專利名稱：基于Vasohibin基因的偽病毒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別涉;S^于Vasohibin基因的偽病毒及其制備 方法和應用。
背景技術：
腫瘤是嚴重威脅人類健康的高發病率和高死亡率疾病。繼手術、放射治療 和化學治療后，生物治療已經成為腫瘤綜合治療中的重要手^:。當前，腫瘤生 物治療策略有腫瘤相關基因或腫瘤抑制基因的靶向治療、胂瘤相關抗原的免疫 治療等，但均由于技術成熟性、有效性、安全性和經濟性等問題，在實際應用 中受到4艮大限制。
研究發現，90%以上的人類腫瘤為實體瘤，而實體瘤的生長和轉移需要新生 血管形成，抑制新生血管形成能夠在一定程度上有效抑制胂瘤的生長和轉移。 因此，抑制腫瘤血管生成成為腫瘤治療中一個重要的補充策略。過去十年中， 國內外研究者致力于各種腫瘤血管生成抑制劑的研究，但迄今為止尚未取得令 人滿意的效果。此外，研究還發現，單純抑制腫瘤血管生成在腫瘤治療中仍存 在一定局限性，若同時聯用針對腫瘤細胞本身的其它治療手段，將會產生更加 理想的抗瘤效果。因此，以肺瘤新生血管內皮細胞和腫瘤細月包為雙靶標的治療 策略成為胂瘤研究中的 一個新方向。
Vasohibin是新近發現的第 一個血管生成負反饋調節因子，選擇性表達于血 管內皮細胞，可以被血管生成促進因子如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、纖 維生長因子-2 (FGF-2)等誘導產生，并通過負反饋調節抑制血管生成。研究顯 示，Vasohibin基因轉染至小鼠肝組織中可使血漿中Vasohibin釋放增加，并在 遠隔部位表現出抗血管生成效應；在小鼠視網膜新生血管生成模型中，血管內皮細胞VEGF高表達與Vasohibin mRNA升高相伴-f亍，敲除Vasohibin基因后導 致視網膜新生血管增加，相反，目艮球內注射重組Vasohibin基因或帶有Vasohibin 基因的腺病毒載體能強烈抑制視網膜新生血管形成；通過腺病毒載體轉染 Vasohibin基因還可以抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移和微管形成等。因此， Vasohibin可能是抑制肺瘤血管生成的理想靶點。
RGD肽是一類含有Arg-Gly-Asp (RGD)序列的小肽，廣泛存在于多種生物 體內及同一種生物體的各種組織中。作為一種重要的細胞識別位點與信號啟動 分子，在許多生命活動中發揮著重要的調節作用。目前研究較多的是關于RGD 肽通過其所含的RGD序列竟爭結合到細胞表面的整合素受體上從而產生抗血小 板凝聚、抗胂瘤遷移以及抗腫瘤血管生成作用等方面。研究"^正實整合素家族 中o^3與細胞粘附和新生血管形成的關系最為密切，其配體RGD肽對腫瘤新生血 管內皮細胞的粘附和遷移有明顯抑制作用，且可i秀導腫瘤細胞中caspase-3和 caspase-7表達增高，從而促進腫瘤細胞的凋亡。
人類乳頭狀病毒16型(HumanPapillomavirustype-16, HPV16)的主要衣殼 蛋白(LI)具有自身裝配成病毒樣顆粒(Virus-like Particle, VLP)的特性，而 在適宜條件下VLP可以將外源基因或小分子物質包裝成具有天然病毒樣結構的 偽病毒(PseudoVirus),因此，HPV16L1可以用作基因或藥物載體。但HPV16L1 VLP具有較強的免疫原性，免疫動物時能誘導才幾體產生高滴度的中和抗體，不利 于目的基因高效轉染至靶細胞中。研究發現，HPV16L1 VLP與中和抗體產生及 結合有關的構象依賴性抗原表位位于HPV16L1的高可變環區，這一區域在裝配 成VLP時朝向顆粒的外表面；在HPV16L1的第266位和第267位氨基酸之間插入 一個外源肽，不會影響HPV16L1自身裝配成VLP的能力，還能使機體產生的中 和抗體滴度明顯下降。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種基于Vasohibin基因的偽病毒， 可以最大限度地逃避機體清除機制，專一性地被肺瘤新生血管內皮細胞及腫瘤細胞攝取，發揮同時抑制腫瘤血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡的作用，大大提高 腫瘤治療的有效性和安全性。
為達到此目的，在本發明的第一方面，提供了一種基于Vasohibin基因的偽 病毒，該偽病毒是由病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD包裹Vasohibin基因重組 真核表達載體而得到的模擬天然病毒樣結構的物質；所述病毒衣殼嵌合蛋白 HPV16L1-RGD是在HPV16L1的第266位和第267位氨基酸之間插入RGD肽。
進一步，所述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD具有如SEQ ID No.2所示 的氨基#列；
進一步，所述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的編碼基因具有如SEQID No.l所示的核苷酸序列；
進一步，所述Vasohibin基因重組真核表達載體含有核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的Vasohibin基因；
進一步，所述Vasohibin基因重組真核表達栽體采用p3xFLAG-CMV-14真
核表達載體o
本發明的目的之二在于提供所述基于Vasohibin基因的偽病毒的制備方法， 操作簡便易行。
為達到此目的，在本發明的第二方面，提供了所述基于Vasohibin基因的偽 病毒的制備方法，包括以下步驟
a、病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的構建
HPV16L1-RGD基因重組載體的構建提取人宮頸癌細胞抹Caski總RNA; 合成如下引物引物F1具有SEQIDNo.3所示序列，引物Rl具有SEQ ID No.4 所示序列，誘變引物Fm具有SEQ ID No.5所示序列，誘變引物Rm具有SEQ ID No.6所示序列；以Caski細胞總RNA為4莫板進行HPV16L1基因的逆轉錄和重 疊延伸PCR法定點誘變，構建具有SEQ ID No.l所示序列的HPV16L1-RGD基 因；重疊延伸PCR法定點誘變包括兩輪PCR:第一輪PCR包括2個反應，以逆 轉錄所得HPV16L1 cDNA為模板，1個反應以引物Fl和誘變引物Rm為上下游引物，制得含突變位點及其上游序列的片段DNAFRm;另l個反應以誘變引物 Fm和引物Rl為上下游引物，制得含突變位點及其下游序列的片段DNAFmR; 第 一輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后進行第二輪PCR, FRm 和FmR通過末端互補配對互為引物，延伸制得含突變位點及其上下游序列的全 長DNA FR即HPV16L1-RGD基因，再以FR為模板、引物F1和引物R1為上 下游引物進行擴增；第二輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后 即得HPV16L1-RGD基因；上述兩輪PCR的反應條件相同溫度94。C預變性5 分鐘，然后94"變性1分鐘、45。C退火30秒、72。C延伸2分^K共30個循環， 最后72。C延伸4分鐘；將所得HPV16Ll-RGD基因克隆入pCR-T0P0載體，再 轉化入大腸桿菌DH5a,用含有氨卡青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取重組 質粒，采用單酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質粒并測序，測序結果顯示插入片 段序列與SEQ ID No.l所示序列一致者，即為構建成功的HPV16L1-RGD基因 重組載體pCRH -TOPO/HPV16L1-RGD;
HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒穿梭載體的構建合成如下引物引物 F2具有SEQIDNo.7所示序列，引物R2具有SEQ ID No.8所示序列；以pCR II-TOPO/HPV16L1-RGD為模板、引物F2和引物R2為上下游引物進行PCR, PCR反應條件為溫度94。C預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、45。C退火30 秒、72。C延伸2分鐘，共30個循環，最后72。C延伸4分鐘；PCR產物經瓊脂糖 凝膠電泳鑒定、切月交回收純4匕后，用限制性內切酶Ehel和Xhol進行雙酶切， 再與同樣經Ehel和Xhol雙酶切的桿狀病毒穿梭載體pFastBacDual進行連接， 連接產物轉化入大腸桿菌DH5oc，用含有氨千青霉素的LB平板篩選陽性克隆， 提取重組質粒，采用雙酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質粒并測序，測序結果顯 示插入片段序列與SEQ ID No.l所示序列一致者，即為構建成功的HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒穿梭載體pFastBacDual/HPV16Ll- RGD;
HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒的構建將pFastBacDual/HPV16Ll-RGD 與線性桿狀病毒DNA共轉染至對數生長期的昆蟲細月包Sf-9中進行胞內同源重組，構建HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒，轉染3天后，收集培養上清液作 為病毒原'液；
病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的細胞內表達將所得病毒原液感染對 數生長期的Sf-9細胞，溫度27。C培養3天后，收集細胞，用PBS重懸，超聲破 壁，低速離心，將上清液轉移至盛有濃度為400g/L的蔗糖溶液的離心管中，超 速離心，棄上清，將沉淀用CsCl密度梯度超速離心，收集離心管中浮密度為 1.34g/mL的白色蛋白條帶，即得具有SEQ ID No.2所示序列的病毒衣殼嵌合蛋 白HPV16L1-RGD;
b、 Vasohibin基因重組真核表達載體的構建
提取人脾臟組織血管內皮細胞總RNA;合成如下引物引物F3具有SEQ ID No.lO所示序列，引物R3具有SEQIDNo.ll所示序列；以人脾臟組織血管內皮 細胞總RNA為模板、引物F3和引物R3為上下游引物進行Vasohibin基因的逆 轉錄和PCR擴增，PCR反應條件為溫度95。C預變性IO分鐘，然后溫度94。C 變性1分鐘、58。C退火1分鐘、72°(3延伸4分鐘，共30個循環，最后溫度72 。C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖皿電泳鑒定后，切膠回收純化目的片萃殳， 即得Vasohibin基因；將所得Vasohibin基因用限制性內切酶Notl和Xbal進行雙 酶切，再與同樣經Notl和Xbal雙酶切的真核表達載體p3xFLAG-CMV-14進行 連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5a,用含有氨千青霉素的LB平板篩選陽性 克隆，提取重組質粒，采用雙酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質粒并測序，測序 結果顯示插入片段序列與SEQIDNo.9所示核苦酸序列完全一致者，即為構建成 功的Vasohibin基因重組真核表達載體p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin;取含有 p3xFLAG-CMV-14AVasohibin的大腸桿菌DH5a,擴增培養，大量抽提重組質粒， 即得p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin;
c、 基于Vasohibin基因的偽病毒的制備
取步驟a所得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-RGD，加入變性劑使蛋白變性， 再加入步驟b所得Vasohibin基因重組真核表達載體p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin,于PBS中透析過夜，使變性蛋白逐漸復性，在復性過程中HPV16L1-RGD包裹 p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin,自組裝形成基于Vasohibin基因的偽病毒。 本發明的目的之三在于提供所述基于Vasohibin基因的偽病毒的應用。 為達到此目的，在本發明的第三方面，提供了所述基于Vasohibin基因的偽 病毒在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發明提供了 一種基于Vasohibin基因的偽病毒及其制備方法和應用，具有 如下有益效果(1)在HPV16L1的第266位和第267位氨基酸之間插入RGD 肽構建病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD,不會影響HPV16L1自身裝配成VLP 的能力，并能使機體產生的中和抗體滴度明顯下降，從而使本發明偽病毒可以 最大限度地逃避機體清除機制；(2) RGD肽在HPV16L1-RGD自裝配成VLP 后暴露在VLP的外表面，從而使本發明偽病毒可以專一性地;故腫瘤新生血管內 皮細胞及胂瘤細胞表面的整合素受體介導攝取，減少無關細胞非特異攝取所帶 來的副作用，大大提高胂瘤治療的安全性；(3)RGD肽對腫瘤新生血管內皮細 胞的粘附和遷移有明顯抑制作用，且可誘導腫瘤細胞中caspase-3和caspase-7表 達增高，從而使本發明偽病毒具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用；(4) Vasohibin基 因重組真核表達載體可以在腫瘤新生血管內皮細胞內特異性表達并分泌 Vasohibin,從而使本發明偽病毒具有抑制腫瘤血管生成的作用；(5)本發明偽 病毒的制備方法簡便易行；綜上所述，本發明偽病毒可以最大限度地逃避機體 清除機制，專一性地被腫瘤新生血管內皮細胞及腫瘤細胞攝取，發揮同時抑制 腫瘤血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡的作用，大大提高腫瘤治療的有效性和安全 性，可用于制備抗腫瘤藥物，在腫瘤治療領域具有良好的應用前景。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發 明作進一步的詳細描述，其中
圖1為RT-PCR檢測HPV16L1-RGD基因在昆蟲細胞內的轉錄；圖2為SDS-PAGE檢測HPV16L1-RGD基因在昆蟲細胞內的表達； 圖3為透射電鏡沖企測HPV16L1-RGD的自裝配能力； 圖4為WesternbloU企測Vasohibin基因重組真核表達載體的表達； 圖5為透射電鏡檢測基于Vasohibin基因的偽病毒的形態。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中 未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第 三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
在優選實施例中，首先將3個串聯的RGD肽插入HPV16L1的第266位和 第267位氨基酸之間構建病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD (當然，也可以只插 入1個RGD肽，或插入2個、4個或更多個串耳關的RGD肽，都可以達到本發 明目的)；其次將Vasohibin基因克隆入真核表達載體中構建Vasohibin基因重 組真核表達載體；最后用HPV16L1-RGD包裹Vasohibin基因重組真核表達載體， 自組裝制得基于Vasohibin基因的偽病毒；并在體外細胞水平和體內動物荷瘤水 平對所得偽病毒抑制胂瘤血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡的作用進行了考察。 ( 一 )基于Vasohibin基因的偽病毒的制備
一、病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的構建及檢測
1、病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的構建 (1) HPV16L1-RGD基因重組載體的構建
取人宮頸癌細胞林Caski (Sciencell公司)，采用RNA提取試劑盒(TaKaRa 公司)提取細胞總RNA。
根據GenBank登錄號為EU430688的HPV16L1基因序列和重疊延伸PCR (Overlap-extension PCR, OE-PCR)法定點誘變原理，設計如下4條引物并委 4乇上海生工/>司進4亍合成引物Fl: 5,-agatctgccaccatgtctotttggctgcct-3， ( SEQ IDNo.3),下劃線部分為BglII限制性酶切位點；引物R1: 5，-atgtcgtactaccatcaccatca ccatcac-3， ( SEQ ID No.4 ); i秀變引物Fm: 5，-aagctttttatagatcacgtagttcgct-3， ( SEQ IDNo.5),下劃線部分為突變位點；誘變引物Rm: 5， -aactgctaaagctagcaattgtcagtta -3， (SEQIDNo.6),下劃線部分為突變位點。
