專利名稱：殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因，屬于應用環境微生物領域，用于農作物、 土壤、水體中殺菌劑百菌清殘留的去除，保護環境。
二背景技術：
農藥的使用雖然提高了農業的生產效率及作物產量，但同時帶來嚴重的環境問題， 造成生態失衡農產品品質下降，并直接影響人民的身體健康。百菌清是四氯代苯腈殺菌 劑，在農業和家庭防腐方面使用了 30多年，是美國第二大類殺菌劑，每年使用量在5 千萬頓以上。中國年產百菌清殺菌劑8000頓。百菌清對魚類，鳥類和水生無脊椎動物 高毒，在美國是被人為的潛在致癌物。隨著近些年來環境保護的呼聲越來越高，農藥使 用帶來的環境問題日益引起人們的重視。百菌清在土壤中半衰期約6個月，是中等持久 性污染物。由于百菌清殺菌劑的大量使用，在蔬菜、地下水和土壤中殘留非常廣泛，造 成了嚴重的環境污染問題。隨著人類環保意識的增強，百菌清污染的修復引起了人們的 廣泛關注。微生物修復農藥污染的方法一種簡單、高效、廉價和無二次污染的方法，比 化學方法、物理方法修復農藥污染具有很多優勢。微生物在農藥殘留的生物學解決途徑 中有著獨特的作用。微生物降解修復農藥的本質是微生物產生的酶對農藥的降解作用， 從微生物中提取的降解酶系來消除農藥殘留在國外己有成功的先例，降解酶的來源可以 通過從降解菌中提取，也可以采用基因工程手段構建高效表達菌株來獲得。百菌清降解 基因的獲得在百菌清污染的修復領域有巨大的應用潛力。同時可通過基因改造擴大脫氯 酶的作用底物范圍，廣泛應用于環境中含氯芳香烴類污染物的脫氯降解去毒，保護環境。
三、
發明內容
技術問題
本發明的目的是提供殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因，屬于應用環境微生物領域，用 于農作物、土壤、水體中百菌清殘留的去除，保護環境。
技術方案
百菌清水解脫氯酶基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.l。該基因全長(從起始密碼 子到終止密碼子)為1029 bp， G+C含量為58.60/。，編碼342個氨基酸，其氨基酸序列 為SEQIDN0.2。
水解脫氯酶基因片段與酶切好的pET-29a(+)進行酶連獲得含百菌清水解脫氯酶基 因的PET-29a(+)重組質粒。
酶連好的含百菌清水解脫氯酶基因的pET-29a(+)重組質粒轉化到表達宿主菌 BL21(DE3)獲得重組微生物BL21(DE3)。
上述百菌清水解脫氯酶基因可以在農作物、土壤、水體的百菌清殘留去除方面得到 應用。其所涉及的百菌清水解脫氯酶可以在農作物、土壤、水體的百菌清殘留去除方面
3應用。 有益效果
1. 用鳥槍法成功的從假單胞菌CTN-3 (尸w"ifomo"a;y sp. CTN-3，從百菌清污染土壤中 分離篩選獲得的百菌清降解菌株，其16SrDNA序列的genbank登錄號為FJ598329)中
克隆出百菌清水解脫氯酶基因。
2. 該基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為1029 bp, G+C含量為58.6M，編碼 342個氨基酸。
3. 通過PCR技術擴增末端含Mfel和J^oI酶切位點的完整的百菌清水解脫氯酶基因片 段，將它連接到大腸桿菌高表達載體pET-29a(+)(購自Novegen公司)的iVAI和J^01 酶切位點上，轉化表達宿主菌BL21(DE3)(購自invitrogen公司)，進行IPTG誘導表達。
4. 本發明對百菌清水解脫氯酶基因表達的產物，做了酶活性測定，能高效的降解百菌 清，對20mg/L的百菌清在36h內能完全降解。
5. 利用該基因構建的工程菌株能高效表達百菌清水解脫氯酶(活性水解脫氯酶蛋白的 含量占細胞總蛋白含量的28%)，生產的酶制劑可用于土壤、水體和農作物殘留的百菌 清的去除。
四
圖1百菌清水解脫氯酶基因克隆的策略圖
圖2百菌清水解脫氯酶基因在BL21 (pET-29a(+))中高效表達實驗方案圖
五具體實施例方式
1.百菌清水解脫氯酶基因的克隆
1.1細菌基因組總DNA的提取
假單胞菌CTN-3 (尸WMJomowfl;ysp.CTN-3，從百菌清污染土壤中分離篩選獲得的百 菌清降解菌株，其16S rDNA序列的genbank登錄號為FJ598329)大量培養后，采用 CTAB法提取高純度、大片段的假單胞菌CTN-3的基因組總DNA，溶于TE (pH8.0)中， 置于-2(TC保藏，具體方法參考F，奧斯伯等編的《精編分子生物學實驗指南》。
L2pUC118(BflmHI)購買于寶生物工程(大連)有限公司。
1.3總DNA的酶切
假單胞菌尸WMcfo附omw sp. CTN-3總DNA采用Sa"3AI部分酶切。
1.4 DNA的回收
酶切后的總DNA通過電泳(TAE緩沖液)進行純化，采用axygen biosciences(China) 回收試劑盒進行回收，回收的DNA溶于10 mmol/L的Tris，Cl (pH8.0)中，置于-2(TC保藏。 1.5酶連
建立如下反應體系
pUC118(5a附HI) 0.1嗎總DNA片段 0.1 pg
