專利名稱：EBV-DNA酶肽抗原ELISA法檢測EBV-DNA酶IgA抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種酶肽抗原ELISA法檢測EBV-DNA酶IgA抗體，特別是涉及一種篩 選和優化組合EBV-DNA酶肽抗原，驗證優選的酶肽抗原檢測EBV-DNA酶IgA的特異性和靈 敏度，并建立EBV-DNA酶肽抗原ELISA技術檢測血清或血漿中EBV-DNA酶IgA抗體的方法， 應用于鼻咽癌的篩查和輔助診斷。
背景技術：
鼻咽癌(NPC)是發生于鼻咽部上皮細胞的惡性腫瘤，最常見于中國南方(如廣東、 廣西、湖南、福建等省)和東南亞的一些國家，全世界80%以上的鼻咽癌發生在中國南方。 早期診斷是提升癌癥治愈率的關鍵，但由于早期臨床癥狀不明顯，且缺乏好的早期診斷指 標和篩查技術， 一般確診時鼻咽癌都為晚期。 鼻咽癌的早期診斷對患者的治療效果、預后判斷極為重要。多年來，人們對NPC的 早期診斷方法進行了大量研究。血清EA-IgA、 VCA-IgA檢測因其易行已成為目前常用的血 清學診斷方法，但存在一定程度的假陽性和假陰性。大量報道EBV-DNA酶的出現提示EBV 處于病毒的增殖周期，其在受染機體內的含量高低直接反映病毒復制的活躍程度，鼻咽癌 血清樣本中含有高滴度的EBV-DNase抗體，EBV-DNA酶可用于鼻咽癌的早期診斷。目前，檢 測EBV-DNase抗體主要是同位素中和法，此法操作繁瑣，且有同位素污染，不易推廣。
發明內容
本發明的目的在于提供一種EBV-DNA酶肽抗原ELISA法檢測EBV-DNA酶IgA抗體， 應用本發明作為鼻咽癌篩查手段，早期發現鼻咽癌，早期治療，有助于鼻咽癌的愈后。
本發明公開了一種以EB病毒DNA酶(EBV-DNase)蛋白的優選肽抗原作為包被抗 原ELISA法檢測EBV-DNA酶IgA抗體的技術。該優選的EBV-DNA酶肽抗原包含的氨基酸 序列是EBV-Dnase-7 (序列ATCTLGSDLL LDASVEIPVA)和EBV-Dnase-8 (序列VLVTPVCLPD SIVRKELNTA)。該EBV-Dnase_7和EBV-Dnase_8多肽最佳包被濃度為200ng : lOOng混合 包板。 本發明還提供了一種ELISA法檢測血清或血漿中EBV-DNA酶IgA抗體方法是用優 選的以EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8為序列合成的混合肽抗原建立的，該檢測方法包括以 下步驟 1)包被用0. 05M ra9. 6的碳酸鹽包被緩沖液將多肽稀釋至蛋白質含量為1 lOii g/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0. lml，4。C過夜； 2)封閉次日，棄去孔內溶液，再每孔加入3% BSA[BSA粉劑為SIGMA，溶于 0. Olmol/L PBS(pH 7. 2-7. 4)中，]200ii 1，37。C，孵育1小時；
3)洗滌 ①手工倒掉反應孔中的液體，用稀釋后的清洗液(配方見表2所示)洗4次，每 次每孔300ul ;或者是
②洗板機程序設定為稀釋后的清洗液洗4次，每次每孔300ul ;
4)加樣將標準品、陽性對照、陰性對照以及按1 : 100與樣本稀釋液稀釋之后的 待檢樣品加入反應孔中，并做空白對照(即加100ul樣本稀釋液稀釋)，100u1/孔，置37°C ， 孵育1小時； 5)洗滌同上; 6)加酶標抗體于各反應孔中，加入酶標抗體，lOOul/孔，置37t:，孵育1小時； 7)再次清洗清洗6次，方法同上； 8)加底物液顯色于各反應孔中加入底物A(含過氧化氫)溶液50ul，底物B(含
TMB)溶液50ul，輕搖混勻，置于陰暗處，15分鐘； 底物A為體積百分比濃度為0. 6%過氧化氫溶液， 底物B配方以10mg TMB(四甲基聯苯胺)溶于lml DMSO(二甲基亞砜)中作為原 液，并按照如下方式配制 上述原液 lml
0. IMol/L的Na2HP04-NaH2P04緩沖液 57. 5ml
0. 2mol/L枸櫞酸緩沖液 42.5ml 9)終止反應于各反應孔中加入2M硫酸0. 05ml，輕搖混勻，置5分鐘； 10)測OD值在酶標儀(Thermo公司)上，于450nm波長測0D值。借由上述技術方案，本發明一種EBV-DNA酶肽抗原ELISA法檢測EBV-DNA酶IgA
抗體至少具有的有益效果是操作簡便，沒有污染，成本低，易推廣，便于大規模操作；應用
本發明作為鼻咽癌篩查手段，早期發現鼻咽癌，早期治療，有助于鼻咽癌的預后。
