專利名稱：蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程菌，特別涉及蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌，還涉 及該工程菌的制備方法以及應用該工程菌生產蜂毒肽的方法。
背景技術：
抗菌肽又稱抗微生物肽或肽抗生素，泛指存在于生物體內具有抵御外界微 生物侵害，清除體內突變細胞的一類小分子多肽，廣泛分布于細菌、病毒和各 種動植物體內，是生物天然免疫防御系統的重要組成部分。相對于抗生素而言， 抗菌肽具有抗菌譜廣、有效濃度低、不易使微生物產生抗性、可以方便地進行 改造和修飾等優點。
蜂毒肽(Melittin)是抗菌肽的一種，具有廣譜殺菌作用，可以抑制20多種 革蘭氏陽性和陰性細菌的生長繁殖，能對抗對青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌， 還能增強磺胺類和青霉素類藥物的抗菌效力，對多種真菌、病毒也具有毒性， 有望成為高效、低毒的新一代抗生素及農藥的候選者。
蜂毒肽可以從蜂毒中分離純化獲得，也可以直接化學合成，但現有分離純 化技術難以將蜂毒中有致敏反應并與蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除， 而直接化學合成的成本較高，使蜂毒肽的臨床應用受到嚴重限制。基因工程技 術的發展為獲得蜂毒肽提供了一條新的途徑，近年來已經取得了一定進展，但 仍有許多不足之處，如蜂毒肽的異源表達大多選擇大腸桿菌表達體系，雖然大 腸桿菌作為基因工程藥物首選的表達系統具有諸多優點，但其翻譯后加工修飾 體系不完善，表達產物活性低；也有研究用畢赤酵母表達體系表達蜂毒肽，雖 然畢赤酵母具備一定的轉錄后修飾功能，但其與高等真核生物的生物學相似性
遠遠不及裂殖酵母。裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )是一種單細胞真核生物，具有同高 等真核生物極其相似的特性如細胞周期的調節、染色體的結構和功能、RNA 的拼接、蛋白質的糖基化、磷酸化和酰基化功能等。與釀酒酵母和畢赤酵母相 比，裂殖酵母能更好的表達真核蛋白，并保持這些蛋白的天然構象和功能。2002 年其基因組全序列及各基因功能的取得更有利于研究外源蛋白在裂殖酵母中的 表達。裂殖酵母作為高效外源基因表達系統的研究直到最近才引起重視，目前 國內研究報道較少。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌， 可以在降低蜂毒肽對宿主細胞致死性的同時保證蜂毒肽的天然構象和活性，解 決蜂毒肽提取純化困難、合成成本過高等問題，從而為蜂毒肽的基礎研究和生 產應用提供有力工具。
為達到此目的，本發明提供了一種蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌，該工程菌 是由蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體轉化的裂殖酵母。
進一步，所述蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體含有核苷酸序列如SEQ ID No.l所示的蜂毒肽基因，其編碼氨基*列如SEQ ID No.2所示的蜂毒肽；
進一步，所述蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體采用的裂殖酵母表達載體 為pESP-2;
進一步，所述裂殖酵母為粟酒裂殖酵母SP-Q01。
本發明的目的之二在于提供所述蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的構建方法， 操作簡便易行，表達產物易于分離純化。
為達到此目的，本發明提供了所述蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的構建方法， 包括以下步驟
a、 將蜂毒肽基因插入裂殖酵母表達載體的多克隆位點處，構建蜂毒肽基因 裂殖酵母重組表達載體；
b、 用步驟a構建的蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體轉化裂殖酵母，即得蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌。
進一步，所述步驟a是先制備核苷酸序列如SEQ ID No.l所示的蜂毒肽基因， 將所得蜂毒肽基因克隆入pMD18-T載體，構建蜂毒肽基因重組載體pMD18-T-Melittin;再將構建的蟲奪毒肽基因重組載體pMD18-T-Melittin用限制性內切酶 5a柳M單酶切后，與經單酶切和堿性磷酸酶去磷酸化處理的裂殖酵母表 達載體pESP-2連接，構建蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin;
進一步，所述步驟b是采用醋酸鋰化學轉化法用步驟a構建的蜂毒肽基因 裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin轉化粟酒裂殖酵母SP-Q01 ，用亮氨酸營 養缺陷型培養基篩選陽性轉化子，即得蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌SP-Q01/ pESP-2-Melittin。