10x連接酶緩沖液 1 pi
T4DNA連接酶 0.5 pl
加雙蒸水至 10 pi 16'C溫育12小時。
1.6制備大腸桿菌DH5a高效感受態細胞
具體方法參照F.奧斯伯等編的《精編分子生物學實驗指南》P22-23。 1.7轉化
取10 pl酶連產物轉化200 pl感受態細胞，具體方法參照F.奧斯伯等編的《精編分 子生物學實驗指南》P23。涂布含有100mg/kg的百菌清農藥(丙酮溶解成的5，000mg/L 的母液)，100mg/kg氨芐青霉素的LB平板，培養24h候挑取有透明水解圈的菌落， 即是含百菌清水解脫氯酶基因的陽性克隆。 1.8基因核苷酸序列測定
上海英駿生物技術有限公司有限公司進行序列測定，百菌清水解脫氯酶基因的核苷 酸序列為SEQIDNO.l，根據百菌清水解脫氯酶基因核苷酸序列所推到的342個氨基酸 序列為SEQIDN0.2。
2.百菌清水解脫氯酶基因在BL21(pET-29a(+))中的高效表達 2.1百菌清水解脫氯酶基因的PCR擴增
以正向引物5，-GACATATGCCGCCTGGATGTTCCGG-3，和反向引物 5'-ATCTCGAGAGGCCTGGCTGCGAGAT -3，為引物，用PCR從假單胞菌iVwcfowoww sp. CTN-3中擴增出百菌清水解脫氯酶基因片段。
擴增體系
尸n'膨r加r酶(5U/ja1) 0.5 (xl
5 x PCR Buffer II (Mg2+Plus) 10 ^
dNTP Mixture(各2.5mM) 5 pl
模板DNA 10ng
引物1 (20pM) 1^1
引物2 (20pM) 1^1 滅菌蒸餾水 至 50nl PCR擴增程序 a.95°C變性3min
b. 95。C變性1.5min， 53。C退火0.5 min， 72。C延伸1.5 min，進行25個循環
c. 72。C延伸10min，冷卻到室溫。 2.2 PCR產物用MM和^ol雙酶切。
酶切體系
5廳I 1 pi
勘I 1 pi
DNA 51嗎
滅菌的蒸熘水加至 20^1 在37。C水浴中，反應3h以上。 酶切產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。 2.3 pET-29a(+)用M/d和屈ol雙酶切(參考2.2)。 2.4轉化和表達
2.2中的回收片段和2.3中酶切好的pET-29a(+)進行酶連(參考1.5)。酶連好的含百 菌清水解脫氯酶基因的pET-29a(+)重組質粒轉化到表達宿主菌BL21(DE3)獲得重組微 生物BL21(DE3)。涂布含有100mg/kg百菌清、50 mg/kg卡那霉素和24 mg/kg IPTG的 平板，挑取有透明水解圈的陽性轉化子。 2.5驗證陽性轉化子表達的酶對百菌清的降解功能
陽性轉化子在LB培養基中培養至OD,0.6-0.8之間，加IPTG至濃度1 mM， 30°C 培養6h。在100 ml基礎鹽培養基(1.5 g K2HP04, 0.5 g KH2P04， 0.2 g MgS04.7H20， 1.0 g NaCl， 1.0 g(NH4)2SO4，1.0g每L)中加入20mg/L百菌清，1%接種量接入陽性轉化子培養液，30°C 振蕩培養36h。
用6ml二氯甲烷分兩次全量提取4ml的培養液，用氣相色譜檢測降解效果，檢測 條件如下ECD檢測器，OV-225 (30mx250pmx0.25^im);進樣口溫度，210° C;柱溫， 190°C; 檢測器溫度，250° C;氣體流速，N2 40mL/min。對20 mg/L百菌清能完全降 解。序列表
南京農業大學
殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因 說明書 4
Patentln version 3.1 1
1029 DNA
Pseudomonas sp. CTN-3
百菌清水解脫氯酶基因 (l)..(腳)
<120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223>
<400> 1
atgccgcctg gatgttccgg gctttgtagc tttgtaggat tgacgatgcc actcaagttt 60
tcgggcgtgc tctgcgccag cctcctgacc atcacccttt cggtagccgc gcatgcaacc 120
gaactcatct tggacttcaa caaggtgcag atgcgcagcc aacaactcgc acctggggtg 180
tacgcgcatc taccggcaga ctccgccgag ctgaatgcaa aaggcggtgt agcaggcacc 240
agcggtggct tgatcgtcgg gacacgtggc gcgatgctga tcgagaccat gcteaaccgt 300
cgccttttcg atcaggtcca agcactcgcc aaaaaggagg cattggggct gccgctgctg 360
tacgcagtca acaccagtta tcatggcgat cactcgtatg ggaacatgta cctgaaggcg 420