圖1為用Kyte&Doalittle軟件對EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的進行抗原決 定簇分析示意圖。 圖2為用OHM軟件對EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的進行抗原決定簇分析示意 圖。 圖3為用OHM軟件對EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的進行抗原決定簇分析示意 圖。 圖4為用EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8混合多肽檢測300份鼻咽癌病人血清和 300份正常人血清得出的OD值的ROC曲線圖。
具體實施例方式
我們對EB病毒特異性DNA酶(EBV-DNase)抗體的檢測進行了改進，篩選和優化組 合了 EBV-DNA酶肽抗原，驗證了優選的酶肽抗原檢測EBV-DNA酶IgA的特異性和靈敏度，并 建立了 EBV-DNA酶肽抗原ELISA技術檢測血清或血槳中EBV-DNA酶IgA抗體的方法，用于 鼻咽癌的篩查和輔助診斷。其中，實驗中所用的血清來源于中山大學腫瘤醫院。
1.優選EBV-DNA酶的抗原肽 首先，用EMBOSS P印info/P印window/P印stats軟件對Epstein-Barr virus (EBV) DNase進行抗原性分析。然后，根據抗原性分析挑選以上三種軟件算法分析蛋白抗原性相同的肽，長度為40aa。合成多肽，用ELISA檢測法檢測病理確診的鼻咽癌病人和正常人血 清，優選出只與鼻咽癌病人血清反應，不與正常人血清反應或與正常人血清發生弱反應的 多肽。 2.ELISA柃測法 ELISA法檢測血清EBV-DNA酶抗體的方法，按照以下步驟進行用合成的優選 Epstein-Barr virus (EBV) DNase抗原肽包被ELISA板，BSA封閉后，加入待檢血清，血清 中的EBV-DNA酶抗體可與優選Epstein-Barr virus (EBV) DNase抗原肽結合，洗去雜質， 加入HRP標記的抗人IgA，形成Epstein-Barr virus (EBV)DNase抗原肽抗EBV-DNA酶抗 體-HRP-抗人IgA復合物，洗滌后，加入TMB顯色，酶標儀檢測。
結果判斷 按以下公式計算對照血清或患者樣本吸光度值和標準品吸光度值的比值 比值=對照或患者樣本吸光度值_空白對照吸光度值/兩個標準品吸光度值的平
均值-空白對照吸光度值 按以下方法解釋結果 比值> 1. 2 陽性 比值> 1. 0但< 1. 2 可疑 比值< 1. 0 陰性 定性結果判定采用ELISA結果判定標準，即SCO判定方法(Cut-off值判定方 法)。測定值大于或等于1. 2倍的Cut-off值為陽性(真陽性率99% )，測定值位于1. 2 倍的Cut-off值和1. 0 (包含1. 0)倍的Cut-off值之間為可疑陽性，測定值小于1. 0倍的 Cut-off值為陰性(真陰性率99% )。 Cut-off值的確定用SPSS軟件的ROC方法分析用本法大樣本量(正常人血清和 病理確診的鼻咽癌病人血清各300份)檢測所得出的0D值，獲得R0C曲線圖和cutoff值， 以Cutoff值上下0. 005范圍內的樣本血清混合后作為標準血清。
— .查看Epstein-Barr virus (EBV) DNase氨基酸序列
1MADVDELEDP MEEMTSYTFA RFLRSPETEA FVRNLDRPPQ MPAMRYVYLYCLCKQIQEFS
61GETGFCDFVS SLVQENDSQD GPSLKSIYWG LQAATDEQRT VLCSYVESMTRGQSENL麗D
121ILRNGIISSS KLLSTIKNGP TKVFEPAPIS TNHYFGGPLA FGLRCEDTVKDIVCKLICGD
181ASANRQFGFM ISPTDGIFGV SLDLCVNVES QGDFILFTDR SCIYEIKCRFKYLFSKSEFD
241PIYPSYTALY KRPCKRSFIR FINSIARPTV EYVPDGRLPS EGDYLLTQDEAWNLKDVRKR
301KLGPGHDLVA DSLAANRGVE SMLYVMTDPS ENAGRIGIKD RVPVNIFINPRHNYFYQVLL
361QYKIVGDYIR HSGGGKPGRN CSPRVNIVTA FFRKRSPLDP ATCTLGSDLLLDASVEIPVA
421VLVTPVCLPD SIVRKELNTA AGSWKAYADD TFDTAPWVPS GLFA
二 . Epstein-Barr virus (EBV) DNase抗原性分析用EMBOSS P印info/P印window/P印stats軟件分析(如下圖1 3所示)