本發明的目的之三在于提供應用所述蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌生產蜂毒 肽的方法，操作筒便易行，蜂毒肽表達水平高、易于分離純化、活性強，生產 周期短，成本低。
為達到此目的，本發明提供了應用所述蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌生產蜂 毒肽的方法，包括以下步驟
a、 培養蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌并使其表達蜂毒肽，收集培養物；
b、 將步驟a收集的培養物進行分離純化，即得蜂毒肽。
進一步，所述步驟a是將蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌先用含有硫胺素的YES 液體培養基擴大培養至OD,為1.0,洗滌細胞去除殘留的YES液體培養基和硫 胺素后，再用不含有疏胺素的EMM液體培養基誘導培養18小時，收集培養物；
進一步，所述步驟b是取步驟a收集的培養物，離心去除上清液，石皮碎細 胞，超高速離心去除細胞碎片，上清液再經GST親和層析分離純化，得谷胱甘 肽-S-轉移酶與蜂毒肽的融合蛋白GST-Melittin,將GST-Melittin用腸激酶(Ek) 切除GST,即得蜂毒肽。
本發明的有益效果在于本發明提供了 一種蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌及 其構建方法和應用，操作筒便易行，蜂毒肽表達水平高、易于分離純化、活性強，生產周期短，成本低，彌補了現有蜂毒肽制備方法以及原核表達系統和其 它酵母表達系統的不足，可以在降低蜂毒肽對宿主細胞致死性的同時保證蜂毒 肽的天然構象和活性，解決蜂毒肽提取純化困難、合成成本過高等問題，從而 為蜂毒肽的基礎研究和生產應用提供有力的工具。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發
明作進一步的詳細描述，其中 圖1為本發明的流程示意圖； 圖2為蜂毒肽基因的構建示意圖； 圖3為蜂毒肽基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖4為蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin的構建示意圖5為蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖6為GST-Melittin的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )
圖7為GST-Melittin的蛋白免疫印跡(Western blot)圖； 圖8為GST-Melittin的腸激酶酶切產物的SDS-PAGE圖。
具體實施例方式
下面將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述，本發明的流程 示意圖如圖1所示。
一、蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的構建 蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的構建方法包括以下步驟 a、構建蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體 al、蜂毒肽基因的克隆
根據酵母菌和大腸桿菌密碼子的偏好性及密碼子的合理搭配，在不改變蜂毒肽氨基酸序列的前提下設計蜂毒肽編碼基因序列，為提高引物間的特異性配
對，設計時對部分密碼子進行了同義突變，再在蜂毒肽編碼基因序列的5，端加上 保護堿基、限制性內切酶酶切位點和Ek識別位點序列，在3，端加上限制性內切 酶酶切位點和保護堿基，設計蜂毒肽基因序列如下
5，-aaggatccg啤啤她flto3aggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgecctcata agttggattaaacgtaagaggcaacagtagtaaJgl§gggg§^￡aa-3 ， ( SEQ ID No. 1 ); 其中,單
下劃線部分為5aw/7I酶切位點，斜體部分為Ek酶切位點，黑體部分為蟲奪毒肽編 碼基因，雙下劃線部分為力al酶切位點；
根據蜂毒肽基因序列，設計如下PCR引物并委托上海英駿生物技術有限公司 進行合成
PI: 5，-aaggatccgatgatgatgataaaggaattggagcagttctgaaggtattaaccac-3，( SEQ ID No. 3 ); P2: 5，國ttaatccaacttatgagggcgggcaatcctgtggttaataccttcagaac畫3， ( SEQ ID No.4 ); P3: 5,-ttggatcctctagattactactgttgcctcttacgtttaatccaacttatgagggc-3' ( SEQ ID No,5 );
