Schummer,M,McIntosh,M.，Drescher，C.,Urban，N.andHellstrom,K.E.<302>TheHE4(WFDC2)proteinisabiomarkerforovariancarcinoma<303>CancerRes.63(13),3695-3700(2003)<304>63<305>13<306>3695-3700<307>2003-07-01<308>AA052683<309>2005-04-14<313>(31)..(124)<400>10GluLysThrGlyValCysProGluLeuGinAlaAspGinAsnCysThr151015GinGluCysValSerAspSerGluCysAlaAspAsnLeuLysCysCys202530SerAlaGlyCysAlaThrPheCysSerLeuProAsnAspLysGluGly354045SerCysProGinValAsnlieAsnPheProGinLeuGlyLeuCysArg505560AspGinCysGinValAspSerGinCysProGlyGinMetLysCysCys65707580ArgAsnGlyCysGlyLysValSerCysValThrProAsnPhe8590權利要求1、一組HE4基因合成引物，其特征是根據GenBank中人HE4基因序列并結合大腸桿菌偏愛密碼子設計并合成PCR引物，PCR引物核苷酸序列組成P1tggttgtgctactttttgttctttacctaatgataaagaaggttcttgtcP2ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatcaP3tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttP4ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaatP5ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgatP6caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttgP7cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtaP8ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgacaa。2、人工合成的HE4基因，其特征是根據權利要求1設計的引物，通過重疊PCR方法獲得HE4基因，基因序列如下1gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt61tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt121tctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta181ggtttatgtcgtgatcaatgtcaag11ga11ctcaatgtcctggtcaaatgaaatg11gt241cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt282。3、HE4蛋白表達，其特征是根據權利要求2所述基因，將合成獲得的HE4基因通過BamHI和XhoI酶切位點克隆入pGEX-4Tl載體中，在大腸桿菌中表達并純化出重組GST-HE4蛋白。經凝血酶切割并純化得到HE4蛋白純品，其氨基酸序列組成EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPNDKEGSCPQVNINFP()LGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF。4、HE4ELISA檢測試劑盒，其制備方法是用含權利要求3所述的蛋白質HE4免疫動物獲得多克隆抗體和單克隆抗體，以此多克隆抗體作為捕獲抗體，以單克隆抗體作為檢測抗體，裝配成雙抗體夾心ELISA方法檢測試劑盒。5、權利要求4所述的試劑盒，其特征是它可用于人卵巢癌的輔助診斷。特別是對卵巢癌患者的早期輔助診斷。全文摘要本發明公開了一種人卵巢癌腫瘤標志物HE4酶聯免疫診斷試劑盒，其制備方法及用途。通過合成的HE4基因引物，采用重疊PCR方法全人工合成HE4基因；將該基因構建到pGEX-4T1表達載體中并進行蛋白表達；表達的HE4融合蛋白經酶切純化后得到HE4純品，并以此免疫動物，獲得多克隆抗體及單克隆抗體；用兔抗人HE4多克隆抗體包被ELISA板并進行封閉，以此兔多克隆抗體為捕獲抗體，以辣根過氧化物酶標記的鼠抗人HE4單克隆抗體為檢測抗體，裝配成檢測HE4的雙抗體夾心ELISA試劑盒。本試劑盒特點在于檢測靈敏度高、特異性強，適于卵巢癌的早期診斷，為卵巢癌病人療效觀察及預后判斷提供一種簡便快捷、經濟可靠的檢測方法。文檔編號C12N15/11GK101525614SQ200910011148公開日2009年9月9日申請日期2009年4月13日優先權日2009年4月13日發明者吳芬芳,李慶偉,王克威,王華穎,陳立勇申請人:大連美億德生物科技有限公司