采用RT-PCR逆轉錄擴增試劑盒(TaKaRa公司)進行HPV16L1基因的逆 轉錄和OE-PCR法定點誘變，在HPV16L1基因的第798位和第799位石威基之間 插入串聯的3個RGD肽的編碼基因，構建HPV16L1-RGD基因(SEQ ID No.l ); 其中，逆轉錄是以提取的Caski細胞總RNA為模板、01igo(dT)16為引物，制得 HPV16L1 cDNA; OE-PCR法定點誘變包括兩輪PCR共3個反應第一輪PCR 包括2個反應，1個反應以HPV16L1 cDNA為模板、引物Fl和誘變引物Rm為 上下游引物，制得含突變位點及其上游序列的片段DNA FRm;另1個反應以 HPV16L1 cDNA為沖莫板、誘變引物Fm和引物Rl為上下游引物，制得含突變位 點及其下游序列的片段DNAFmR， FmR和FRm末端互補；第一輪PCR產物經 瓊脂糖凝膠電泳鑒定、膠回收試劑盒(TIANGEN公司)切膠回收純化后進行第 二輪PCR, FRm和FmR通過末端互補配對互為引物，延伸制得含突變位點及其 上下游序列的全長DNA FR即HPV16L1-RGD基因，再以FR為模板、引物Fl 和引物R1為上下游引物進行擴增；第二輪PCR產物經瓊脂糖皿電泳鑒定、 膠回收試劑盒切膠回收純化后即得HPV16L1-RGD基因；上述兩輪PCR的反應 條件相同溫度94。C預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、45。C退火30秒、 72。C延伸2分鐘，共30個循環，最后72。C延伸4分鐘。
將HPV16Ll-RGD基因在TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)催化下與dATP 進行PCR,溫度72。C反應30分鐘，使HPV16L1-RGD基因的3'末端加上A堿 基，PCR產物用膠回收試劑盒切膠回收純化后，與3'末端帶有T堿基的pCR^-TOPO 載體(sigma公司)在T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)作用下進行T-A 連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5a (TIANGEN公司)感受態細胞，用含有 氨芐青霉素(AMP)的LB平板篩選陽性克隆，將單個陽性克隆接種于含有AMP的LB液體培養基中，溫度37。C振搖培養過夜后，用質粒小量提取試劑盒 (TIANGEN公司)小量提取重組質粒，所得重組質粒用BglII單酶切法和PCR 法進行鑒定，單酶切法和PCR法均鑒定為陽性的重組質粒委托上海生工公司對 插入片段進行測序，測序結果顯示插入片,爻序列與SEQIDNo.l所示序列一致， 表明HPV16L1-RGD基因構建成功，HPV16L1-RGD基因重組載體pCRII-TOPO/ HPV16L1-RGD構建成功。
(2) HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒穿梭載體的構建
根據HPV16L1-RGD基因序列和桿狀病毒穿梭載體pFastBacDual的限制性酶 切位點，設計如下l對引物并委托上海生工公司進行合成引物F2: 5，-ggggcgcc tctctttggctgcctagtgag-3， (SEQIDNo.7),下劃線部分為EheI限制性酶切位點；引 物R2: 5，-ggctcgagttacagcttacgttttttgcg-3， ( SEO ID No.8 )，下劃線部分為XhoI限 制性酶切位點。
以pCRH-TOPO/HPV16Ll-RGD為模板、引物F2和引物R2為上下游引物 進行PCR, PCR反應條件為溫度94。C預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、 45。C退火30秒、72。C延伸2分鐘，共30個循環，最后72。C延伸4分鐘；PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、膠回收試劑盒切膠回收純化后，用Ehel和Xhol 進行雙酶切，再與同樣經Ehel和Xhol雙酶切的pFastBacDual ( sigma 7>司)進 行連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5a感受態細胞，用含有AMP的LB平板 篩選陽性克隆，將單個陽性克隆接種于含有AMP的LB液體培養基中，溫度37°C 振搖培養過夜后，用質粒小量提取試劑盒小量提取重組質粒，所得重組質粒用 Ehel和Xhol雙酶切法和PCR法進行鑒定，雙酶切法和PCR法均鑒定為陽性的 重組質粒委托上海生工公司對插入片段進行測序，測序結果顯示插入片段序列 與SEQ ID No.l所示序列一致，表明HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒穿梭載 體pFastBacDual/HPV16Ll-RGD構建成功。
(3) HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒的構建
將昆蟲細胞Sf-9 (北京北方偉業公司)用含有濃度為lOOmL/L的胎牛血清的TMN-FH培養基于溫度27。C培養，待細胞于培養皿中長至50~70%單層時， 采用BaculoGold轉染試劑盒(sigma公司)將pFastBacDual/HPV16L1-RGD與 BaculoGold DNA (線性桿狀病毒DNA)共轉染至Sf-9細月包中進行月包內同源重組 以構建HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒，轉染3天后，細胞病變率達到90% 以上，可見細胞核增大、胞質混濁、細胞變圓等重組桿狀病毒感染特征，收集 培養上清液作為病毒原液。
(4)病毒衣殼嵌合蛋白HPV16U-RGD的細胞內表達
將所得病毒原液以感染復數為5感染對數生長期的Sf-9細胞，溫度27。C培養3 天后，細胞出現明顯病變，收集細胞，用預冷的濃度為0.1mol/L、 pH值為7.4的 PBS重懸，超聲破壁，低速離心，將上清液轉移至盛有濃度為400g/L的蔗糖溶液 的離心管中，超速離心，棄上清，將沉淀用CsCl密度梯度超速離心，收集離心 管中浮密度為1.34g/mL的白色蛋白條帶，即得病毒衣殼嵌合蛋白^^161^1-RGD，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，在HPV16L1第266位和第267位氨基酸之 間插入了串聯的3個RGD肽。
2、病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的檢測 (1) RT-PCR檢測HPV16L1-RGD基因在昆蟲細胞內的轉錄
取感染HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒的Sf-9細胞，提取細胞總RNA進 行RT-PCR, PCR產物進行濃度為10g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所 示，其中M泳道為DNA分子量標準，1泳道為PCR產物，可見1泳道在約1600bp 處有一明顯的DNA條帶，與HPV16L1-RGD基因的預期大小一致；將PCR產 物切膠回收純化后，委托上海生工公司進行測序，測序結果顯示其序列與SEQ ID No.l所示序列一致，表明HPV16L1-RGD基因在Sf-9細胞內特異性轉錄。 (2 ) SDS-PAGE檢測HPV16L1-RGD基因在昆蟲細胞內的表達
取感染HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒的Sf-9細胞，與適量上樣緩沖液混 合后，煮30分鐘，用質量百分濃度為5%的濃縮膠、質量百分濃度為12.5°/。的分離 膠進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析，結果如圖2所示，其中M泳道為蛋白 質分子量標準，l泳道為感染HPV16Ll-RGD基因重組桿狀病毒的Sf-9細胞，2泳道為正常Sf-9細胞，可見l泳道在分子量約63kD處有一明顯的蛋白條帶，與 HPV16L1-RGD的預期分子量大小一致，而2泳道未見相應條帶，表明HPV16L1-RGD基因在Sf-9細胞內特異性表達。
(3 )透射電鏡檢測HPV16L1-RGD的自裝配能力
將HPV16L1-RGD溶液滴于200目銅網上，用質量百分濃度為1%的醋酸鈾溶 液負染后，置透射電鏡下觀察HPV16L1-RGD的形態，結果如圖3所示，可見 HPV16L1-RGD呈圓形顆粒樣結構，直徑約50nm，表明在缺乏其它病毒蛋白的情 況下，HPV16L1-RGD可以自裝配成VLP。
二、 Vasohibin基因重組真核表達載體的構建及檢測
1、 Vasohibin基因重組真核表達載體的構建
取手術切除的人脾臟組織，加入液氮充分研磨，再稱取100mg置無RNA酶 的離心管中，采用RNA提取試劑盒提:^Uk管內皮細胞總RNA。
