專利名稱：一種高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種高產甲殼素脫乙酰酶的細菌及其應用。
背景技術：
甲殼素，又名甲殼質、殼多糖等，化學名為聚[(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-e-D-葡萄 糖]，是一種天然高分子多糖，但其溶解性能很差，因而其應用受到一定限制。殼聚糖 (chitosan)是甲殼素分子中的乙酰基被部分或全部脫除后的產物，其溶解性能得到很大改 善。殼聚糖在國內外的應用十分廣泛。目前已在食品、醫藥、化工、生物、紡織、環保、 功能材料等領域得到了廣泛應用。如在醫藥工業中可以制作人造皮膚、藥物載體等。在 輕紡工業中用作增染劑、固色劑等。在日用化學工業中可制作洗發香波等。在食品工業 中可作為酒類和飲料的澄清劑、食品添加劑；也可研制成為減肥功能食品等。在環境保 護方面可用作污水處理的絮凝劑等。此外，在制作功能材料方面，可制作超濾膜、反滲 透膜等；也可作為纖維材料、催化劑、酶和細胞的固定化載體等。甲殼素和殼聚糖由于 其天然無毒和在許多領域的廣泛用途，已引起許多國家的重視，現已成為最熱門的研究 領域之一。目前國內外生產殼聚糖主要采用濃堿法，但其制備工藝存在諸多問題，如 未除盡蛋白質及鈣鹽、脫已酰度低、粘度低、操作步驟多、生產周期長、原料和能量消耗 大、生產成本高等。目前，還有利用微波法制備殼聚糖，但是技術尚未成熟應用較少。
甲殼素脫乙酰酶(chitin deacetylase, E. C. 3. 5. 1. 41，以下簡稱CDA)是催化甲殼 素轉變為殼聚糖的重要生產酶。其通過催化N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脫去乙酰基將甲殼 素轉變為殼聚糖。1974年，Araki從真菌Mucorroxii培養液中獲得并部分純化。1982年， Kauss在植物病原體Colletotrichum lindemuthianum中也發現甲殼素脫乙酰酶，這 是首次報道從非接合菌類中分離得到該酶。甲殼素脫乙酰酶(chitindeacetylase，E.C. 3.5. 1.41)可替代現有的濃堿法生產高質量的殼聚糖，這不僅可以解決環境污染問題， 而且可以生產出用化學法較難得到的高質量的殼聚糖產品。因此，該酶具有重要的學術及 應用價值。
從甲殼素富集的土壤中分離篩選得到高產甲殼素脫乙酰酶菌株，對殼聚糖的生產具有 重要的意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的能產甲殼素脫乙酰酶 的微生物及其應用。
本發明要解決的另一個技術問題是篩選產甲殼素脫乙酰酶的方法，以及研究菌株csuft F14的生理生化特征。
一種高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14，保藏號為CCTCCM209062。
所述的高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14為革蘭氏陽性菌、具運動性、 兼性厭氧、菌體短桿狀、形成內生芽孢，芽孢卵圓形，孢囊膨大，游離芽孢表面著色弱， Gram染色陽性；在LB培養基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規則，在LB培 養基上不產色素，生長溫度為28 3(TC。
所述的解淀粉芽孢桿菌csuftF14還具有以下生理生化特征還原硝酸鹽；水解淀粉； 發酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖；接觸酶陽性；氧化酶陰性；硫化氫陽性； 酯酶陽性；乙酸氧化陰性。
所述的解淀粉芽孢桿菌csuft F14可用于制備生產殼聚糖的制劑。
本發明的產甲殼素脫乙酰酶菌株csuftF14不同于已有的普通解淀粉芽孢桿菌，具有產 甲殼素脫乙酰酶能力，且酶活高于一般的產甲殼素脫乙酰酶菌株，如構巢曲霉、毛霉、黑 曲霉等。與國內的產甲殼素脫乙酰酶微生物相比，該菌株培養條件簡單，繁殖快，容易保 存，易于工業化生產，具有良好的開發應用前景。
解淀粉芽孢桿菌(5ad腸腦少/。/—咖"'msO, csuftF14
保藏日期2009年03月26日
保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心
保藏單位簡稱CCTCC
保藏號CCTCCM 209062
圖1為csuft F14菌株產甲殼素脫乙酰酶的顯色作用圖2為csuft F14菌株顯微觀察圖3為csuft F14菌株相對酶活。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。 實施例l:本發明菌株的篩選方法1) 平板初篩
采用平板涂布法。稱取10g采自湘江河岸的土樣，傾入90mL含玻璃珠的無菌水中，充 分振蕩20min后，在無菌環境下，移取lmL梯度稀釋至10、音濃度，取lml，涂布于加入了 PDA培養基的培養皿中；同時取lml，涂布于加入了牛肉膏蛋白胨培養基的培養皿中。將 PDA培養基于26'C培養4d，牛肉膏蛋白胨培養基于3(TC培養2d，從培養基中挑取單菌落， 繼續純化，重復3次菌落特征一致，無異常菌落出現者，可認為是單菌落，即完全純化。 挑取最后一次純化的平板上的單一菌落接種到斜面培養基上培養保存，備用。
選取分離、純化后所得斜面菌種，在產甲殼素脫乙酰酶篩選培養基(培養基成分甲 殼素10%， NaNO30.2%， KH2PO40.1%， K2HPO40.1%， MgS04 7H20 0.05%， PN0.05%， 瓊脂2%)上進行培養。真菌培養4d，放線菌、細菌培養2d，取出觀察，根據產甲殼素脫乙 酰酶菌株周圍的顯色圈的深淺判斷菌株的產酶能力。篩選出甲殼素脫乙酰酶酶活力較高的 菌株9株。其中霉菌3株，放線菌2株，細菌4株。
