專利名稱：一種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法
技術領域：
本發明涉及包含酶或微生物的測定或檢驗方法，尤其是涉及一種聚合 酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法。
背景技術：
香蕉穿孔線蟲(及Wop/io/ttfW/m7/jThome， 1949)又名香蕉爛根病，是 危害香蕉、花卉種植業及很多經濟作物的專性寄生線蟲，寄主范圍非常廣 泛，危害造成的經濟損失極大，屬于主權國家禁止入境的植物檢疫危險性 有害生物。為有效防止香蕉穿孔線蟲進境，通常采用的現有檢疫、檢測和 鑒定方法是形態學方法、同工酶方法和聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)方法。形態學方法要求相關人員要有豐富的經驗， 并且由于香蕉穿孔線蟲存在種內變異，這種方法的檢疫、檢測和鑒定結果 往往準確率不高，所需要的時間與操作人員的經驗相關聯；同工酶方法只 能對雌蟲進行檢疫、檢測和鑒定，對幼蟲和雄蟲不能進行檢疫、檢測和鑒 定，而且所需要的時間長達一天左右；基于PCR的分子診斷方法可以基本 滿足香蕉穿孔線蟲的準確快速檢疫、檢測和鑒定要求，據有關文獻報導， 目前采用一對普通PCR引物擴增的檢疫、檢測和鑒定方法，仍然需要2 個多小時，而采用雙重PCR引物擴增的檢疫、檢測和鑒定方法，盡管只需 要54分鐘，但是增加了一對引物，相應提高了檢疫、檢測和鑒定的成本。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是彌補上述現有技術的不足，提出一種改 進的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法。
本發明的的技術問題采用以下技術方案予以解決
這種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，依次有以下步驟
1)合成引物，2)培養線蟲，3)提取核酸，4)擴增反應。
這種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法的特點是
所述步驟l)合成引物是先設計一對由特異性正向引物RS-F、特異性
反向引物Rs-R組成的一對特異性引物，再按照特異性正向引物Rs-F、特 異性反向引物Rs-R的序列合成特異性弓I物備用； 所述正向引物Rs-F的序列是-3';
所述反向引物Rs-R的序列是
5' - GGAAGTGACTCC緒GGCGCAATGTG-3'。
本發明的的技術問題采用以下進一步的技術方案予以解決 所述步驟2)培養線蟲是在胡蘿卜片上培養香蕉穿孔線蟲群體。 所述步驟3)提取核酸是依次有以下子步驟
3 1)將培養的線蟲群體或單條線蟲的幼蟲、成蟲或卵塊用滅菌水洗
兩次，離心后將線蟲轉移到1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入400W 包含200 mM的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS的提取緩沖液，在-80 'C放置30分鐘，用滅菌的碾棒將線蟲磨碎，在 65 'C孵育1.5小時；
3*2)加入200M1的pH5.2的3M醋酸鈉，在冰上放置20分鐘，然 后在4 。C下用轉速13000 ipm的離心機離心15分鐘，將上清液轉移至新 的1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入600W異丙醇混勻，在冰上放置30 分鐘，再次在4 'C下用轉速13000 rpm的離心機離心15分鐘；
3*3)用濃度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE緩沖液溶解沉淀， 提取線蟲群體基因組DNA。
所述步驟4)擴增反應是對大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系進行擴 增反應。
所述大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系包含5 W線蟲群體基因組 DNA模板、0.2 MM備用的特異性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR 緩沖液、2.0mMMgCl2 、 1.0UExTaqDNA聚合酶和余量的雙蒸水，總 共25W。
所述大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增反應是依次有以下子步驟 4* 1)在94 'C下預變性4min;
4'2)以94 'C下反應30 s、在56 'C下反應30s、在72 。C下反應45s 為一個反應區間，重復進行35次；
4'3)在72 'C下延伸反應10min，擴增反應結束后，取5W擴增產 物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙啶染色后在凝膠成像儀下觀察拍 照。