根據GenBank登錄號為NM—014卯9的Vasohibin基因序列，設計如下1對 虧1物并委托上海生工乂>司進4亍合成引物F3: 5 ，-gcggccgcagatccccataccgagtgtg-3 ， (SEQ IDNo.10 )，下劃線部分為Notl酶切位點；引物R3: 5，-tctaga路gcctctttggtca tttcc-3， (SEQIDNo.il)，下劃線部分為Xbal酶切位點。
以血管內皮細胞總RNA為模板、引物F3和引物R3為上下游引物，采用 RT-PCR逆轉錄擴增試劑盒進行Vasohibin基因的逆轉錄和PCR擴增，PCR反應 條件為溫度95。C預變性10分鐘，然后溫度94。C變性1分鐘、58。C退火1分 鐘、72。C延伸4分鐘，共30個循環，最后溫度72。C延伸10分鐘；PCR產物經 瓊脂糖凝膠電泳鑒定、膠回收試劑盒切膠回收純化，即得Vasohibin基因。
將Vasohibin基因用Notl和Xbal (TaKaRa公司)進行雙酶切，再與同樣經 Notl和Xbal雙酶切的真核表達載體p3xFLAG-CMV-14 ( Sigma-Aldridi公司) 在T4 DNA連接酶作用下進行連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5a感受態細 胞，用含有AMP的LB平板篩選陽性克隆，將單個陽性克隆接種于含有AMP 的LB液體培養基中，在溫度37。C振搖培養12小時后，用質粒小量提取試劑盒小量提取重組質粒，所得重組質粒采用雙酶切法和PCR法進行鑒定，雙酶切法 和PCR法均鑒定為陽性的重組質粒委托上海生工公司對插入片段進行測序，測 序結果顯示在p3xFLAG-CMV-14的NotI和XbaI位點之間插入有與SEQ IDNo.9 所示核苷^列完全一致的DNA片段，表明Vasohibin基因重組真核表達載體 p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin構建成功。
取含有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的大腸桿菌DH5a，接種于含有AMP 的LB液體培養基中，在溫度37。C振搖培養過夜，待培養液的OD49。^值達到 1~1.5時，采用超純質粒抽提試劑盒(TIANGEN^^司)大量抽提重組質粒，所 得重組質粒用超純水溶解制成p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，用紫外分光光 度計測定純度和濃度，置溫度-20。C保存，備用。
2、 Western blot檢測Vasohibin基因重組真核表達載體的表達
將cos-7細胞用PRIM 1640培養液在溫度為37°C 、 C02氣體濃度為50 mL/L 的條件下培養24小時，待細胞融合率達到約80%時，采用脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000將p3xFLAG陽CMV-14/Vasohibin或p3xFLAG-CMV-14轉染入 cos-7細胞，轉染4小時后，將培養液更換為PRIM 1640培養液，繼續培養48 小時，收集細胞，用PBS洗滌并重懸，超聲裂解細胞，離心，收集上清液，用 His Bind蛋白純化試劑盒(Novage公司)純化Vasohibin;取純化蛋白溶液，采 用質量百分濃度為5%的濃縮膠、質量百分濃度為12.5。/o的分離膠進行SDS-PAGE, 電泳完畢后電轉印PVDF膜，洗膜封閉后加入兔抗小鼠Vasohibin單克隆抗體， 溫度37。C孵育1小時，洗膜后再加入羊抗兔IgG,溫度37。C孵育1小時，洗膜 后顯色，觀察。結果如圖4所示，其中1至3泳道為從p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin 轉染的cos-7細胞中提取純化的蛋白溶液，4泳道為從p3xFLAG-CMV-14轉染的 cos-7細胞中提取純化的蛋白溶液，可見1至3泳道在分子量約40 kD處均有一 明顯的蛋白條帶，與Vasohibin預期分子量大小一致，而4泳道未見相應條帶， 表明構建的p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin可以在真核細胞中正確表達Vasohibin。
三、基于Vasohibin基因的偽病毒的制備及檢測1 、基于Vasohibin基因的偽病毒的制備
將HPV16L1-RGD用濃度為0.1mol/L、 pH值為7.4的PBS溶解制成濃度為 lmg/mL的溶液，加入2-巰基乙醇至最終體積百分濃度為5%，溫度4。C反應16小 時使蛋白變性，再加入p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin 2mg，混勻后轉移至透析袋 中，在濃度為0.1mol/L、 pH值為7.4的PBS中于溫度4。C透析過夜，使變性蛋白逐 漸復性，在復性過程中HPV16Ll-RGD包裹p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin,自組裝 形成基于Vasohibin^因的偽病毒。
2、透射電鏡檢測基于Vasohibin^因的偽病毒的形態
將基于Vasohibin基因的偽病毒懸液滴于200目銅網上，用質量百分濃度為1% 的醋酸鈾溶液負染后，置透射電鏡下觀察其形態，結果如圖5所示，其中A為 HPV16L1-RGD， B為變性后的HPV16L1-RGD， C為基于Vasohibi逸因的偽病毒， 可見HPV16L1-RGD在變性前呈圓形顆粒樣結構，變性后解離成細小分子結構， 但能在PBS中逐漸復性，同時包裹p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin，又恢復為圓形 顆粒樣結構。
(二)基于Vasohibin基因的偽病毒抑制腫瘤細胞增殖、粘附、侵襲能力和 誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究 一、體外實驗
1、 MTT (thiazalylblue，瘞唑藍)比色法檢測基于Vasohibin基因的偽病毒抑 制腫瘤細胞增殖的能力
將處于指數生長期的正常細胞DC2.4或宮頸癌細胞Hela用含有濃度為 100g/L的新生牛血清的完全培養基制成細胞密度為1 x 106/mL的懸液，接種至 96孔板中，每孔100pL，分成兩組對照組和實驗組，每組設3個復孔，對照 組每孔加入完全培養液100pL;實-瞼組每孔加入濃度為1000(ig/mL的基于 VasoMbin基因的偽病毒懸液lOO^L;在溫度為37°C、 C02氣體濃度為50mL/L 的條件下培養72小時后，每孔再加入濃度為5 g/L的MTT 20pL，繼續培養4 小時后，吸去上清，每孔再加入二曱基亞砜150(iL，輕搖10分鐘，用酶標儀在波長490nm處測定各孔OD值，計算細胞增殖抑制率。
結果基于Vasohibin基因的偽病毒對DC2.4細胞的增殖抑制率為8%,對 Hela細胞的增殖抑制率為64%，表明本發明偽病毒能夠有效抑制腫瘤細胞的增 殖。
2、 MTT比色法檢測基于Vasohibin基因的偽病毒抑制腫瘤細胞粘附的能力 將基底膜Matrigel (BD公司)用無血清培養液稀釋制成濃度為1 (ig/(xL的溶
液，加至96孔板中，每孔8pL,溫度37。C孵育1小時，分成三組對照組、DC2.4 細胞組和Hela細胞組，每組設3個復孔，對照組每孔加入無血清培養液lOO[iL; DC2.4細胞組每孔加入濃度為1000jxg/mL的基于Vasohibin基因的偽病毒懸液 20^L和細胞密度為1 x 106/mL的DC2.4細胞懸液200jxL; Hela細胞組每孔加入 濃度為1000pig/mL的基于Vasohibin基因的偽病毒溶液20pL和細胞密度為1 x 10VmL的Hela細胞懸液200nL;溫度37。C振搖30分鐘后，每孔再加入無血清 DMEM培養基50pL和濃度為lmg/mL的MTT50^L，溫度37。C孵育4小時后， 每孔再加入二甲基亞石風lOO^L,輕搖10分鐘，用酶標儀在波長490nm處沖企測各 孔OD值，計算細胞粘附率。
結果DC2.4細胞的粘附率為87%， Hela細胞的粘附率為32%,表明本發 明偽病毒能夠有效抑制腫瘤細胞的粘附。
3、 Boyden小室法檢測基于Vasohibin基因的偽病毒抑制腫瘤細胞侵襲的能
力
取Boyden小室(麒麟醫用儀器公司)，在小室的上下室之間設置孔徑為8, 的微孔濾膜，膜表面鋪勻1 : 2稀釋的基底膜Matrigel，下室加入預先制備的 NIH3T3細胞培養上清液作為趨化因子，上室加入基于Vasohibin基因的偽病毒 懸液20|oL和細胞密度為1 x 106/mL的DC2.4或Hela細胞懸液200^L,在溫度 為37°C、 C02氣體濃度為50mL/L的條件下孵育6小時，棄去上室液體，取出微 孔濾膜，擦盡膜上Matrigd及未穿過的細胞，曱醛固定，蘇木素染色，顯微鏡 下觀察，隨機取5個高倍視野，計數每個視野內侵襲至濾膜背面的細胞數，結果以平均值表示。
結果侵襲至濾膜背面的DC2.4細胞數為6.4， Hela細胞數為2.3，表明本 發明偽病毒能夠有效抑制腫瘤細胞的侵襲。
