專利名稱：生物轉化法生產脫氧腺苷的方法
技術領域：
本發明涉及生物轉化法生產脫氧腺苷的方法。
背景技術：
蔣忠良等報道了 2'-脫氧腺苷全合成研究(同濟大學學報自然科學版，2007， 35(9) : 1264-1268)，路有昌等報道了 2，-脫氧腺苷的合成(應用化工，2006， 35(7) : 564-565)，王曉萌等報道了 2，-脫氧腺苷相關中間體的合成路線研究(學 位論文)，河南師范大學和新鄉拓新生化科技有限公司等申請了化學合成法生產2 '-脫氧腺苷的工藝專利(中國專利200710053920. X)。以上文獻都是采用化學法 制備脫氧腺苷。如將6-氯腺嘌呤與l-乙酰基-3， 5-二(對甲基苯甲酰基)-2-脫氧核 糖和含有磷酸酚酯類化合物催化劑的有機溶劑放入反應釜中，在催化劑催化作用下 縮合反應制備3' 5' -二(對甲基苯甲酰基)-2'-脫氧-6-氯嘌呤核苷；再將化合物 和氨甲醇放入反應釜中氨解得到2'-脫氧腺苷。由于化學法生產脫氧腺苷條件苛刻， 大量使用有機溶劑，環境污染較嚴重，且生產成本高，工藝復雜。
目前，國內外對于生物轉化法生產脫氧腺苷的文獻報道較少。洪云海等報道了 應用乙酰短桿菌酶法合成2'-脫氧腺苷的方法(工業微生物，2006， 36(1): 30-33)， 他們以乙酰短桿菌為轉化菌，底物濃度為40mmol/L (10g/L)，轉化率約66%。 該方法中的底物腺嘌呤水溶性很低，使得底物與生物酶的有效接觸十分困難，嚴重 影響轉化反應的速率和產率；起催化作用的脫氧核糖轉移酶等為胞內酶，微生物細 胞膜的脂質雙層結構使底物進出微生物細胞很困難，反應速度和轉化率較低。
發明內容
本發明的目的是提供一種生物轉化法生產脫氧腺苷的方法。 本發明所提供的生產脫氧腺苷的方法，是將瑞士乳桿菌種子液接入發酵培養基 中發酵培養，得到粗菌體，將所述粗菌體破碎，制成細胞破碎液，向所述細胞破碎 液中加入脫氧胸苷和腺嘌呤進行酶促反應，獲得脫氧腺苷；所述腺嘌呤的粒度小于 等于10um。
其中，所述發酵培養基由下列重量份的物質組成葡萄糖10-20、蛋白胨l-5、 麩質粉10-25、檸檬酸胺1-2、磷酸氫二鉀1-2、硫酸鈉5-10、硫酸錳0.02-0. 4和水1000;所述酶促反應的溫度為35-5(TC，優選為40-50'C。
所述發酵培養基優選由下列重量份的物質組成葡萄糖15-20、蛋白胨4-5、
麩質粉20-25、檸檬酸胺2、磷酸氫二鉀2、硫酸鈉9、硫酸錳0.02和水1000。 所述發酵培養的溫度為30-42°C，優選為37-4CTC;攪拌轉速為120-160轉/分
鐘，優選140-160轉/分鐘；pH值為6.0-7.5，優選6.0-6. 5;發酵時間為24-36小時。
所述瑞士乳桿菌種子液與所述發酵培養基的體積比為10%-15%。
所述瑞士乳桿菌種子液是按照如下方法獲得將瑞士乳桿菌接種到斜面培養基 培養制成斜面菌種，將所述斜面菌種接入發酵培養基中培養獲得種子液；所述斜面 培養基由下列重量份的物質組成葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、擰檬 酸胺1-2、磷酸氫二鉀1-2、硫酸鈉5-10、硫酸錳0. 02-0. 4，瓊脂15-20和水1000。
所述斜面培養基優選由下列重量份的物質組成葡萄糖15-18、蛋白胨18、酵 母膏6-8、檸檬酸胺2、磷酸氫二鉀2、硫酸鈉8-9、硫酸錳0. 02，瓊脂20和水1000。
所述瑞士乳桿菌接種到斜面培養基培養的溫度為30-42。C，優選37-4(TC; pH 為6. 5-8. 0，培養24-48小時。
所述細胞破碎液按照如下方法制備將所述粗菌體用檸檬酸緩沖液洗滌，然后 用pH6.0-7.0磷酸緩沖液懸浮，獲得細胞懸浮液，超聲破碎所述細胞懸浮液，獲得 細胞破碎液。
所述檸檬酸緩沖液的P朋.0-7. 0，優選為p朋.5-7. 0。所述磷酸緩沖液的pH值 優選為6.0。所述細胞懸浮液中菌體的質量百分含量為15%_35%，優選為15%。
所述超聲條件為功率為300-400瓦，頻率為3-5次/10秒，時間為5-15分鐘。 本發明是生物轉化法生產脫氧腺苷，充分利用酶的高效性、專一性和溫和性， 與傳統化學合成方法相比，具有選擇性高、條件溫和、工藝簡單、成本低和污染小 等特點。
本發明的生物轉化法生產脫氧腺苷，所用菌株為瑞士乳桿菌，瑞士乳桿菌轉化 產物簡單，95%以上為脫氧腺苷，副產物極小；并采用氣流粉碎技術，將難溶于水 的腺嘌呤粉碎成粒度小于10ixm粒子，產品轉化率達到82%。通過大孔吸附樹脂分 離純化，純度可達到98%以上；同時通過細胞破碎技術，消除了瑞士乳桿菌壁膜的 阻礙作用，既提高轉化速率，又可以增加底物濃度。本發明的生物轉化法生產脫氧 腺苷，產量可達42g/L，脫氧胸苷轉化率可達82%。