所述步驟4)擴增反應是對單條香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系進行擴 增反應。所述單條香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系包含10 Ml線蟲粗提液模板、 備用的特異性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR緩沖液、2.0 mM MgCl2 、 l.OUExTaqDNA聚合酶和余量的雙蒸水，總共25W。 所述單條香蕉穿孔線蟲的PCR擴增反應是依次有以下子步驟-4 1)在94 'C下預變性4min;
4 2)以94 。C下反應30 s、在56 'C下反應30s、在72 。C下反應45s 為一個反應區間，重復進行40次；
4*3)在72 'C下延伸反應10min,擴增反應結束后，取5W擴增產 物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙啶染色后在凝膠成像儀下觀察拍 照。
本發明與現有技術對比的有益效果是
線蟲的核酸提取方法提取效率高，提取的核酸純度高。操作人員無需 豐富的形態學知識和經驗，采用普通PCR擴增儀就可以使用本發明設計的 引物及方法，快速準確地對香蕉穿孔線蟲的幼蟲、雌蟲和雄蟲，甚至單條 香蕉穿孔線蟲的幼蟲、雌蟲和雄蟲進行檢疫、檢測和鑒定，反應時間可以 由現有普通PCR的2個多小時縮減為70分鐘，并且可以對單條香蕉穿孔 線蟲的幼蟲進行PCR擴增反應。
圖1是本發明具體實施方式
一的擴增反應的電泳結果示意圖； 圖2是本發明具體實施方式
二的擴增反應的電泳結果示意圖。
具體實施例方式
下面將結合具體實施方式
并對照附圖對本發明作進一步說明。
具體實施方式
一
一種聚合酶鏈反應檢測大量香蕉穿孔線蟲的方法，依次有以下步驟 1)合成引物
先設計一對由特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R組成的一 對特異性引物，再按照特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R的序 列合成特異性引物備用；
正向引物Rs-F的序列是
5' -CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3'; 反向引物Rs-R的序列是
5' - GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3';2) 培養線蟲
在胡蘿卜片上培養香蕉穿孔線蟲群體，還培養作為對照用的香蕉穿孔 線蟲近似種——穿刺短體線蟲群體；
3) 提取核酸依次有以下子步驟
3 1)將培養的線蟲群體的幼蟲、成蟲或卵塊用滅菌水洗兩次，離心 后將5W線蟲轉移到1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入400W包含200 mM 的pH8.0的Tris-HCl、 250mMNaCl、 25mMEDTA和P/。SDS的提取緩 沖液，在-80 'C放置30分鐘，用滅菌的碾棒將線蟲磨碎，在65 i:孵育1.5 小時；
3 2)加入200W的pH5,2的3M醋酸鈉，在冰上放置20分鐘，然 后在4 'C下用轉速13000 rpm的離心機離心15分鐘，將上清液轉移至新 的1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入600 Ml異丙醇混勻，在冰上放置30 分鐘，再次在4 'C下用轉速13000 rpm的離心機離心15分鐘；
3*3)用濃度70。/。的乙醇清洗沉淀，加入20WTE緩沖液溶解沉淀， 提取線蟲群體基因組DNA;
4) PCR擴增反應
PCR的擴增體系包含5W線蟲群體基因組DNA模板、0.2PM弓I物、 0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR緩沖液、2.0 mM MgCl2 、 1.0 U Ex Taq DNA 聚合酶和余量的雙蒸水，總共25W。
PCR擴增反應依次有以下子步驟
4 1)在94 'C下預變性4min;
4 2)以94 'C下反應30 s、在56 'C下反應30s、在72 "下反應45s 為一個反應區間，重復進行35次；
4.3)在72 'C下延伸反應10min,擴增反應結束后，取5W擴增產 物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙啶染色后在凝膠成像儀下觀察拍 照。
PCR擴增反應的電泳結果如圖1所示。圖1上方的1~11是泳道序號， 其中泳道l和泳道2是穿刺短體線蟲群體Psp.1、泳道3和泳道4是穿刺 短體線蟲群體Psp.2、泳道5是水對照，未出現指示發生擴增反應的條帶； 泳道6是香蕉穿孔線蟲群體RS1、泳道7是香蕉穿孔線蟲群體RS2、泳道 8是香蕉穿孔線蟲群體RS3、泳道9是香蕉穿孔線蟲群體RS4、泳道10 &§蕉穿孔線蟲群體RS5、泳道11是香蕉穿孔線蟲群體RS6,分別出現指示發生擴增反應的條帶，對應的核酸量為387bp。左側的六條帶分別代 表對應的核酸量M為100 bp、 250 bp、 500 bp、 750bp、 1000 bp和2000 bp。 圖1表明本發明方法檢測香蕉穿孔線蟲的準確率及靈敏度高。由正向引物 Rs-F、反向引物Rs-R組成的一對特異性引物具有很強的特異性，只針對香 蕉穿孔線蟲群體發生擴增反應，擴增需要的時間由現有普通PCR的2個多 小時縮減為70分鐘，擴增產物為387bp，而作為對照用的香蕉穿孔線蟲近 似種——穿刺短體線蟲群體均未發生擴增反應。
具體實施方式
二
一種聚合酶鏈反應檢測單條香蕉穿孔線蟲的方法，依次有以下步驟