4、流式細胞儀-Annexin V/PI雙染色法檢測基于Vasohibin基因的偽病毒誘 導腫瘤細胞凋亡的能力
將DC2.4或Hela細胞與基于Vasohibin基因的偽病毒懸液共培養48小時后， PBS洗滌，再加入濃度為250pg/mL的FITC標記的Annexin V 5^iL和濃度為250 |ig/mL的PI 5^L,冰浴避光孵育10分鐘，PBS洗滌，用FACS Calibur流式細胞 儀檢測細胞凋亡情況。
結果DC2.4細胞凋亡率為8.5%, Hela細胞凋亡率為42.7%,表明本發明 偽病毒能夠有效誘導腫瘤細^^的凋亡。
二、體內實驗
將荷瘤凈果鼠隨機分為三組對照組I、對照組II和實驗組，對照組I尾靜 脈注射生理鹽水；對照組II尾靜脈注射不含有RGD肽和Vasohibin基因重組真 核表達載體的偽病毒；實驗組尾靜脈注射基于Vasohibin基因的偽病毒；觀察60 天內各組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；取小鼠體內腫瘤組織， 行病理切片才企查，并用免疫組化方法才企測腫瘤新生血管密度(以抗CD31單克隆 抗體為 一抗)。
結果與對照組I和對照組II比較，實驗組小鼠生存率高，腫瘤生長緩慢 且腫瘤新生血管密度降低。
基于上述實驗結果，可得出如下結論本發明的基于Vasohibin基因的偽病 毒可以最大限度地逃避機體清除才幾制，專一性地;故肺瘤新生血管內皮細胞及肺 瘤細胞攝取，發揮同時抑制腫瘤血管生成和誘導肺瘤細胞凋亡的作用，大大提 高腫瘤治療的有效性和安全性，可以作為活性物質，單獨^_用或與其它具有藥 理活性的化合物和/或提取物組成復方使用，再與藥學上可接受的輔料按照藥學 領域的常規制劑方法制成各種劑型的抗腫瘤藥物，并通過適當途徑給藥，達到高效、安全地治療腫瘤的目的。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管 通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術 人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。序列 表
<110>中國人民解;^文軍第三軍醫大學
<120>基于Vasohibin基因的偽病毒及其制備方法和應用
<160> 11
<210> 1
<211> 1599
<212> 醒 <213>人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1599)
<220>
<223>人工序列的描述HPV16L1-RGD基因 <400> 1
tgt cgt act acc atc acc atc acc atc acg att acg ata tcc caa cga 48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp lie Pro Thr
15 10 15
ccg aaa acc tgt att ttc agg gcg cct etc ttt ggc tgc eta gtg agg 96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu
20 25 30
cca ctg tct act tgc etc ctg tcc cag tat eta agg ttg taa gca egg 144
Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr
35 40 45
atg aat atg ttg cac gca caa aca Ut att ate atg cag gaa cat ccet 192
Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn lie Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser
50 55 60
gac tac ttg cag ttg gac ate cct att ttc eta tta aaa aac eta aca 240
Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro lie Lys Lys Pro Asn
65 70 75 80
ata aca aag tat tag ttc eta aag tat cag gat tac aat aca ggg tat 288
Asn Asn Lys Val Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gin Tyr Arg Val
85 90 95tta gaa tac att tac ctg acc cca ata agt ttg gU ttc ctg aca cct 336
Phe Arg lie His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr
100 105 110
cat tU ata ate cag ata cac age ggc tgg Ut ggg cct gtg tag gtg 384
Ser Phe Tyr Asm Pro Asp Thr Gin Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly
115 120 125
ttg agg tag gtc gtg gtc age cat tag gtg tgg gca tta gtg gcc ate 432
Val Glu Val Gly Arg Gly Gin Pro Leu Gly Val Gly lie Ser Gly His
130 135 140
ctt tat taa ata aat tgg atg aca cag aaa atg eta gtg ctt atg cag 480
Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala
145 150 155 160
caa atg cag gtg tgg ata ata gag aat gta tat eta tgg att aca aac 528
Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys lie Ser Met Asp Tyr Lys
165 170 175
aaa cac aat tgt gtt taa ttg gtt gca aac cac eta tag ggg aac act 576
Gin Thr Gin Leu Cys Leu lie Gly Cys Lys Pro Pro lie Gly Glu His
180 185 190
ggg gca aag gat ccc cat gta cca atg ttg cag taa ate cag gtg att 624
Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp
195 200 205
gtc cac cat tag agt taa taa aca cag tta ttc agg atg gtg ata tgg 672
Cys Pro Pro Leu Glu Leu lie Asn Thr Val lie Gin Asp Gly Asp Met
210 215 220
ttg ata ctg get ttg gtg eta tgg act tta eta cat tac agg eta aca 720
Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gin Ala Asn
225 230 235 240
aaa gtg aag Uc cac tgg ata ttt gta cat eta ttt gca aat ate cag 768
Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp lie Cys Thr Ser lie Cys Lys Tyr Pro
245 250 255
att ata Ua aaa tgg tgt cag aac cat atg cgc ggc gac cgc ggc gac 816
Asp Tyr lie Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Arg Gly Asp Arg Gly Asp
260 265 270
cgc ggc gac aac aaa tgt ttg Ua gac att tat tta ata ggg ctg gtg 864
Arg Gly Asp Glu Gin Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly
275 280 285
ctg act ggg agt act egg ttg gtg aaa atg tac cag acg att tat aca 912