具體實施例方式
下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑 獲得。
實施例1、生物轉化法生產脫氧腺苷
(1) 菌種斜面培養
將瑞士乳桿菌"acz^力aci72^力e2KeWcws JCGMCC 1.1877 (中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心)接種到斜面培養基，37°C、 pH值6.5，培養24 小時制成斜面菌種；斜面培養基由下列重量份的組分組成
葡萄糖18份、蛋白胨18份、酵母膏8份、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、 硫酸鈉9份、硫酸錳0.02份，瓊脂20份和水1000份。
(2) 接種發酵
將斜面菌株接入發酵培養基中擴大培養作為種子液；將種子液按10% (體積 百分比)的接種量接入裝有發酵培養基的發酵罐中37°C， 160轉/分鐘，pH值為 6.0，發酵36小時；發酵培養基由下列重量份的組分組成
葡萄糖20份、蛋白胨4份、麩質粉25份、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、 硫酸鈉9份、硫酸錳0. 02份和水1000份。
(3) 生產脫氧腺苷
a) 發酵液在4。C、 8000轉/分鐘、離心20分鐘，收集濕菌體；
b) 檸檬酸緩沖液(ra6.5)洗滌步驟a)菌體，4t:離心10分鐘，收集濕菌體， 稱重，用磷酸緩沖液(PH6.0)重懸菌體，制成15%(濕菌體重量和緩沖液的體積比) 的細胞懸浮液；
c) 步驟b)的細胞懸浮液置于冰浴中，超聲波破碎IO分鐘，超聲波功率為400 瓦，頻率為3次/10秒；
d) 向步驟c)的破碎液中加入底物混合后4(TC反應24小時，底物含有50g/L 脫氧胸苷和30g / L腺嘌呤，腺嘌呤為通過氣流粉碎后的粉末，粒度小于10 u m;
HPLC檢測(色譜柱:Diamonsil C18， 5um， 250 x 4, 6mm;流動相甲醇0. Olmol 磷酸緩沖鹽=30: 70;流速0.9ml/min;檢測波長254nm)脫氧胸苷轉化為脫氧 腺苷的轉化率達82%，每升發酵液中含有脫氧腺苷42g/L。
(4) 脫氧腺苷的分離純化
發酵液用1NNaOH調節pH到中性，高速離心機離心20分鐘得上清液，上清液
5過AB-8大孔吸附樹脂，用去離子水洗柱到流出液為近無色，然后用20%乙醇洗3 個柱體積，30%乙醇洗2個柱體積，最后用50%乙醇從樹脂上解吸出含脫氧腺苷解吸 液，HPLC檢測，收集脫氧腺苷含量在50%以上的解吸液，然后濃縮得脫氧腺苷，收 率為92%，純度為98. 2%。
實施例2、生物轉化法生產脫氧腺苷
(1) 將瑞士乳桿菌CGMCC 1. 1877接種到斜面培養基，40°C， p服.5，培養24 小時制成斜面菌種；斜面培養基由下列重量份的組分組成
葡萄糖15份、蛋白胨18份、酵母膏6份、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、 硫酸鈉8份、硫酸錳0.02份，瓊脂20份和水1000份。
(2) 接種發酵
將斜面菌株接入發酵培養基中擴大培養作為種子液；將種子液按20% (體積百 分比)的接種量接入裝有發酵培養基的發酵罐中37'C， 140轉/分鐘，pH值為6.5， 發酵36小時；發酵培養基由下列重量份的組分組成
葡萄糖15份、蛋白胨5份、麩質粉20、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、硫 酸鈉9份、硫酸錳0. 02份水1000份。
(3) 生產脫氧腺苷
e) 發酵液在4。C、 10000轉/分鐘、離心10分鐘，收集濕菌體；
f) 檸檬酸緩沖液(ra6.0)洗滌步驟a)菌體，4。C離心10分鐘，收集濕菌體， 稱重，用磷酸緩沖液(PH6.0)重懸菌體，制成15%(濕菌體重量和緩沖液的體積比) 的細胞懸浮液；
g) 步驟b)的細胞懸浮液置于冰浴中，超聲波破碎10分鐘，超聲波功率為340 瓦，頻率為4次/10秒；
h) 向步驟c)的破碎液中加入底物混合后5(TC反應24小時，底物含有50g/L 脫氧胸苷和30g / L腺嘌呤，腺嘌呤為通過氣流粉碎后的粉末，粒度小于10 ii m;
HPLC檢測(色譜柱:Diamonsil C18， 5um， 250 x 4. 6畫;流動相甲醇0. Olmol 磷酸緩沖鹽=30: 70;流速0.9ml/min;檢測波長254nm)脫氧胸苷轉化為脫氧 腺苷的轉化率達80% ，每升發酵液中含有脫氧腺苷41g/L。
