專利名稱：一種食品級釀酒酵母重組質粒的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及一種食品級釀酒酵母重組質粒的制 備方法及其應用。
背景技術：
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表達系統是最早建立的酵母表達系統， 自1981年Hitzeman等首次在釀酒酵母中表達了人α干擾素(Hitzeman，R. Aet al.， Expression of a human gene for interferon in yeast. Nature293 :717-722,1981)， 陸續有上百個外源基因在釀酒酵母中成功表達，其中數十個已作為基因工程藥物上市。雖 然總體表達水平相對畢赤酵母低，但釀酒酵母表達某些外源基因也可達到克級/升的水平 (如釀酒酵母表達黑曲霉葡萄糖氧化酶達到9g/L，Park EH et al. ,Expression of glucose oxidase by usingrecombinant yeast. J Biotechnol 81 :35-44, 2000),遠高于哺乳云力物 細胞表達系統。釀酒酵母易生長，可以實現高密度發酵(菌體干重可達80-200g/L)，使重 ^1 ! ，會賣^feftl (Schmidt F. R. ,Recombinant expressionsystems in the pharmaceutical industry, Appl MicrobiolBiotechnol，65 :363-372, 2004)。而且釀酒酵 母具有其獨特優勢首先釀酒酵母是一種食品級酵母，培養過程中無內毒素，安全性好，已 被美國藥品與食品管理局(FDA)認定為安全型微生物，而畢赤酵母發酵過程需添加有毒的 甲醇，大規模發酵需要特殊的防爆(explosion-proof)裝置；其次釀酒酵母存在高效同源 重組機制，且全基因組序列早在1996年就測定完畢，遺傳背景清楚，遺傳操作十分方便。因 此釀酒酵母表達系統是一種理想的安全型表達系統。目前已建立了多種釀酒酵母表達載體，其中整合型(YIp)和附加體型(YEp)載 體使用最多。整合型載體沒有自主復制序列(ARS)，而是被整合到酵母細胞基因組上，這 類載體的優點是穩定性好，基因不易丟失，但拷貝數較低，有可能影響基因表達量。附加 體型載體具有來自釀酒酵母天然質粒2 μ復制子(Ori)序列，能夠在酵母細胞內自主復 制，附加體型載體具有很高的轉化效率和拷貝數，但在非選擇性培養條件下不穩定，傳代 時質粒易丟失(Malissard M. et al.，Theyeast expression system for recombinant glycosyltransferases. Glycoconjugate Journal 16 :125-139，1999)。載體穩定性、 拷貝數、啟動子、信號肽等因素都會影響釀酒酵母表達系統的效率。研究者通過對各影 響因素的調整優化，增強釀酒酵母系統表達外源重組蛋白能力，取得了不錯的效果，如 Sleep D.等研究發現一種編碼E2泛素連接酶的基因UBC4突變后，明顯促進釀酒酵母細 胞內2μ質粒拷貝數提高并促進重組人血清白蛋白(rHA)分泌表達(Sle印D.et al., Yeast 2microm plasmid copy number is elevated by a mutationin the nuclear gene UBC4. Yeast 18(5) :403_21，2001)，而一種天冬氨酸蛋白酶基因YAP3敲除后能夠 減少分泌的rHA蛋白降解，從而提高產量(Kerry-Williams SM et al.，Disruption of the Saccharomyces cerevisiaeYAP3gene reduces the proteolyt ic degradat ion of secreted r e c omb i η an t human albumin. Yeast 14(2) :161_9，1998)。
現有的釀酒酵母表達載體(如hvitrogen公司的pYES2系列載體和Mratagene 公司的pESC系列載體)一般為穿梭質粒，即具有大腸桿菌質粒的復制子序列和抗藥性基 因，能夠在細菌細胞內增殖，所需表達的外源基因通過酶切、連接方式克隆于上述穿梭型的 表達載體上，然后轉化釀酒酵母細胞。這樣存在于酵母細胞內的外源基因表達質粒或者整 合于染色體上的外源基因表達單元均包含了大腸桿菌質粒序列和抗藥基因序列，導致整個 發酵系統存在一定的污染隱患。
發明內容