圖1 :用Kyte&Doalittle軟件對EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的進行抗原決定 簇分析示意圖。 圖2 :用OHM軟件對EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的進行抗原決定簇分析示意 圖。
圖3 :用Consensus軟件對EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的進行抗原決定簇分 析示意圖。 上述圖1 3的縱坐標為親水性參數，橫坐標為EBV-DNase的1_470氨基酸序列， 峰值越高，表示親水性越好。挑選三種軟件分析相同的親水性片段作為候選肽抗原。
三.Epstein-Barr virus (EBV) DNase抗原肽挑選(根據抗原性分析挑選)，挑選原 則挑選三種算法分析蛋白抗原性相同的肽，長度為40aa。
8個肽序列在全長中的位置(用下劃線標屮,)
1MADVDELEDP MEEMTSYTFA RFLRSPETEA FVRNLDRPPQ MPAMRYVYLYCLC腿QEFS 61GETGFCDFVS SLVQENDSQD GPSLKSIYWG LQAATDEQRTVLCSYVESMT RGQSENL麗D 121ILRNGIISSS KLLSTIKNGP TKVFEPAPIS TNHYFGGPLA FGLRCEDTVKDIVCKLICGD
181ASANRQFGFM ISPTDGIFGV SLDLC麗ES QGDFILFTDR SCIYEIKCRFKYLFSKSEFD 241PIYPSYTALY KRPCKRSFIR FINSIARPTV EYVPDGRLPS EGDYLLTQDEAWNLKDVRKR 301KLGPGHDLVA DSLAANRGVE SMLYVMTDPS ENAGRIGIKDRVPVNIFINP RHNYFYQVLL 361QYKIVGDYIR HSGGGKPGRN CSP扁IVTA FFRKRSPLDP ATCTLGSDLLLDASVEIPVA 421VLVTPVCLPD SIVRKELNTA AGSWKAYADD TFDTAPWVPS GLFA
質譜鑒定，肽序列正確。 五.以上合成的多肽診斷NPC的篩選
1. 標本(中山大學腫瘤醫院提供) 正常人血清和病理確診的鼻咽癌病人血清各300份
2. 方法分別用ELISA檢測(具體操作如下)
i)包被用o. 05M rag. 6的碳酸鹽包被緩沖液將多肽稀釋至蛋白質含量為1 在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0. lml，4。C過夜。
分別編號
EBV--D皿se--i41MPAMRYVYLY CLCKQIQEFS60
EBV--D皿se--261GETGFCDFVS SLVQENDSQD80
EBV--D皿se--3121ILRNGIISSSKLLSTIKNGP140
EBV--D皿se--4191ISPTDGIFGVSLDLC麗ES210
EBV--D皿se--5306DLVADSLAANRGVESMLYVM325
EBV--D皿se--6361QYKIVGDYIRHSGGGKPGRN380
EBV--D皿se--7401ATCTLGSDLLLDASVEIPVA420
EBV--D皿se--8421VLVTPVCLPDSIVRKELNTA440四.分別按以上序列合成多肽(上海強耀生物科:
10 li g/ml< 2)封閉次日，棄去孔內溶液，再每孔加入3% BSA[BSA粉劑為SIGMA，溶于
0. Olmol/L PBS(pH 7. 2-7. 4)中，PBS配方見表1所示]200ii 1，37"C，孵育1小時。 表1PBS配方 0. Olmol/L PBS(pH 7. 2-7. 4) 0. 2mol/L NaH2P04 19ml ; 0. 2mol/L Na2HP04 81ml ; NaCl 17g ;
蒸餾水至 2000ml
3)洗滌(可以任選以下一種方式) ①手工倒掉反應孔中的液體，用稀釋后的清洗液(配方見表2所示)洗4次，每 次每孔300u ; ②洗板機程序設定為稀釋后的清洗液洗4次，每次每孔300ul。(每次清洗時清洗液在反應孔中至少保留30-60秒，然后再倒掉。清洗完后將微孔
板在濾紙上拍干)。(簡稱洗滌，下同)。 表2清洗液配方(即PBS-T)0. 01mol/L PBS(pH 7. 2-7. 4) 2000ml TWEN-20 2ml 4)加樣將標準品、陽性對照、陰性對照以及按1 : IOO與樣本稀釋液(配方見附 表3所示)稀釋之后的待檢樣品加入反應孔中，并做空白對照(即加100ul樣本稀釋液稀