2) 搖瓶復篩
平板初篩挑選出來的9株菌株進行搖瓶復篩，150ml三角瓶裝液發酵培養基(培養基成 分甲殼素(大于120目)1.5%, NaNO30.2%， K2HPO40.1%， KH2PO40.1%， MgSO40.05 %) 60ml， 30°C， 180rpm/min培養48h，用酶法測定濾液中的乙酸含量，通過測定乙酸含量的 高低反映酶活力。測得這9株菌株的甲殼素脫乙酰酶相對酶活力，見圖3， Z7菌株csuftF14 的相對酶活力最高。
試驗和觀察的結果如下
一、 本發明菌株csuftF14的形態特征
該菌株為菌體呈短桿狀，染色均勻，具運動性，兼性厭氧，可形成內生芽孢，芽孢 囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，Gram染色陽性。在LB培養基上呈白色不透明 菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規則，在多種培養基上均不產色素。
二、 本發明菌株csuftF14的生理生化特征
可利用還原硝酸鹽；水解淀粉；可發酵D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，D-木糖；接 觸酶陽性；氧化酶陰性；硫化氫陽性；酯酶陽性；乙酸氧化陰性。
三、 本發明菌株csuftF14的分子鑒定
PCR擴增和序列分析采用菌株基因組總DNA， 16SrDNA擴增采用引物F27、 1541(上 海生工合成)。PCR反應體系(25 U L): 10倍緩沖液2.5 u L， dNTP(各2.5mmo1 L")l u L,引 物各luL， Taq酶(5u' P !/1)0.25 ix L，模板DNA稀釋50倍后取2 U L(對照組加雙蒸水，其它條件同)，ddH20，18.25 u L。 PCR反應條件94。C預變性5min， 94。C變性30s， 55。C退火31min， 72。C延伸90s， 30個循環，最后72。C延伸10min， 4'C保存。
取4uLPCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增產物委托上海生工公司測序，所 測序列提交GenBank進行同源性比較，采用鄰接法構建出進化樹。
菌株csuft F14的16s rDNA間隔區序列與GenBank接收號為EU855192.1的解淀粉芽 孢桿菌5ac/〃w awy/o/;^e/acz'e"j的16S rDNA相似性為99%。
實施例2:本發明菌株的應用
將甲殼素加入發酵培養基(培養基成分甲殼素(大于120目)1.5%，豆餅粉2.0%， 玉米粉2%，葡萄糖2%， NaNO30.2%， K2HPO40.1%， KH2PO40.1%， MgSO40.05%)中， 36°C， 160rpm/min，培養2天，發酵液過濾后加入10%NaOH溶液，邊加邊攪拌，至pH 值10-11，出現白色絮狀沉淀，靜置后離心，將沉淀物用蒸餾水洗滌至pH值中性，離心， 收集沉淀物，烘干，即為殼聚糖制品。
權利要求
1、一種高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuft F14，其特征在于，所述的解淀粉芽孢桿菌csuft F14，保藏號為CCTCC M 209062。
2、 根據權利要求l所述的高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14，其特征在 于所述的解淀粉芽孢桿菌csuftF14為革蘭氏陽性菌、具運動性、兼性厭氧、菌體短桿狀、 形成內生芽孢，芽孢卵圓形，孢囊膨大，游離芽孢表面著色弱，Gram染色陽性；在LB培 養基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規則，在LB培養基上不產色素，生長溫 度為28 30。C。
3、 根據權利要求l所述的高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14，其特征在 于，所述的解淀粉芽孢桿菌CSuftF14具有以下生理生化特征還原硝酸鹽；水解淀粉；發 酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖；接觸酶陽性；氧化酶陰性；硫化氫陽性；酯 酶陽性；乙酸氧化陰性。
4、 權利要求l所述的高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14的應用，其特征 在于，所述的解淀粉芽孢桿菌csuftF14用于制備生產殼聚糖的制劑。
全文摘要
本發明公開了一種高產甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuft F14及其應用，該菌株保藏單位為CCTCC，保藏號為CCTCC M 209062。本發明的優點是用該菌株生產甲殼素脫乙酰酶，培養方法簡單，產酶活性高，有利于甲殼素脫乙酰酶的開發和利用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12P19/04GK101544958SQ20091004306
公開日2009年9月30日 申請日期2009年4月8日 優先權日2009年4月8日
發明者何苑皞, 劉君昂, 劉高強, 周國英, 宋光桃, 河 李, 琳 李, 章懷云 申請人:中南林業科技大學