(4) 脫氧腺苷的分離純化
發酵液用1N NaOH調節pH到中性，高速離心機離心20分鐘得上清液，上清液 過D-101大孔吸附樹脂，用去離子水洗柱到流出液為近無色，然后用20%乙醇洗3個柱體積，用55%乙醇從樹脂上解吸出含脫氧腺苷解吸液，HPLC檢測，收集脫氧腺
苷含量在50%以上的解吸液，然后濃縮得脫氧腺苷，收率為90%，純度為98.7%。
權利要求
1、一種生產脫氧腺苷的方法，是將瑞士乳桿菌種子液接入發酵培養基中發酵培養，得到粗菌體，將所述粗菌體破碎，制成細胞破碎液，向所述細胞破碎液中加入脫氧胸苷和腺嘌呤進行酶促反應，獲得脫氧腺苷；所述腺嘌呤的粒度小于等于10μm。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述發酵培養基由下列重量份的 物質組成葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、麩質粉10-25、檸檬酸胺1-2、磷酸氫二鉀l-2、 硫酸鈉5-10、硫酸錳0.02-0.4和水1000;所述發酵培養的溫度為30-42°C，攪拌轉 速為120-160轉/分鐘，pH值為6. 0-7. 5，發酵時間為24-36小時。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述瑞士乳桿菌種子液與所 述發酵培養基的體積比為10%-15%。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述瑞士乳桿菌種子液是按照如下方法獲得將瑞士乳桿菌接種到斜面培養基培養制成斜面菌種，將所述斜面菌種接 入發酵培養基中培養獲得種子液；所述斜面培養基由下列重量份的物質組成葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、檸檬酸胺1-2、磷酸氫二鉀1-2、硫酸鈉5-10、 硫酸錳0.02-0. 4，瓊脂15-20和水1000。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述瑞士乳桿菌接種到斜面培養 基培養的溫度為30-42°C， pH為6. 5-8,0，培養24-48小時。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述細胞破碎液按照如下方法制 備將所述粗菌體用檸檬酸緩沖液洗滌，然后用pH6.0-7.0磷酸緩沖液懸浮，獲得細 胞懸浮液，超聲破碎所述細胞懸浮液，獲得細胞破碎液。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述檸檬酸緩沖液的pH6. 0-7. 0; 所述磷酸緩沖液的P朋.0。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述超聲條件為功率為300-400 瓦，頻率為3-5次/10秒，時間為5-15分鐘。
9、 根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述細胞懸浮液中菌體的質量百 分含量為15%_35%。
10、 根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述酶促反應的溫度為35-5(TC。
全文摘要
本發明公開了一種生物轉化法生產脫氧腺苷的方法。該方法是將瑞士乳桿菌種子液接入發酵培養基中發酵培養，得到粗菌體，將所述粗菌體破碎，制成細胞破碎液，向所述細胞破碎液中加入脫氧胸苷和腺嘌呤進行酶促反應，獲得脫氧腺苷；所述發酵培養基由下列重量份的物質組成葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、麩質粉10-25、檸檬酸胺1-2、磷酸氫二鉀1-2、硫酸鈉5-10、硫酸錳0.02-0.4和水1000；所述腺嘌呤的粒度小于等于10μm。本發明是生物轉化法生產脫氧腺苷，充分利用酶的高效性、專一性和溫和性，與傳統化學合成方法相比，具有選擇性高、條件溫和、工藝簡單、成本低和污染小等特點。
文檔編號C12P19/00GK101575630SQ200910085860
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月3日 優先權日2009年6月3日
發明者喬瑞穎, 王大然, 王雅婷 申請人:北京博爾萊生物技術有限公司