Ala Asp Trp Glu Tyr Ser Val Gly Glu Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr
290 295 300tta aag get ctg ggt eta ctg caa att tag cca gtt cga att att ttc 960
lie Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe
305 310 315 320
eta cac eta gtg gtt eta tgg tta cct ctg atg ccc aaa tat tea ata 1008
Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gin lie Phe Asn
325 330 335
aac ctt att ggt tac aac gag cac agg gcc aca ata atg gca ttt gtt 1056
Lys Pro Tyr Trp Leu Gin Arg Ala Gin Gly His Asn Asn Gly lie Cys
340 345 350
ggg gta acc aac tat ttg tta ctg ttg ttg ata eta cac gca gta caa 1104
Trp Gly Asn Gin Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr
355 360 365
ata tgt cat tat gtg c'tg cca tat eta ctt cag aaa eta cat ata aaa 1152
Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala lie Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys
370 375 380
ata eta act tta agg agt acc tac gac atg ggg agg aat atg att tac 1200
Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu
385 390 395 400
agt tta ttt .ttc aac tgt gca aaa taa cct taa ctg cag acg tta tga 1248
Gin Phe lie Phe Gin Leu Cys Lys lie Thr Leu Thr Ala Asp Val Met
405 410 415
cat aca tac att eta tga att cca eta ttt tgg agg act gga att ttg 1296
Thr Tyr lie His Ser Met Asn Ser Thr lie Leu Glu Asp Trp Asn Phe
420 425 430
gtc tac aac ccc ccc cag gag gca cac tag aag ata ctt ata ggt ttg 1344
Gly lxu Gin Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe
435 440 445
taa cat ccc agg caa ttg cU gtc aaa gac ata cac etc cag cac eta 1392
Val Thr Ser Gin Ala lie Ala Cys Gin Arg His Thr Pro Pro Ala Pro
450 455 460
aag aag ate ccc tta aaa aat aca ctt ttt ggg aag taa att taa agg 1440
Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys
465 470 475 480
aaa agt ttt ctg cag acc tag -ate agt ttc ctt tag gac gca aat ttt 1488
Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gin Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe
485 490 495
tac tac aag cag gat tga agg cca aac caa aat tta cat tag gaa aac 1536
Leu Leu Gin Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys
500 505 510gaa aag cta cac
Arg Lys Ala Thr 515
aaa aac gta age
Lys Lys Arg Lys 530
cca cca cct cat eta cct eta caa ctg eta aac Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys 520 525
tgt Leu
gca Arg
1584
1599
<210> 2
<211> 533
<212〉 PRT
<213〉 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD
<400> 2
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp lie Pro Thr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Ser Trp Leu Pro Ser Glu
20 25 30
Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr
35 40 45
Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn lie Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser
50 55 60
Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro lie Lys Lys Pro Asn 65 70 75 80
Asn Asn Lys Val Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gin Tyr Arg Val
85 90 95
Phe Arg lie His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr
100 105 110
Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gin Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly
115 120 125
Val Glu Val Gly Arg Gly Gin Pro Leu Gly Val Gly lie Ser Gly His
130 135 140
Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala 145 150 155 160
Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys lie Ser Met Asp Tyr Lys
165 170 175Gin Thr
Trp Gly
Cys Pro 210 Val Asp 225
Lys Ser
Asp Tyr
Arg Gly
Ala Asp 290 lie Lys 305
Pro Thr
Lys Pro
Trp Gly
Asn Met 370 Asn Thr 385
Gin Phe
Thr Tyr
Gly Leu
Val Thr 450 Lys Glu 465
Gin
Lys 195 Pro
Thr
Glu
lie
Asp 275 Trp
Gly
Pro
Tyr
Asn 355 Ser
Asn
lie
lie
Gin 435 Ser
Asp
Leu 180 Gly
Leu
Gly
Val
Lys 260 Glu
Glu
Ser
Ser
Trp 340 Gin
Leu
Phe
Phe
His 420 Pro
Gin
Pro
Cys
Ser
Glu
Phe
Pro 245 Met
Gin
Tyr
Gly
Gly 325 Leu
Leu
Cys
Lys
Gin 405 Ser
Pro
Ala
Leu
Leu
Pro
Leu
Gly 230
JLeu
Val
Met
Ser
Ser 310 Ser
Gin
Phe
Ala
Glu 390 Leu
Met
Pro
lie
Lys 470
lie
Cys
lie 215 Ala