釋)，looul/孔，置;3rc，孵育i小時。(標準品平行做兩孔)表3樣本稀釋液(100ml)
:0099] BSA lg
:0100] Triton x_100 lOOul
:0101] PBS-T至 100ml
:0102] 5)洗滌同上 6)加酶標抗體于各反應孔中，加入酶標抗體，100ul/孔，置37t:，孵育1小時。
7)再次清洗清洗6次，方法同上。 8)加底物液顯色于各反應孔中加入底物A(含過氧化氫)溶液50ul，底物B(含
TMB)溶液50ul，輕搖混勻，置于陰暗處，15分鐘。 底物A為體積百分比濃度為0. 6%過氧化氫溶液， 底物B配方以10mg TMB(四甲基聯苯胺)溶于lml DMSO(二甲基亞砜)中作為原 液，并按照如下方式配制上述原液lml0. 1Mol/L的Na2HP04--NaH2P04緩沖液57. 5ml0. 2mol/L枸櫞酸緩沖液42. 5ml9)終止反應于各反應孔中加入2M硫酸0. 05ml，輕搖混勻，置5分鐘
10)測0D值在酶標儀(Thermo公司)上，于450nm波長測0D值。
3、所得數據用SPSS軟件分析，結果如下表(表4)Cutoff值靈敏度;)特異性(％)EBV-Dnase-l肽抗原0. 20375. 081. 2EBV-Dnase-2肽抗原0. 31146. 353. 9EBV-Dnase-3肽抗原0. 18958. 779. 6EBV-Dnase-4肽抗原0. 40666. 390. 2EBV-Dnase-5肽抗原0. 35680. 577. 9EBV-Dnase-6肽抗原0. 25649. 688. 4EBV-Dnase-7肽抗原0. 29782. 985. 5
EBV-Dnase-8肽抗原 0.312 83.3 88.6 4、由上述表4可見EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽最為合適。
Cutoff值為判定陰陽性的臨界值。 靈敏度也叫陽性檢出率，表示在確診為有病者中檢測為陽性者所占的比例。 特異性也叫真陰性率，表示在確診為正常人中檢測為陰性者所占的比例。 判斷EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8最為合適的標準是在保證靈敏度較高的情況
下，特異性也較高。 六、⑦和⑧多肽混合檢測 1、將EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽按200ng : lOOng(每個反應孔)混合包 板按以上方法實驗(具體方法同五.2)。 2、所得數據用SPSS軟件分析，得出結果(如下圖4所示)
Cutoff值 靈敏度(％) 特異性(％) 混合肽抗原 0.297 86.3 87.5 圖4為用EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽檢測300份鼻咽癌病人血清和300份 正常人血清得出的0D值的ROC曲線。 由圖4可知，以EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8混合多肽為包被抗原檢測人血清中 EBV-DNA酶IgA抗體，對病人既有較高的檢出率(即靈敏度高)，同時對正常人也有較高的 排除率(即特異性高)。 七.因此，我們可以用⑦和⑧多肽混合檢測血清，以得出的Cutoff值來為鼻咽癌
篩查和輔助診斷提供檢測依據。 具體判斷方法如下 為了減少操作過程中的誤差，我們選出經檢測吸光度在Cutoff值上下O. 005范圍 內的樣本作為標準品。 按以下公式計算對照血清或患者樣本吸光度值和標準品吸光度值的比值 比值=對照或患者樣本吸光度值/兩個標準品吸光度值的平均值 按以下方法解釋結果 比值>1.2 陽性 比值>1.0但<1.2 可疑 比值<1.0 陰性 定性結果判定采用ELISA結果判定標準，即SCO判定方法(Cut-off值判定方 法)。測定值大于或等于1. 2倍的Cut-off值為陽性(真陽性率99% )，測定值位于1. 2 倍的Cut-off值和1. 0 (包含1. 0)倍的Cut-off值之間為可疑陽性，測定值小于1. 0倍的 Cut-off值為陰性(真陰性率99% )。 Cut-off值的確定用SPSS軟件的ROC方法分析用本法大樣本量(正常人血清和 病理確診的鼻咽癌病人血清各300份)檢測所得出的0D值，獲得R0C曲線圖和cutoff值， 以Cutoff值上下0. 005范圍內的樣本血清混合后作為標準血清。
序列表 〈110〉廣州市搏克生物技術有限公司 〈120>EBV-DNA酶肽抗原ELISA法檢測EBV-DNA酶IgA抗體0149]〈160>2