本發明的目的在于提供一種制備安全、高效的釀酒酵母重組質粒的方法。釀酒酵母細胞內存在著較其他生物更為高效的同源重組機制，兩個DNA分子間 只要有30-50bp長的同源區段就可以準確、有效地進行同源重組(Bhatia PKet al.，DNA repair and transcription. Curr Opin Genet. Dev. 6 146-150，1996)。本發明利用釀酒 酵母這一特點，構建了兩種載體，一是克隆載體I^x-RH，該載體多克隆位點前后分別為酵 母啟動子和終止子元件，外源基因通過多克隆位點克隆于該載體，形成有酵母啟動子-外 源基因開放閱讀框-酵母終止子組成的外源基因表達盒；二是酵母-大腸桿菌穿梭載體 pHR-Px，該載體由釀酒酵母2μ質粒完整序列、釀酒酵母營養缺陷篩選基因、與克隆載體相 同的酵母啟動子1^、終止子元件以及在大腸桿菌中繁殖所需的大腸桿菌質粒復制子、氨芐 青霉素抗性基因序列構成。克隆載體和酵母穿梭載體經限制性內切酶作用，可以分別將各 自的大腸桿菌質粒序列和抗藥性基因序列去除，所得到外源基因表達盒與酵母載體片段共 轉化宿主釀酒酵母，在釀酒酵母細胞內通過同源重組機制形成外源基因的酵母表達質粒， 該表達質粒完全沒有大腸桿菌質粒序列和抗藥性基因序列，只能夠在釀酒酵母細胞內生 存，不會轉移。本發明提供了一種食品級釀酒酵母重組質粒的制備方法，該方法包括如下步驟(1)構建含有酵母2 μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子和酵母 終止子的穿梭質粒酵母載體部分；(2)構建含有酵母啟動子、酵母終止子和目標外源基因的外源基因表達盒；(3)將(1)獲得的穿梭質粒酵母載體部分與( 獲得的外源基因表達盒共轉化相 應營養缺陷型釀酒酵母菌株，在營養缺陷選擇性培養基上篩選培養轉化子；(4)分離純化獲得包含酵母2μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動 子、酵母終止子和目標外源基因的釀酒酵母重組質粒。釀酒酵母天然質粒2 μ復制子(Ori)序列，能夠在酵母細胞內自主復制。酵母營養缺陷篩選基因與營養缺陷型釀酒酵母菌株相對應，主要為了篩選轉化 子。所述的酵母啟動子是酵母菊粉酶基因啟動子、TEFl基因啟動子、ADHl基因啟動 子、ADH2基因啟動子、GAPDH基因啟動子、GALl基因啟動子、GALlO基因啟動子中的任意一 種，或者其中兩種及兩種以上啟動子的融合啟動子。所述的酵母終止子是菊粉酶基因終止子、CYCl基因終止子、TEFl基因終止子、 ADHl基因終止子中的一種或者幾種。所述的酵母營養缺陷篩選基因是LEU2、ADE2、URA3、TRP1或者HIS3中的一種或者4幾種。所述的目標外源基因可以是各種蛋白的編碼基因，例如菊粉酶基因、TEFl基因、 ADHl基因或者ADH2基因，等等。步驟(1)中所述的穿梭質粒含有大腸桿菌質粒復制子、抗生素抗性基因、釀酒酵 母2μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子和酵母終止子的序列，切除大腸 桿菌質粒復制子和抗生素抗性基因，獲得穿梭質粒酵母載體部分。可以利用克隆載體構建外源基因表達盒。克隆載體含有酵母啟動子、多克隆位點 區和酵母終止子。例如，以PAG61質粒為基礎，構建含有酵母啟動子、多克隆位點區和酵母 終止子的克隆載體I3x-RiK圖1)。外源基因通過多克隆位點區克隆于I3X-RH載體，限制性 內切酶酶切獲得由酵母啟動子1^、外源基因開發閱讀框和酵母終止子組成的外源基因表達品.ο酵母-大腸桿菌穿梭載體構建以完整的酵母2μ質粒序列為基礎，構建含有酵母 營養缺陷篩選基因、酵母啟動子I3X和酵母終止子元件的穿梭質粒pHR-Px(圖幻，酵母啟動 子與終止子元件間為大腸桿菌質粒復制子(Ori)和氨芐青霉素抗性基因(Ap1O序列，大 腸桿菌質粒復制子和氨芐青霉素抗性基因序列通過酶切可與穿梭載體上的酵母基因序列 分離。去除了大腸桿菌質粒復制子和氨芐青霉素抗性基因序列的穿梭載體pHR-Px片段 與外源基因表達盒共轉化營養缺陷型釀酒酵母菌株，在營養缺陷選擇性培養基上篩選獲得 外源基因表達工程菌。工程菌中外源基因表達盒與穿梭載體PHR-Px片段通過同源重組形 成外源基因表達質粒，該表達質粒沒有非酵母基因序列和抗藥性基因序列(除需表達的外 源基因序列外)。本發明提供了一種釀酒酵母重組質粒，該重組質粒含有酵母2 μ質粒完整序列、 酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子、酵母終止子和目標外源基因。該釀酒酵母重組質粒可以通過以下方法制備分別構建酵母2 μ質粒完整序列、 酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子、目標外源基因和酵母終止子的DNA片段，然后將其依 次連接。