一種多價ezh2腫瘤相關抗原肽及其制備
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學領域。具體而言，本發明涉及多價EZH2腫瘤相關抗原肽。本發明 還涉及編碼所述抗原肽的分離的核酸，包含所述核酸的構建體和載體，以及包含所述核酸 的宿主細胞。本發明還涉及所述抗原肽的制備方法和其在制備藥物組合物或疫苗中的用 途。
【背景技術】
[0002] EZH2是多梳蛋白家族的重要成員，它與其它3個亞基(EED、SUZ12和RbAp46/48) - 道共同組成多梳蛋白抑制性復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)。作為PRC2 的核心亞基，EZH2具有組蛋白甲基轉移酶活性，在維持細胞增殖、干細胞自我更新和調節細 胞周期中發揮重要作用，并通過與組蛋白去乙酰化酶(HDACs)和DNA甲基轉移酶(DWTs)協 同作用使抑癌基因表達沉默，由此促進腫瘤發生以及侵襲轉移。人EZH2基因由20個外顯子 和19個內含子構成，編碼由746個氨基酸殘基構成的蛋白分子(Margueron R等人，Nature， 469(7330) :343-349(2011) ;Vire E等人，Nature,439(7078) :871-874(2006))。近年來研究 發現，EZH2是一種腫瘤相關抗原，能作為腫瘤標志物在不同的腫瘤組織中高表達，且其表達 水平與腫瘤的惡性程度高度正相關，由此EZH2正在成為抗腫瘤免疫治療的新靶點 (Benetatos L等人，Cell Mol Life Sci，71(2):257-269(2014);Chang CJ等人，Br J Cancer，106(2):243-247(2012);Crea F等人，Crit Rev Oncol Hematol,83(2):184-193 (2012) ;Wan L等人，Clin Transl Oncol ,15(2) :132-138(2013) ;Goe BP等人，Plos One,8 (8):e71670(2013) ;Hajosi-Kalcakosz S等人，Diagn pathol ,7:86(2012))。已經在EZH2蛋 白一級結構中鑒定出多個可作為腫瘤相關抗原的肽段，包括4&120-128 4&165-1744&243-245，Aa291-299，Aa666-674，Aa699-708，Aa735-742等。重要的是這些腫瘤相關抗原肽在體 內能誘導產生抗腫瘤抗體并激活特異性T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷活性，提示EZH2在抗 腫瘤免疫治療中的重要應用價值(Ogata R等人，Prostate,60(4) :273-281(2004) ;Steele JC等人，Bri J Cancer，95(9):1202-1211(2006);Komohara Y等人，J Urol ,177(3) :1157-1162(2007);Itoh Y等人，Oncol R印，18(5):1231-1237(2007))〇
[0003] 由于短肽(如氨基酸序列長度在30aa以下）的原核表達通常存在表達量低，純化困 難，免疫原性差等問題，為了獲得高純度EZH2腫瘤相關抗原肽，本發明選取4條已經鑒定的 EZH2 腫瘤相關抗原肽(Aal20-128，Aal65-174，Aa291-299，Aa735-742)，利用基因重組技術 在原核表達系統中人工設計與合成了含有上述4種EZH2腫瘤抗原肽的小分子融合蛋白（稱 之為多價EZH2腫瘤相關抗原肽），其保留了 EZH2的抗原特征，能在動物體內誘導特異性抗體 生成。
【發明內容】
[0004] 在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、生物化學、 免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發 明，下面提供相關術語的定義和解釋。
[0005] 根據本發明，術語"免疫原性（immunogenicity)"是指，能夠刺激機體形成特異抗 體或致敏淋巴細胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分 化，最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的特性，也指抗原刺激機體后，機體免疫 系統能形成抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答。免疫原性是抗原最重要的性質，一種 抗原能否成功地誘導宿主產生免疫應答取決于三方面的因素:抗原的性質、宿主的反應性 和免疫方式。
[0006] 根據本發明，術語"免疫原性片段"是指這樣的多肽片段，其至少部分地保留了所 源自的蛋白的免疫原性。
[0007] 根據本發明，4條EZH2腫瘤相關抗原肽為Aal20-128，Aal65-174，Aa291-299和 △ &735-742<^&120-128的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其對應的編碼核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示;Aal65-174的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，其對應的編碼核苷酸序列如 SEQIDN0.4所示;Aa291-299的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示，其對應的編碼核苷酸序列 如SEQIDN0.6所示 ;Aa735-742的氨基酸序列如SEQIDN0.7所示，其對應的編碼核苷酸序 列如SEQ ID N0.8所示。
[0008] 在本發明中，術語"多肽"和"蛋白質"具有相同的含義，可互換使用。并且在本發明 中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表 不。
[0009] 根據本發明，術語"大腸桿菌表達系統"是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達 系統，其中大腸桿菌（菌株）來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于:GI698，ER2566， BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)〇
[0010] 根據本發明，術語"載體(vector)"是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運 載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以 通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。 載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于:質粒;噬菌體;柯斯質粒等等。
[0011]根據本發明，術語"藥學可接受的載體和/或賦形劑"是指在藥理學和/或生理學上 與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的（參見例如Remington ' s Pharmaceutical Sciences . Edited by Gennaro AR,19th ed. Pennsylvania:Mack Publ ishing Company，1995)，并且包括但不限于:pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增 強劑。例如，pH調節劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液;表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離 子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80;離子強度增強劑包括但不限于氯化鈉。
[0012] 根據本發明，術語"佐劑"是指非特異性免疫增強劑，當其與抗原一起或預先遞送 入機體時，其可增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型。佐劑有很多種，包括但不 限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁）、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑）、短小棒狀 桿菌、脂多糖、細胞因子等。弗氏佐劑是目前動物試驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在 臨床實驗中使用較多。
[0013] 將兩種或更多種蛋白融合表達以形成融合蛋白的技術是本領域公知的（參見例 如，J . Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及 F.Μ. Ausube 1等人，精編分子生物學實驗指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995)。通常， 通過使用重組DNA技術將編碼兩種或更多種蛋白的DNA片段符合讀框地連接在一起，并進行 蛋白質表達來獲得融合蛋白。任選地，可使用或不使用接頭來將兩種或更多種蛋白融合表 達。
[0014] 根據本發明，術語"接頭"是指用于連接兩個分子(例如蛋白）的短肽。通常，通過將 編碼該短肽的多核苷酸序列引入(例如，通過PCR擴增或連接酶)分別編碼所要連接的兩種 目的蛋白的兩個DNA片段之間，并進行蛋白質表達來獲得融合蛋白，例如目的蛋白1-接頭_ 目的蛋白2。如本領域技術人員公知的，接頭包括但不限于柔性連接肽，例如61 7-617-617-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 等等。
[0015] 根據本發明，術語"有效量"是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如， 預防疾病(例如腫瘤)有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病(例如腫瘤）的發生的量;治 療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發癥的量。 測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力范圍之內。例如，對于治療用途有效的量 將取決于待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如 年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。
[0016] 本發明至少部分基于發明人如下