一種檢測癌癥標志物微小核糖核酸的試劑盒的制作方法
【專利說明】
[0001]技術領域本發明涉及脫氧核糖核酸(簡稱DNA)循環放大技術，具體地說是利用四螺旋結構DNA的循環放大技術對癌癥標志物微小核糖核酸(以下簡稱MicroRNA)和癌細胞內MicroRNA進行表面增強拉曼散射(SERS)識別和免疫檢測的試劑盒及測試方法。
[0002]【背景技術】MicroRNA是動物和植物中普遍存在的一類最小的功能性編碼RNA，內生的、長度約為20-24個核苷酸的單鏈小分子，其在細胞內具有多種重要的調節作用。它對于深入探討疾病發生機制及疾病診斷、基因治療藥物的開發都具有重大意義。MicroRNA研究連續被《Science》雜志評為年度十大科技之一、年度重大突破。MicroRNA通過基因沉默機制，調控細胞的增殖、發育、分化及凋亡等關鍵的生命過程，同時細胞內microRNA的表達水平與人類重大疾病，尤其是癌癥，密切相關。因此，對動物和人體內MicroRNA的檢測在癌癥診斷中起著非常重要的作用。
[0003]癌癥早期患者血清中腫瘤標志物MicroRNA濃度僅為10 11 Μ - 10 15 Μ，目前的臨床免疫測定法能測定的最低濃度僅為10 12 Μ，無法滿足現代醫學早期診斷的要求。目前科研工作者重點研發了基于熒光、電化學和表面等離子共振的生物傳感器，已經取得了一些的進展。而SERS檢測技術以高靈敏度、光譜選擇性、測定快、數據準確、靈敏度高等特點成為癌癥疾病分析檢測的一個非常有前景的研究領域。此外，表面增強拉曼檢測技術具有制樣簡單、非入侵和無損等獨特的優點。拉曼信號分子標記物不會自猝滅和光漂白，這樣就可以通過增加探針上染料分子的個數和提高光譜累積時間來增強拉曼信號，提高檢測的靈敏度。SERS檢測手段具有背景低、有效避免光致褪色、有效增強分子的拉曼強度、靈敏度高的優勢，越來越受到了科學界的關注，在癌癥疾病分析檢測領域中具有很好的應用潛力。
[0004]作為一種納米級別的分子，DNA以其自身的可編程性、結構的多樣性和變化的可控性等諸多優點而活躍于納米科學、生物科學和材料科學。利用堿基的精確配對和序列可設計的特性，可以設計具有信號放大功能的DNA循環網絡，將DNA循環放大方法引入試劑盒生物傳感分析中，具有消耗樣品量少、快速、靈敏的優勢，近年來被廣泛應用于DNA、細胞、生物分子和胚胎的檢測。將DNA反應設計成可以自發循環的過程，從而能夠將檢測信號的放大，有效提高了對目標物的檢測限，同時減少對被樣品的消耗量。因此，選擇設計合適的信號探針、循環放大反應、信號源是關鍵。自從2000年發現癌癥疾病MicroRNA突變以來，對體內MicroRNA的檢測在不斷的開展，并取得了一定的進展。然而，操作簡單、特異性好、靈敏性高地檢測體內MicroRNA的方法一直是人們所關注并不斷追求的。
[0005]本發明的試劑盒設計成以癌癥標志物MicroRNA的適體識別引發，通過與四螺旋結構DNA的雜交以及DNA剪切-聚合反應循環實現對SERS檢測信號的放大，進而實現對癌癥標志物MicroRNA及癌細胞內MicroRNA高靈敏和高特異選擇性的識別和檢測。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種檢測癌癥標志物MicroRNA及癌細胞內MicroRNA的試劑盒，該試劑盒操作程序簡單、靈敏度高、特異選擇性好，可大大地減少假陽性的誤診，適用于各種動物和人體內的MicroRNA的快速檢測。
[0007]本發明中試劑盒的組成為:四螺旋結構DNA分子探針、聚合酶、切刻內切酶、緩沖液，SERS信號探針。
[0008]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:1.合成四螺旋結構DNA分子探針:它包含三個功能部分:負載特殊設計的目標物識別區域，引發循環放大反應的觸發區域，聚合-剪切放大反應的模板區域。設計三條DNA序列(序列一、二、三)，序列一為含有MicroRNA的雜交互補DNA序列；序列二為與序列三部分互補的序列，為聚合-剪切放大反應的模板；序列三為一端修飾氨基，使其共軛連接在羧基修飾的磁珠上，并且其序列部分可以與序列一和序列二互補；三條DNA序列通過雜交結合在一起，并通過序列三上的氨基與羧基修飾的磁珠結合從而形成四螺旋結構DNA分子探針。
[0009]2.SERS信號探針:設計了兩條DNA序列(序列四、五)，序列四為一端修飾巰基基團，用來連接金納米粒子；序列五為一端修飾巰基基團，另一端修飾羅丹明基團(R0X)，連接在金納米粒子上用作SERS檢測信號。適量配比的序列四和序列五連接在金納米粒子上組成了 SERS信號探針。
[0010]3.MicroRNA檢測:把癌癥標志物MicroRNA (或癌細胞粉碎后提取的MicroRNA)和引物1加入到上述合成的探針中，首先MicroRNA通過與四螺旋結構DNA分子探針1上的互補DNA雜交引發，導致四螺旋探針1的構型發生變化，四螺旋結構DNA分子探針的部分序列片段被暴露出來；通過引物，在聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸(以下簡稱dNTPs)作用下引發DNA聚合反應，反應延伸的新鏈將MicroRNA與序列一雜交的復合體以及序列二替換下來，釋放到溶液中；在引物2、聚合酶和dNTPs作用下引發第二個聚合反應，此時MicroRNA被釋放下來，可以形成一個DNA循環反應。被替換下來的序列二遇到切刻內切酶、聚合酶和dNTPs,生成大量的DNA-a可以進入下一個反應形成一個循環。DNA-a與連接磁珠的發夾DNA發生雜交反應，導致發夾結構構型變化，形成雙鏈DNA-b并暴露出可以結合SERS信號探針的序列片段，產生放大的檢測信號。
[0011]4.SERS強度測試:通過磁性分離，去除反應后的上清液，得到連有SERS信號探針的磁珠進行SERS測試。
[0012]本發明的主要創新性和優越性為:1.本發明采用四螺旋結構DNA分子探針為識別探針，采用“二步法”，實驗操作簡單。
[0013]2.本發明以特定DNA序列的四螺旋結構分子為識別探針，可以高特異選擇性的檢測癌癥標志物MicroRNA和癌細胞內MicroRNA。
[0014]3.通過兩個DNA循環放大SERS信號，可以高靈敏的檢測癌癥標志物MicroRNA和癌細胞內MicroRNA。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發明所使用的四螺旋結構DNA分子探針。
[0016]圖2為本發明用于SERS檢測癌癥標志物MicroRNA和癌細胞內MicroRNA的示意圖。<