采用重疊延伸的基因融合策略制備蟲奪毒肽基因，構建示意圖如圖2所示， 共包括兩輪PCR:第一輪PCR是由PI和P2通過末端互補配對互為引物，延伸 制得蜂毒肽基因片段；反應體系為無菌水18pL、 10xPCR反應緩沖液2.5pL、 濃度為25mM的MgCl2 2.5pL、濃度為10mM的dNTP 0.5|iL、濃度均為20pM 的PI和P2各lpiL、濃度為5U/jiL的Taq DNA聚合酶(Takara公司)0.2pL; 第二輪PCR是以第一輪PCR產物為模板，P1和P3為上下游引物，制得蜂毒肽 基因全長，反應體系為無菌水17pL、 10xPCR反應緩沖液2.5pL、 MgCl2 2.5^L、 dNTP 0.5jliL、 PI lpL、 P3 lpL、模板1|liL、 Taq DNA聚合酶0.2pL;兩輪PCR 的反應條件相同首先，94。C變性l分鐘，55。C退火1分鐘，72。C延伸1分鐘； 其次，94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸30秒，共30個循環；最后， 72。C延伸10分鐘。
第二輪PCR產物采用質量百分比濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定， 結果如圖3所示，其中M泳道為DNA分子量標準(分子量從大到小依次為500、 400、 300、 250、 200、 150、 100、 50bp ) ， 1和2泳道為第二4侖PCR產物； 1和2泳道均在分子量約120bp處出現一條特異的DNA條帶，與目的基因預期 大小相符；鑒定正確的第二輪PCR產物采用DNA產物純化試劑盒(TIANGEN 公司)切膠回收純化，即得蜂毒肽基因；將蜂毒肽基因與載體pMD18-T(Takara 公司)在T4 DNA連接酶(Takara公司)作用下進行連接，連接產物轉化入大 腸桿菌JM109 (Takara公司)感受態細胞，用含有濃度為100mg/L的氨千青霉 素、濃度為40mg/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-半乳糖苷(X-gal )和濃度為1Ommol/L 的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB平板培養基篩選陽性克隆菌；挑取陽性 克隆單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，在溫度37。C振搖培 養過夜后，小量提取重組質粒，用PCR法驗證陽性克隆菌以P1和P3為上下 游引物擴增蜂毒肽基因；所得陽性克隆菌委托上海英駿生物技術有限公司采用 Sanger雙脫氧法進行DNA測序，結果顯示在pMD18-T中插入有與SEQ ID No.l 所示核苷酸序列完全一致的DNA片段，表明蜂毒肽基因重組載體pMD18-T-Melittin構建成功。
a2、蜂毒肽基因與裂殖酵母表達載體的連接
采用蜂毒肽基因重組載體pMD18-T-Melittin和裂殖酵母表達載體pESP-2構 建蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin，構建示意圖如圖4所示。 裂殖酵母表達載體pESP-2包含以下部分(1 )大腸桿菌復制起始序列ColEl和 氨芐青霉素(ampicilin)抗性基因，其允許在大腸桿菌克隆時進行載體的復制和 抗生素選擇；(2)裂殖酵母自主復制序列ARS1,可以提供在裂殖酵母中使載體 自動復制所需要的復制起始點；(3)選擇標記基因LEU2-d,可以作為向裂殖酵 母中轉化表達結構的選擇標定物；(4)表達盒，包括裂殖酵母中嚴格受硫胺素濃 度調控的nmtl啟動子(Pnmtl)和終止子(Tnmtl )、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST) 全長序列、凝血酶(Thrombin)識別位點和多克隆位點(MCS)，可以在裂殖酵 母中誘導表達帶GST標簽的融合蛋白。具體操作如下
將蜂毒肽基因重組載體pMD18-T-Melittin用5am/TI (Takara公司)進行單酶切，采用DNA產物純化試劑盒切膠回收純化蜂毒肽基因，再與經5^2/71單 酶切和小牛腸堿性磷酸酶(CIAP， Takara公司)去磷酸化處理的裂殖酵母表達 載體pESP-2 (Invitrogen ^>司)在T4 DNA連4妻酶作用下進行連接，連接產物轉 化入大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有濃度為100mg/L的氨節青霉素、濃度 為40mg/L的X-gal和濃度為1Ommol/L的IPTG的LB平板培養基篩選陽性克隆 菌；挑取陽性克隆單菌落，接種于含有氨節青霉素的LB液體培養基中，在溫度 37。C振搖培養過夜后，小量提取重組質粒，用PCR法驗證陽性克隆菌根據 pESP-2多克隆位點兩端的核苷酸序列設計如下PCR引物(對pESP-2空載體可 克隆出約260bp的片)爻)Yf: 5'-gtacttgaaatccagcaagtatatagc畫3， ( SEQ ID No.6 ); Yr: 5，-caaaatcgtaatatgcagcttgaatgggcttcc-3， ( SEQ ID No.7 );以Yf和Yr為上下 游引物擴增重組質粒，以P1和P3為上下游引物擴增蜂毒肽基因，反應體系為 上下游引物各lOpmol、 dNTP200pmo1、菌液lpL、 10xPCR反應緩沖液2.5pL、 TaqDNA聚合酶lU，無菌水補充至總體積為25pL;反應條件為首先，95°C 預變性5分鐘；其次，94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸1分鐘，共 35個循環；最后，72i:延伸5分鐘；所得陽性克隆菌委托上海英駿生物技術有 限公司釆用Sanger雙脫氧法進行DNA測序，結果顯示在pESP-2中插入有與SEQ ID No.l所示核香酸序列完全一致的DNA片段，表明蜂毒肽基因裂殖酵母重組 表達載體pESP-2-Melittin構建成功。