Asp
Ser
Phe
Val 295 Thr
Met
Arg
Val
Ala 375 Tyr
Cys
Asn
Gly
Ala 455 Lys
Gly
Thr 200 Asn
Met
lie
Glu
Val 280 Gly
Ala
Val
Ala
Thr 360 lie
Leu
Lys
Ser
Gly 440 Cys
Tyr
Cys 185 Asn
Thr
Asp
Cys
Pro 265 Arg
Glu
Asn
Thr
Gin 345 Val
Ser
Arg
lie
Thr 425 Thr
Gin
Thr
Lys
Val
Val
Phe
Thr 250 Tyr
His
Asn
Leu
Ser 330 Gly
Val
Thr
His
Thr 410 lie
Leu
Arg
Phe
Pro
Ala
lie
Thr 235 Ser
Arg
Leu
Val
Ala 315 Asp
His
Asp
Ser
Gly 395 Leu
Leu
Giu
His
Trp 475
Pro
Val
Gin 220 Thr
lie
Gly
Phe
Pro 300 Ser
Ala
Asn
Thr
Glu 380 Glu
Thr
Giu
Asp
Thr 460 Glu
lie
Asn 205 Asp
Leu
Cys
Asp
Asn 285 Asp
Gly 190 Pro
Gly
Gin
Lys
Arg 270 Arg
Asp
Glu His
Gly Asp
Asp Met
Ala Asn 240 Tyr Pro 255
Gly Asp Ala Gly Leu Tyr
Ser Asn 'Tyr Phe 320
Gin lie Phe Asn 335
Asn Gly lie Cys 350
Thr Arg Ser Thr 365
Thr Thr Tyr Lys
Glu Tyr Asp Leu 400
Ala Asp Val Met 415
Asp Trp Asn Phe 430
Thr Tyr Arg Phe 445
Pro Pro Ala Pro
Val Asn乙eu Lys 480Glu Lys Phe
Leu Leu Gin
Arg Lys Ala 515
Lys Lys Arg 530
Ser Ala Asp Leu Asp Gin Phe Pro Leu G'ly Arg Lys Phe
485 490 495
Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys 500 505 510
Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg
520 525
Lys Leu
<210> 3
<211> 30
<212> 畫
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物Fl
<400> 3
agatctgcca ccatgtctct ttggctgcct
<210> 4
<211> 30
<212> 畫
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物Rl
<400> 4
atgtcgtact accatcacca tcaccatcac
<210> 5
<211> 28
<212> 畫
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述誘變引物Fm
30
30<楊> 5
aagctttUa tagatcacgt agttcgct 28
<210> 6
<211> 28
<212> 腿
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述"^秀變引物Rm
<400> 6
aactgctaaa gctagcaatt gtcagtta 28
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物F2
<400> 7
ggggcgcctc tctttggctg cctagtgag 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物R2
<楊> 8
ggctcgagtt acagcttacg ttttttgcg 29
<210> 9
<211> 1098
<212> DNA<213> 智人(homo sapiens)
<220〉
<221> CDS
<222> (1)…(1098)
<400> 9
atgccagggg
gcggccaccg
agagatgagg
tttgtcaacc
gtggccaaga
ctgcccaaga
cgcctggaag
ttctttgaaa
accaaagagg
aacagcatgc
tacttccgcc
agtcggcgcg
ctggacttcg
cagagcgtgt
gacgtggagc
atgcggctca
gatgtttctt
agacggccct
taccagatcc
ggaagaaggt ccccctctgg agccagaaga ggggtgggct tccaccccga tccccatacc ctgtgcagcg ttaagaagag ccctgccaat ccaccctgga acatcgtgct aggacctgat aggccgccta cacacgaccc gcctgggccg agattggcaa
CCCCgCELgCg
cgggtgacaa gggtctga
ggctgggggt ggtcaggcgt ggaaggggaa acctgtggat tggagagaag gagtgtgcct ctac"caga cagacctctg caaatgcctg gcgcttcccc
gggggtg￡L￡LC
gtacaagccg cggccgctgc gc織gcgtg cgatgacttc agggacgggc ggcccagtcc gaagacttcc
ggcagcagcg ttggagacca gaggacctgc gaggccacct gtggcgc獄 acgttccagc gagctgcagt acagggctga g,ccgtga atcagcttca ttcgcgggcc cccgccttcc tggcacgtgc gagcagatcg cgcaaggagc cctccctctc Etgcccccacc gagcccaaag
gtgccactcc gcgaaggaac gagacggagg gggaaaggat ggatccgtgg cgtctacacc acaatcacac tggacctggc tcctgggaat agacctactt gctacggtgc gcacgctcag tcaagaaggt agtggaagca tggagcgcca ccaccaagga
gC8LgggL隱g
ccatgccaga
aacgtccgct 60 ctcagcccag 120 cgtccccttc 180 gtggaaacac 240 ggccacagac 300 tgtccctgag 360 agggacacag 420 caaggaaatg 480 ttacctcacc 540 ctcagggaac 600 gctgggcatg 660 cgagctcgtg 720 gaagctgggc 780 ctcggtgctg 840 cgcccgcgac 900 ccggaagaag 960 ccgcagtgaa 1020 ccttaacggg 1080 1098
<210> 10
<211> 28
<212> DM
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物F3 <400> 10
gcggccgcag atccccatac cgagtgtg 28
<210> 11<211> 26
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物R3
<400> 11
tctagagggc ctctttggtc atttcc
權利要求
1、基于Vasohibin基因的偽病毒，其特征在于該偽病毒是由病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD包裹Vasohibin基因重組真核表達載體而得到的模擬天然病毒樣結構的物質；所述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD是在HPV16L1的第266位和第267位氨基酸之間插入RGD肽。
2、 根據權利要求1所述的基于Vasohibin基因的偽病毒，其特征在于所 述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3、 根據權利要求2所述的基于Vasohibin基因的偽病毒，其特征在于所 述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的編碼基因具有如SEQ ID No.l所示的核 苷酸序列。