1) 合成引物
先設計一對由特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R組成的一 對特異性引物，再按照特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R的序 列合成特異性引物備用；
正向引物Rs-F的序列是
5' -CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3'; 反向引物Rs-R的序列是
5' -GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3';
2) 培養線蟲
在胡蘿卜片上培養香蕉穿孔線蟲群體，還培養作為對照用的香蕉穿孔 線蟲近似種——穿剌短體線蟲群體；
3) 提取核酸依次有以下子步驟
3 1)將培養的單條線蟲的幼蟲、成蟲或卵塊分別用滅菌水洗兩次， 離心后將5M1線蟲轉移到1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入400W包含 200 mM的pH 8.0的Tris國HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS 的提取緩沖液，在-80 <€放置30分鐘，用滅菌的碾棒將線蟲磨碎，在65 °C 孵育1.5小時；
3*2)加入200W的pH5,2的3M醋酸鈉，在冰上放置20分鐘，然 后在4 'C下用轉速13000 rpm的離心機離心15分鐘，將上清液轉移至新 的1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入600 W異丙醇混勻，在冰上放置 30分鐘，再次在4 'C下用轉速13000rpm的離心機離心15分鐘；
3'3)用濃度70H的乙醇清洗沉淀，加入20WTE緩沖液溶解沉淀， 提取線蟲群體基因組DNA;4) PCR擴增反應
單條線蟲的PCR擴增體系包含10 W線蟲粗提液模板、0.4MM引物、 0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR緩沖液、2.0 mM MgCl2 、 1.0 U Ex Taq DNA 聚合酶和余量的雙蒸水，總共25W。
PCR擴增反應依次有以下子步驟
4. 1)在94 'C下預變性4min;
4'2)以94 'C下反應30 s、在56 'C下反應30s、在72 。C下反應45s 為一個反應區間，重復進行40次；
4*3)在72 'C下延伸反應10min，擴增反應結束后，取5W擴增產 物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙啶染色后在凝膠成像儀下觀察拍 照。
單條香蕉穿孔線蟲PCR擴增反應的電泳結果如圖2所示。圖2上方的 1 16是泳道序號，其中泳道16是水對照，未出現指示發生擴增反應的條 帶，泳道1~8,是香蕉穿孔線蟲的單條線蟲的二齡幼蟲、泳道9 12是香 蕉穿孔線蟲的單條線蟲的雌蟲、泳道13~15是香蕉穿孔線蟲的單條線蟲的 雄蟲泳道，分別出現指示發生擴增反應的條帶，對應的核酸量為387bp。 左側的六條帶分別代表對應的核酸量M為100 bp、 250 bp、 500 bp、 750bp、 1000 bp和2000bp。表明本發明方法比普通的PCR擴增靈敏度高，可以對 單條香蕉穿孔線蟲的幼蟲、雌蟲和雄蟲進行PCR擴增反應。
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說 明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明/發明構思的前提下做出若干等 同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，則應當視為屬于本發明由所提 交的權利要求書確定的保護范圍。
權利要求
1.一種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，依次有以下步驟1)合成引物，2)培養線蟲，3)提取核酸，4)擴增反應，其特征在于所述步驟1)合成引物是先設計一對由特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R組成的一對特異性引物，再按照特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R的序列合成特異性引物備用；所述正向引物Rs-F的序列是5′-CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3′；所述反向引物Rs-R的序列是5′-GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3′。
2. 如權利要求1所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，其特 征在于所述步驟2)培養線蟲是在胡蘿卜片上培養香蕉穿孔線蟲群體。