b、用蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體轉化裂殖酵母
采用醋酸鋰化學轉化法用蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin轉化粟酒裂殖酵母SP-QOl，用亮氨酸營養缺陷型培養基篩選陽性轉化 子；粟酒裂殖酵母SP-QOl包括一個變異的LEU1基因，LEU1基因編碼亮氨酸 生物合成必備的3-丙基脫氫酶，LEU1基因變異導致亮氨酸營養缺陷，而蜂毒肽 基因裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin含有選擇標記基因LEU2-d,可以實 現亮氨酸營養缺陷互補，故只有轉化pESP-2-Melittin的SP-Q01才能在亮氨酸營 養缺陷型培養基上生長。具體操作如下挑選3個粟酒裂殖酵母SP-QOl (Invitrogen公司)單菌落，接種于YPD液 體培養基10mL中，在溫度28。C、振搖速度200rpm的條件下培養過夜，取菌液 2mL,接種于新鮮YPD液體培養基50mL中，在同樣條件下培養至OD600約0.5， 轉速3000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用lxTE緩沖液(由下述組分組成濃 度為10mmoi/L、 pH為8.0的Tris-HCl、濃度為lmmol/L的EDTA) 6mL重懸細 胞，轉速3000 rpm離心5分鐘，棄去上清液，用"TE/LiAC (將醋酸鋰LiAC 用lxTE緩沖液溶解制成濃度為0.1mol/L的溶液)0.5-1.0 mL重懸細胞，制得裂 殖酵母SP-Q01感受態細胞；取裂殖酵母SP-Q01感受態細胞lOOjxL,加入*奪毒 肽基因裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin溶液5pL和濃度為10pg/^iL的鮭 魚精DNA溶液10pL(鮭魚精DNA溶液在加入前先煮沸2分鐘再置水上迅速冷 卻)，充分混勻，加入PEG/LiAC/TE(將質量百分比濃度為50%的PEG-4000 8mL、 濃度為lmol/L的LiAC lmL和10xTE緩沖液lmL混勻即得)600pL,充分混勻， 在溫度30°C 、振搖速度200rpm的條件下培養30~50分鐘，加入二曱基亞砜70pL， 輕輕顛倒充分混勻，溫度42。C水浴15~20分鐘，再置水上冷卻2分鐘，轉速 13000rpm離心5~10秒，棄去上清液，用lxTE緩沖液150pL重懸細胞，轉速 13000rpm離心5~10秒，棄去上清液，用lxTE緩沖液150pL重懸細胞，吸取 50pL，接種至含有濃度為25pmol/L的硫胺素的EMM平板培養基上篩選陽性轉 化子，用石蠟封口膜密封平板，溫度28。C倒置培養4 5天；挑取陽性轉化子單 菌落，接種至含有濃度為25pmol/L的硫胺素的EMM平板培養基上進行劃線培 養，小量提取重組質粒，用PCR法-驗證陽性轉化子以Yf和Yr為上下游引物 擴增重組質粒，結果如圖5所示，其中M泳道為DNA分子量標準(分子量從 大到小依次為5000、 3000、 2000、 1000、 750、 500、 250、 100bp)， 1~11泳道 為PCR產物；1~11泳道均在分子量約380bp處出現一條特異的DNA條帶，與 目的片段的預期大小相符，表明蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌SP-Q01/pESP-2-Melittin構建成功。
二、蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的應用天然蜂毒肽在蜜蜂體內以蜂毒肽前體形式表達，故蜂毒肽對蜜蜂沒有毒性。
本發明在蜂毒肽的N端加上GST標簽和EK識別序列，使蜂毒肽以融合蛋白的 形式表達，既可以在降低蜂毒肽對宿主細胞致死性的同時保證蜂毒肽的天然構 象和活性，又可以利用GST標簽方便地進行融合蛋白的分離純化，純化后的融 合蛋白用EK切除GST標簽，即可獲得蜂毒肽。
應用蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌生產蜂毒肽的方法包括以下步驟
a、 GST-Melittin的誘導表達
根據啟動子Pnmtl表達活性受培養基中硫胺素含量嚴格調控的特點，將蜂毒 肽基因裂殖酵母工程菌首先用含有硫胺素的YES培養基進行培養，在抑制外源 蛋白表達的同時使工程菌快速、大量生長，收集擴大培養的工程菌并充分洗滌， 去除殘留的YES液體培養基和碌u胺素；再用不含有碌u胺素的EMM液體培養基 進行培養，解除硫胺素對啟動子Pnmtl的阻遏作用，從而誘導GST-Melittin的 表達。具體操作如下
將蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌SP-Q01/pESP-2-Melittin接種至含有質量百分 比濃度為5%的硫胺素的YES液體培養基10mL中，在溫度28°C、振搖速度 200rpm的條件下培養16小時，取菌液3mL，接種至新鮮的含有質量百分比濃 度為5%的硫胺素的YES液體培養基lOOmL中，在同樣條件下培養至00600約 1.0,轉速5000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用無菌水lOOmL重懸細胞，轉速 5000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用無菌水100mL重懸細胞，轉速5000rpm 離心5分鐘，棄去上清液，用不含有硫胺素的EMM液體培養基200mL重懸細 胞，轉移至無菌1000mL三角瓶中，在溫度28。C、振搖速度200rpm的條件下分 別誘導表達12、 18和22小時，收集培養物，備用。
b、 GST-Melittin的分離純化
采用超高速離心和GST親和層析的方法分離純化GST-Melittin，裂解培養 細胞，超高速離心去除細胞碎片，上清液再經GST親和層析，在充分洗滌GST 親和層析柱去除可能吸附的雜蛋白后，用還原型谷胱甘肽溶液將GST-Melittin從層析柱上洗脫下來，即得純化的GST-Melittin。具體操作如下
取步驟a收集的培養物，在溫度4°C 、轉速5000rpm的條件下離心，棄去上 清液，用細胞裂解液(由下述組分組成濃度為50mmol/L、pH為7.4的Tris-HCl、 濃度為5mmol/L的EDTA、濃度為300mmol/L的氯化鈉、質量百分比濃度為0.5% 的IGEPAL、濃度為100mmol/L的氟化鈉、濃度為lmmol/L的乙二醇二乙醚二 胺四乙酸和濃度為lmmol/L的釩酸鈉)50mL重懸細胞，在液氮冷凍條件下加入 氧化鋁和裂解緩沖液，用機械裂解法裂解細胞，于冰上收集細胞勻漿液，在溫 度4。C、轉速10000rpm的條件下離心30分鐘，耳又上清液用GSTrap FF柱(GE 公司)進行親和層析先用3倍樣品體積的PBS緩沖液(由下述組分組成濃 度為140 mmol/L的氯化鈉、濃度為2.7mmol/L的氯化鉀、濃度為10mmol/L的 磷酸氫二鈉、濃度為1.8mmol/L的磷酸二氫鉀，pH7.3 )以流速1.0mL/min平衡 GSTrap FF柱，再將上述細胞裂解上清液以流速0.2mL/min上樣，用3倍樣品體 積的PBS緩沖液以流速l.OmL/min洗滌GSTrap FF柱，去除吸附在柱上的雜蛋 白，最后用2倍樣品體積的洗脫緩沖液(由下述組分組成濃度為10mmol/L的 還原型谷胱甘肽、濃度為50mmol/L的Tris-HCl, pH8.0 )以流速0.2mL/min沖 洗GSTrap FF柱，將吸附在柱上的GST-Melittin洗脫下來，收集洗脫液，超濾離 心濃縮，即得純化的GST-Melittin,置溫度-80。C保存。 純化的GST-Melittin的4企測 (1) SDS國PAGE才企測
將純化的GST-Melittin用含有質量百分比濃度為1%的曲拉通(Triton )X-IOO 的PBS緩沖液400^iL溶解，吸取15(iL，煮沸5分鐘后，加入2x蛋白上樣緩沖 液(將去離子水3.55mL、濃度為0.5 mol/L、 pH為6.8的Tris-HCl 1.25mL、甘 油2.5mL、濃度為100g/L的SDS 2.0mL、濃度為5g/L的溴酚藍0.2mL和巰基乙 醇0.5mL混勻即得)15jiL，用質量百分比濃度為15%的分離膠進行SDS-PAGE, 考馬斯亮藍R-250染色；結果如圖6所示，其中M泳道為預染蛋白質分子量標 〉焦(Stained Protein Molecular Weight Marker, Fermentas公司),1 ;永道為i秀導表達12小時的純化GST-Melittin, 2泳道為i秀導表達18小時的純化GST-Melittin， 3泳道為誘導表達22小時的純化GST-Melittin; 2和3泳道均在分子量約29KD 處出現一條特異的蛋白質條帶，與GST-Melittin的預期分子量大小一致，且含雜 蛋白少，純化效果好，表明蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌SP-Q01/pESP-2-Melittin 的誘導表達時間以18小時為佳。 (2) Western blot 4全觀寸
將純化的GST-Melittin經SDS-PAGE后電轉印至HybondN尼;O莫(Phamarcia 公司)上，洗膜，封閉，加入鼠抗GST標簽單克隆抗體(TIANGEN公司)，溫 度37。C孵育1小時，洗膜，顯色；結果如圖7所示，其中M泳道為蛋白質分子 量標準，1泳道為純化的GST-Melittin; 1泳道在分子量約29KD處出現一條特 異的蛋白質條帶，證實所得純化蛋白為GST-Mdittin。
蜂毒肽的檢測
(1) SDS-PAGE檢測
將純化的GST-Melittin用EK進行酶切，取酶切產物進行SDS-PAGE，結果如 圖8所示，其中，l泳道為細胞裂解上清(含總蛋白)，2泳道為GST-Melittin的EK 酶切產物，3泳道為純化的GST-Melittin, M泳道為蛋白質分子量標準(分子量從 大到小依次為66.2、 45、 35、 25.2、 18.4、 14.4KD);可見2泳道在分子量約26KD 處出現一條特異的蛋白質條帶，與GST的分子量大'J、一致，表明GST-Melittin可 以被EK切除GST,從而獲得蜂毒肽。