4、 根據權利要求1所述的基于Vasohibin基因的偽病毒，其特征在于所 述Vasohibin基因重組真核表達載體含有核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的 Vasohibin基因。
5、 根據權利要求4所述的基于Vasohibin基因的偽病毒，其特征在于所 述Vasohibin基因重組真核表達載體采用p3xFLAG-CMV-14真核表達載體。
6、 權利要求1所述的基于Vasohibin基因的偽病毒的制備方法，其特征在 于包括以下步驟a、病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的構建HPV16L1-RGD基因重組載體的構建提取人宮頸癌細胞林Caski總RNA; 合成如下引物引物Fl具有SEQIDNo.3所示序列，引物Rl具有SEQ ID No.4 所示序列，誘變引物Fm具有SEQ ID No.5所示序歹'J ，誘變引物Rm具有SEQ ID No.6所示序列；以Caski細胞總RNA為模板進行HPV16L1基因的逆轉錄和重 疊延伸PCR法定點誘變，構建具有SEQ ID No.l所示序列的HPV16L1-RGD基 因；重疊延伸PCR法定點誘變包括兩輪PCR:第一輪PCR包括2個反應，以逆 轉錄所得HPV16L1 cDNA為模板，1個反應以引物F1和誘變引物Rm為上下游引物，制得含突變位點及其上游序列的片段DNAFRm;另1個反應以誘變引物 Fm和引物Rl為上下游引物，制得含突變位點及其下游序列的片段DNAFmR; 第 一輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后進行第二輪PCR, FRm 和FmR通過末端互補配對互為引物，延伸制得含突變位點及其上下游序列的全 長DNA FR即HPV16L1-RGD基因，再以FR為模板、引物F1和引物R1為上 下游引物進行擴增；第二輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后 即得HPV16L1-RGD基因；上述兩輪PCR的反應條件相同溫度94。C預變性5 分鐘，然后94。C變性1分鐘、45。C退火30秒、72。C延伸2分鐘，共30個循環， 最后72。C延伸4分鐘；將所得HPV16L1-RGD基因克隆入pCR-TOPO載體，再 轉化入大腸桿菌DH5a，用含有氨千青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取重組 質粒，采用單酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質粒并測序，測序結果顯示插入片 段序列與SEQ ID No.l所示序列一致者，即為構建成功的HPV16L1-RGD基因 重組載體pCRlI-T0P0/HPV16Ll-RGD;HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒穿梭載體的構建合成如下引物引物 F2具有SEQ ID No.7所示序列，引物R2具有SEQ ID No.8所示序列；以pCR II-TOPO/HPV16L1-RGD為模板、引物F2和引物R2為上下游引物進4亍PCR， PCR反應條件為溫度94。C預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、45。C退火30 秒、72。C延伸2分鐘，共30個循環，最后72。C延伸4分鐘；PCR產物經瓊脂糖 凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后，用限制性內切酶Ehel和Xhol進行雙酶切， 再與同樣經Ehel和Xhol雙酶切的桿狀病毒穿梭載體pFastBacDual進行連接， 連接產物轉化入大腸桿菌DH5a，用含有氨節青霉素的LB平板篩選陽性克隆， 提取重組質粒，采用雙酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質粒并測序，測序結果顯 示插入片段序列與SEQ ID No.l所示序列一致者，即為構建成功的HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒穿梭載體pFastBacDual/HPV16L1- RGD;HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒的構建將pFastBacDual/HPV16Ll-RGD 與線性桿狀病毒DNA共轉染至對數生長期的昆蟲細胞Sf-9中進行胞內同源重組，構建HPV16L1-RGD基因重組桿狀病毒，轉染3天后，收集培養上清液作 為病毒原液；病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD的細胞內表達將所得病毒原液感染對 數生長期的Sf-9細胞，溫度27。C培養3天后，收集細胞，用PBS重懸，超聲破 壁，低速離心，將上清液轉移至盛有濃度為400g/L的蔗糖溶液的離心管中，超 速離心，棄上清，將沉淀用CsCl密度梯度超速離心，收集離心管中浮密度為 1.34g/mL的白色蛋白條帶，即得具有SEQ ID No.2所示序列的病毒衣殼嵌合蛋 白HPV16L1-RGD;b、 Vasohibin基因重組真核表達載體的構建提取人脾臟組織血管內皮細胞總RNA;合成如下引物引物F3具有SEQ ID No.lO所示序列，引物R3具有SEQ ID No.ll所示序列；以人脾臟組織血管內皮 細胞總RNA為模板、引物F3和引物R3為上下游引物進行Vasohibin基因的逆 轉錄和PCR擴增，PCR反應條件為溫度95。C預變性IO分鐘，然后溫度94。C 變性1分鐘、58。C退火1分鐘、72。C延伸4分鐘，共30個循環，最后溫度72 。C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化目的片段， 即得Vasohibin基因；將所得Vasohibin基因用限制性內切酶Notl和Xbal進行雙 酶切，再與同樣經Notl和Xbal雙酶切的真核表達載體p3xFLAG-CMV-14進行 連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5a，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性 克隆，提取重組質粒，采用雙酶切法和PCR法鑒定陽性克隆質粒并測序，測序 結果顯示插入片段序列與SEQ ID No.9所示核苷酸序列完全一致者，即為構建成 功的Vasohibin基因重組真核表達載體p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin;取含有 p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的大腸桿菌DH5a,擴增培養，大量抽提重組質粒， 即得p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin;c、 基于Vasohibin基因的偽病毒的制備取步驟a所得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-RGD,加入變性劑使蛋白變性， 再加入步驟b所得Vasohibin基因重組真核表達載體p3xFLAG-CMV-14AVasohibin，于PBS中透析過夜，使變性蛋白逐漸復性，在復性過程中HPV16L1-RGD包裹 p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin,自組裝形成基于VasohibiiL&因的偽病毒。
7、權利要求1所述的基于Vasohibin基因的偽病毒在制備抗腫瘤藥物中的 應用。
全文摘要
本發明公開了一種基于Vasohibin基因的偽病毒及其制備方法和應用，該偽病毒是由病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-RGD包裹Vasohibin基因重組真核表達載體而得到的模擬天然病毒樣結構的物質，HPV16L1-RGD是在HPV16L1的第266位和第267位氨基酸之間插入RGD肽；該偽病毒的制備方法包括HPV16L1-RGD的構建、Vasohibin基因重組真核表達載體的構建、用HPV16L1-RGD包裹Vasohibin基因重組真核表達載體共3個步驟；該偽病毒可以最大限度地逃避機體清除機制，專一性地被腫瘤新生血管內皮細胞及腫瘤細胞攝取，發揮同時抑制腫瘤血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡的作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號C12N7/01GK101624581SQ20091010400
公開日2010年1月13日 申請日期2009年6月3日 優先權日2009年6月3日
發明者吳玉章, 曌 楊 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學