3. 如權利要求1或2所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法， 其特征在于所述步驟3)提取核酸是依次有以下子步驟3*1)將培養的線蟲群體或單條線蟲的幼蟲、成蟲或卵塊用滅菌水洗兩次，離心后將線蟲轉移到1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入400W 包含200 mM的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS的提取緩沖液，在-80 x:放置3o分鐘，用滅菌的碾棒將線蟲磨碎，在 65 'C孵育1.5小時；3 2)加入200 W的pH 5.2的3 M醋酸鈉，在冰上放置20分鐘，然 后在4 r下用轉速13000 rpm的離心機離心15分鐘，將上清液轉移至新 的1.5 ml的滅菌Eppendorf管中，加入600W異丙醇混勻，在冰上放置30 分鐘，再次在4 'C下用轉速13000rpm的離心機離心15分鐘；3'3)用濃度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE緩沖液溶解沉淀， 提取線蟲群體基因組DNA。
4. 如權利要求3所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，其特 征在于所述步驟4)擴增反應是對大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系進行擴 增反應。
5. 如權利要求4所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于-所述大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系包含5 W線蟲群體基因組 DNA模板、0.2 WVI備用的特異性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR 緩沖液、2.0mMMgCl2 、 l.OUExTaqDNA聚合酶和余量的雙蒸水，總 共25Ml。
6. 如權利要求4所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于所述大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增反應是依次有以下子步驟4*1)在94 'C下預變性4 min;4*2)以94 。C下反應30 s、在56 。C下反應30s、在72 'C下反應45s 為一個反應區間，重復進行35次；4*3)在72 。C下延伸反應10min，擴增反應結束后，取5 14擴增產 物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙啶染色后在凝膠成像儀下觀察拍 昭。"、、o
7. 如權利要求3所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，其特 征在于所述步驟4)擴增反應是對單條香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系進行擴 增反應。
8. 如權利要求7所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，其特 征在于-所述單條香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系包含10 W線蟲粗提液模板、 0.4WVI備用的特異性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR緩沖液、2.0 mM MgCl2 、 1.0UExTaqDNA聚合酶和余量的雙蒸水，總共25W。
9. 如權利要求7所述的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，其特 征在于所述單條香蕉穿孔線蟲的PCR擴增反應是依次有以下子步驟 4' 1)在94 'C下預變性4min;4'2)以94 。C下反應30 s、在56 。C下反應30s、在72 。C下反應45s 為一個反應區間，重復進行40次；4'3)在72 "C下延伸反應10min，擴增反應結束后，取5W擴增產 物在1,5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙啶染色后在凝膠成像儀下觀察拍
全文摘要
一種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，特異性引物由正向引物Rs-F、反向引物Rs-R組成，正向引物的序列是5′-CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3′；反向引物的序列是5′-GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3′。線蟲的核酸提取方法提取效率高，提取的核酸純度高。操作人員無需豐富的形態學知識和經驗，采用普通PCR擴增儀，就可以使用本發明設計的引物及方法，快速準確地對香蕉穿孔線蟲的幼蟲、雌蟲和雄蟲，甚至單條香蕉穿孔線蟲的幼蟲、雌蟲和雄蟲進行檢疫、檢測和鑒定，反應時間可以縮減為70分鐘，并且可以對單條香蕉穿孔線蟲的幼蟲進行PCR擴增反應。
文檔編號C12Q1/68GK101633959SQ20091010823
公開日2010年1月27日 申請日期2009年6月17日 優先權日2009年6月17日
發明者彭德良, 李一農, 李芳榮, 海 龍 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心