(2) 抗菌活性4企測
將OD5卯為0.375的大腸桿菌培養菌液lmL與瓊脂培養基25mL混勻，倒入培 養皿中，待培養基凝固后，在培養基上打孔，孔徑為0.6cm，孔容量為70jjL;將 GST-Melittin的EK酶切產物(含有濃度為1.20 x 1(TVg4iL的蜂毒肽)和濃度為0.12 昭/^iL的GST-Melittin分別加入孔中，同時設陰性對照(加入無菌水)和陽性對照 (加入濃度為4.3 x 10-Vg/pL的氨芐青霉素)，再將培養皿在溫度37。C條件下培養 24小時，測定抑菌圈的大小。結果GST-Melittin的EK酶切產物產生直徑為1.4cm的抑菌圈，陽性對照產生直徑為1.9cm的抑菌圏，GST-Melittin和陰性對照未產生 明顯抑菌圈；表明蜂毒肽N端帶有GST標簽和EK識別序列時幾乎不顯示抗菌活 性，而去除GST標簽和EK識別序列后顯示較強的抗菌活性。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管 通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術 人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。序 列 表
<110> 重慶大學
<120>蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌及其構建方法和應用
<160> 7
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<222〉 (24)……(107) <220>
<223>人工序列的描述蜂毒肽基因
<400> 1
aaggatccga tgatgatgat aaa gga att gga gca gtt ctg aag gta Ua 50
Gly lie Gly Ala Val Leu Lys Val Leu 1 5
acc aca gga ttg ccc gcc etc ata agt tgg att aaa cgt aag agg caa 98 Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Lys Arg Lys Arg Gin 10 15 20 25
cag tag taa tctagaggat ccaa 121 Gin
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 東方蜜蟲奪(Apis cerena Fabricius)
<400> 2
Gly lie Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala 15 10 15
Leu lie Ser Trp lie Lys Arg Lys Arg Gin Gin
20 25<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物P1
<400> 3
aaggatccga tgatgatgat aaaggaattg gagcagttct gaaggtatta accac 55
<210> 4
<211> 50
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物P2
<400> 4
ttaatccaac ttatgagggc gggcaatcct gtggtUata ccttcagaac 50
<210> 5
<211> 56
<212> 腿
<213〉 人工序列
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<223〉 人工序列的描述引物P3
<400> 5
Uggatcctc tagaUacta ctgttgcctc ttacgtttaa tccaacttat gagggc 56
<210> 6
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220><223> 人工序列的描述引物Yf <400> 6
gtacttgaaa tccagcaagt atatagc 27
<210〉 7
<211〉 33
<212> 腿
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物Yr <400> 7
caaaatcgta atatgcagct tgaatgggct tcc 3權利要求
1、蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌，其特征在于該工程菌是由蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體轉化的裂殖酵母。
2、 根據權利要求1所述的蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌，其特征在于所述 蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體含有核香酸序列如SEQ ID No.l所示的蜂毒 肽基因，其編碼氨基^列如SEQ IDNo.2所示的蜂毒肽。