ccgacgcgtg tcatecaaag caccaaaacg cgtgattatg tcgatggtca cctcgccgac 480
gacaaggcat tcatggtgaa gaatttcggt gccgggcgcg gtgttgagca gatcacggca 540
aggacgggcg acatcctcgt gcctccggga ggtcgcgtga gcgtcgacct tggcggcaag 600
actgttgaga tcatcgactt cgggttcgca cagaccggcg gggacctgtt cgtctgggag 660
ccgcaatcea aagttatgtg gacaggcaac gcagtggtcg ccagcaagcc agctctacct 720
tggctgctcg atggcaagct ggtagagacg ttggcgacgc tacagaaagt ctacgatttt 780
ctaccgcctg atgccaccat cgtccctgga catggtgtac ccatggcccg cgaaggcctg 840
cgctggcatc tggactacct cgcagecgtg caagcaggcg tcaaggatgc tttggctcgc 900
aaactgagcc tcgaacagac agtgaccgaa ctcaagatgc cggagttccg cggctacgta 960
ctgttcgact gggttcatcc agatctcaac gtccccgctg cttacaagga tctegcagcc 1020
aggccttga 1029
<210> 2
<211> 342
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. CTN-3 <220>
<221>推測的百菌清水解脫氯酶的氨基酸序列
<222> (1)..(342)
<223>nsi J3S nsi sXi 3jy biv ns"[可v ds v s^i !b八v ul￡) 1ba bjv
08Z
biv nsi jX丄dsv nsq s!h dj丄&v nsq々o Siy v cxij jb八 OZZ 09Z
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乙<00fr>
雖〃9憲法能改
6 y69ss00i600s290 295 300
Glu Gin Thr Val Thr Glu Leu Lys Met Pro Glu Phe Arg Gly Tyr Val 305 310 315 320
Leu Phe Asp Trp Val His Pro Asp Leu Asn Val Pro Ala Ala Tyr Lys
325 330 335
Asp Leu Ala Ala Arg Pro 340
<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>百菌清水解脫氯酶基因的PCR擴增正向引物 <222> (1)..(25) <223>
<400> 3
gacatatgcc gcctggatgt tccgg
<210> 4
<211> 25
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>百菌清水解脫氯酶基因的PCR擴增反向引物
<222> (1)..(25) <223>
<400> 4
atctcgagag gcctggctgc gagat
25
25
9
權利要求
1.百菌清水解脫氯酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2. 權利要求1所述的百菌清水解脫氯酶基因核苷酸序列所推導的百菌清水解脫氯酶蛋 白質,其氨基酸序列為SEQIDN0.2。
3. 含權利要求1所述百菌清水解脫氯酶基因的pET-29a(+)重組質粒。
4. 含權利要求3所述的重組質粒的重組微生物BL21(DE3)。
5. 權利要求1所述百菌清水解脫氯酶基因在土壤、水體和農作物的百菌清殘留去除方 面的基因工程應用。
6. 權利要求2所述百菌清水解脫氯酶蛋白質在農作物、土壤、水體的百菌清殘留去除 方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因，屬于應用環境微生物領域。本發明提供了殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因及其所推導的水解脫氯酶蛋白質。該基因全長為1029bp，G+C含量為58.6％，編碼342個氨基酸，為新的脫氯酶基因資源。利用該基因構建的工程菌株能高效表達百菌清水解脫氯酶，能在36h內將20mg/L的百菌清完全降解，生產的酶制劑可用于土壤、水體和農作物上的百菌清殘留的去除。
文檔編號C12N15/54GK101649324SQ20091003369
公開日2010年2月17日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者榮 李, 李順鵬, 斌 梁, 王光利, 蔣建東 申請人:南京農業大學