0150]〈210>1
0151]〈211>20
0152]〈212>PRT
0153]〈213〉人工序列
0154]〈400>1
0155]Ala Thr Cys ThrLeu
0156]15
0157]Glu lie Pro ValAla
0158]20
0159]〈210〉2
0160]〈211>20
0161]〈212>PRT
0162]〈213〉人工序列
0163]〈400〉2
:0164]Val Leu Val ThrPro
:0165]15
:0166]Glu Leu Asn ThrAla
:0167]20
Ser Asp Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val 10 15
Cys Leu Pro Asp Ser lie Val Arg Lys 10 1權利要求
一種EBV-DNA酶肽抗原EBV-Dnase-7，其特征在于，該EBV-Dnase-7的氨基酸序列組成如下ATCTLGSDLL LDASVEIPVA。
2. —種EBV-DNA酶肽抗原EBV-Dnase-8，其特征在于，該EBV-Dnase-8的氨基酸序列組 成如下VLVTPVCLPD SIVRKELNTA。
3. —種EBV-DNA酶肽抗原，其特征在于其包括權利要求1所述的EBV-DNA酶肽抗原 EBV-Dnase-7以及權利要求2所述的EBV-DNA酶肽抗原EBV-Dnase_8。
4. 根據權利要求3所述的EBV-DNA酶肽抗原，其特征在于EBV-Dnase-7和 EBV-Dnase-8多肽最佳包被濃度為200ng :100ng混合包板。
5. —種ELISA法檢測血清或血槳中EBV-DNA酶IgA抗體方法，其特征在于其是用優 選的以EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8為序列合成的混合肽抗原建立的，該檢測方法包括以 下步驟1) 包被用0. 05M 6的碳酸鹽包被緩沖液將多肽稀釋至蛋白質含量為1 10 ii g/ ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0. lml，4。C過夜；2) 封閉次日，棄去孔內溶液，再每孔加入3% BSA[BSA粉劑為SIGMA，溶于0. Olmol/L PBS(pH 7. 2-7. 4)中，]200ii 1，37。C，孵育1小時;3) 洗滌:① 手工倒掉反應孔中的液體，用稀釋后的清洗液(配方見表2所示)洗4次，每次每 孔300ul ;或者是② 洗板機程序設定為稀釋后的清洗液洗4次，每次每孔300Ul ;4) 加樣將標準品、陽性對照、陰性對照以及按1 :100與樣本稀釋液稀釋之后的待檢樣品加入反應孔中，并做空白對照(即加100ul樣本稀釋液稀釋)，飾1/孔，置37t:，孵育1 小時；5) 洗滌同上；6) 加酶標抗體于各反應孔中，加入酶標抗體，100u1/孔，置37t:，孵育1小時；7) 再次清洗清洗6次，方法同上；8) 加底物液顯色于各反應孔中加入底物A溶液50ul，底物B(含TMB)溶液50ul，輕 搖混勻，置于陰暗處，15分鐘其中，底物A為體積百分比濃度為0. 6%過氧化氫溶液，底物B配方以10mg TMB(四甲基聯苯胺)溶于lml DMSO( 二甲基亞砜)中作為原液， 并按照如下方式配制上述原液 lml 0. 1Mol/L的Na2HP04_NaH2P04緩沖液57. 5ml 0. 2mol/L枸櫞酸緩沖液 42. 5ml9) 終止反應于各反應孔中加入2M硫酸0. 05ml，輕搖混勻，置5分鐘；10) 測OD值在酶標儀上，于450nm波長測OD值。
6. 權利要求1至4中任一權利要求所述的EBV-DNA酶肽抗原在制備鼻咽癌診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明是關于一種以EB病毒DNA酶(EBV-DNase)蛋白的優選肽抗原作為包被抗原ELISA法檢測EBV-DNA酶IgA抗體的技術。該優選的EBV-DNA酶肽抗原包含的氨基酸序列是EBV-Dnase-7(序列ATCTLGSDLL LDASVEIPVA)和EBV-Dnase-8(序列VLVTPVCLPD SIVRKELNTA)。該EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽最佳包被濃度為200ng∶100ng混合包板。
文檔編號C12N9/22GK101748105SQ200910193358
公開日2010年6月23日 申請日期2009年10月27日 優先權日2009年10月27日
發明者劉萬里, 宋立兵, 曾木圣 申請人:廣州市搏克生物技術有限公司