3、 根據權利要求2所述的蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌，其特征在于所述 蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體采用的裂殖酵母表達載體為pESP-2。
4、 根據權利要求1至3任一權利要求所述的蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌， 其特征在于所述裂殖酵母為粟酒裂殖酵母SP-QOl。
5、 權利要求1所述的蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征在于 包括以下步驟a、 將蜂毒肽基因插入裂殖酵母表達載體的多克隆位點處，構建蜂毒肽基因 裂殖酵母重組表達載體；b、 用步驟a構建的蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體轉化裂殖酵母，即得 蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌。
6、 根據權利要求5所述的蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征 在于所述步驟a是先制備核苦酸序列如SEQIDNo.l所示的蜂毒肽基因，將所 得蜂毒肽基因克隆入pMD18-T載體，構建蜂毒肽基因重組載體pMD18-T-Melittin; 再將構建的蜂毒肽基因重組載體pMD18-T-Melittin用限制性內切酶5am//1單酶 切后，與經5am//1單酶切和堿性磷酸酶去磷酸化處理的裂殖酵母表達載體 pESP-2連接，構建蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體pESP-2-Melittin。
7、 根據權利要求6所述的蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌的構建方法，其特征 在于所述步驟b是采用醋酸鋰化學轉化法用步驟a構建的蜂毒肽基因裂殖酵 母重組表達載體pESP-2-Melittin轉化粟酒裂殖酵母SP-Q01 ，用亮氨酸營養缺陷型培養基篩選陽性轉化子，即得蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌SP-Q01/pESP-2-Melittin。
8、 應用權利要求1所述的蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌生產蜂毒肽的方法， 其特征在于包括以下步驟a、 培養蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌并使其表達蜂毒肽，收集培養物；b、 將步驟a收集的培養物進行分離純化，即得蜂毒肽。
9、 根據權利要求8所述的應用蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌生產蜂毒肽的方 法，其特征在于所述步驟a是將蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌先用含有^^胺素 的YES液體培養基擴大培養至OD6oo為1.0,洗滌細胞去除殘留的YES液體培 養基和硫胺素后，再用不含有硫胺素的EMM液體培養基i秀導培養18小時，收 集培養物。
10、 根據權利要求9所述的應用蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌生產蜂毒肽的 方法，其特征在于所述步驟b是取步驟a收集的培養物，離心去除上清液， 破碎細胞，超高速離心去除細胞碎片，上清液再經GST親和層析分離純化，即 得谷胱甘肽-S-轉移酶與蜂毒肽的融合蛋白GST-Melittin，將GST-Melittin用腸激 酶切除GST,即得蜂毒肽。
全文摘要
本發明公開了一種蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌及其構建方法和應用，該工程菌是由蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體轉化的裂殖酵母；其構建方法包括構建蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體、用蜂毒肽基因裂殖酵母重組表達載體轉化裂殖酵母共2個步驟；應用該工程菌生產蜂毒肽的方法包括蜂毒肽的表達、蜂毒肽的分離純化共2個步驟；操作簡便易行，蜂毒肽表達水平高、易于分離純化、活性強，生產周期短，成本低，彌補了現有蜂毒肽制備方法以及原核表達系統和其它酵母表達系統的不足，可以在降低蜂毒肽對宿主細胞致死性的同時保證蜂毒肽的天然構象和活性，解決蜂毒肽提取純化困難、合成成本過高等問題，從而為蜂毒肽的基礎研究和生產應用提供有力的工具。
文檔編號C12P21/02GK101591622SQ20091010422
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月30日 優先權日2009年6月30日
發明者劉志昭, 昀 涂, 宇 潘, 胡宗利, 胡廷章, 磊 鄧, 陳國平 申請人:重慶大學