本發明提供了一種酵母-大腸桿菌穿梭質粒，該穿梭質粒含有酵母終止子、釀酒 酵母2 μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子、大腸桿菌質粒復制子和抗生 素抗性基因的序列，上述各部分依次連接，大腸桿菌質粒復制子和抗生素抗性基因兩側均 有酶切位點。本發明還提供了一種食品級的釀酒酵母菌株，該菌株含有上述釀酒酵母重組質 粒。制備釀酒酵母菌株的步驟如下克隆載體構建以pAG61質粒為基礎，構建含有酵母啟動子、多克隆位點區和酵母終止子的克隆 載體I^x-RH (圖1)外源基因表達盒構建外源基因通過多克隆位點區克隆于Px-RH載體，限制性內切酶酶切獲得由酵母啟 動子1^、外源基因開發閱讀框和酵母終止子組成的外源基因表達盒。
酵母-大腸桿菌穿梭載體構建以完整的酵母2 μ質粒序列為基礎，構建含有酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動 子和酵母終止子元件的穿梭質粒pHR-Px(圖幻，酵母啟動子I3X與終止子元件間為大腸 桿菌質粒復制子(Ori)和氨芐青霉素抗性基因(Ap1O序列，大腸桿菌質粒復制子和氨芐青 霉素抗性基因序列通過酶切可與穿梭載體上的酵母基因序列分離。工程菌構建去除了大腸桿菌質粒復制子和氨芐青霉素抗性基因序列的穿梭載體pHR-Px片段 與外源基因表達盒共轉化營養缺陷型釀酒酵母菌株，在營養缺陷選擇性培養基上篩選獲得 外源基因表達工程菌，工程菌中外源基因表達盒與穿梭載體PHR-Px片段通過同源重組形 成外源基因表達質粒，該表達質粒沒有非酵母基因序列和抗藥性基因序列(除需表達的外 源基因序列外)。具體說明如下1、克隆載體I3X-RH構建(l)pAG61質粒經Notl酶切，電泳回收含有大腸桿菌質粒復制子Ori和氨芐青霉素 抗性基因Apr序列的DNA片段；(2)以兩端含有限制性內切酶位點的引物分別PCR擴增酵母啟動子及終止子序 列，限制性內切酶分別酶切酵母啟動子、終止子PCR產物；(3)分別合成多克隆位點區的正反鏈單鏈，變性退火形成多克隆位點雙鏈序列，兩 端分別含有與酵母啟動子&序列3’粘端、酵母終止子序列5’粘端互補的粘端；(4)大腸桿菌質粒復制子和氨芐青霉素抗性基因序列與酶切后的酵母啟動子、酵 母終止子以及多克隆位點雙鏈連接，轉化大腸桿菌DH5 α，對形成的轉化子進行PCR篩選鑒 定，PCR陽性轉化子抽取質粒，測序鑒定，獲得克隆載體I^x-RH。Px-RH載體具有大腸桿菌質 粒復制子、氨芐青霉素抗性基因篩選標記、酵母啟動子、多克隆位點區和酵母終止子元件。2、外源基因表達盒構建需表達的外源基因開發閱讀框(ORF)經PCR特異擴增、限制性內切酶酶切，與經過 同樣限制性內切酶酶切處理的I3X-RH載體連接，外源基因插入I^x-RH載體多克隆位點區，形 成的質粒具有酵母啟動子I3X-外源基因ORF-酵母終止子組成的外源基因表達盒，然后轉化 大腸桿菌DH5 α，對轉化子中的重組質粒進行PCR、測序鑒定。重組質粒經Notl酶切，電泳 回收與大腸桿菌質粒復制子、氨芐青霉素抗性基因序列分離的外源基因表達盒。3、酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-I^x構建pHCll載體(劉軼婷等，在雜合啟動子控制下乙肝病毒表面抗原SA-觀融合基因在 酵母中的表達及調控，復旦學報，37 (4) =399-444,1998)酶切，電泳回收包括酵母2 μ質粒 完整序列和酵母營養缺陷篩選基因Leu2的8. 7kb片段、與中間插入了大腸桿菌復制子Ori 和氨芐青霉素抗性基因Apr序列的酵母啟動子和酵母終止子連接，轉化大腸桿菌DH5 α， 對轉化子中的重組質粒進行PCR、測序鑒定，得到pHR-Px穿梭載體。4、工程菌構建酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Px經Mel、Sail雙酶切，電泳，回收去除了大腸桿 菌質粒復制子Ori和氨芐青霉素抗性基因Af序列的載體片段，該載體片段均為酵母基因 序列，與外源基因表達盒一起利用醋酸鋰法共轉化LEU2基因突變的釀酒酵母菌株，在缺少6亮氨酸(leucine)的SD選擇性培養基(SD-Leu)上篩選轉化子，PCR鑒定轉化子中克隆于 表達質粒的外源基因，選擇PCR陽性轉化子作為工程菌進行外源基因表達試驗。本發明還提供了上述制備方法的應用，其中所述的目標外源基因是菊粉酶基因， 利用含有菊粉酶基因的釀酒酵母重組質粒發酵培養，表達獲得菊粉酶。本發明的載體均為市售或者根據文獻報道。如非特別指出，均可采用本領域常規 的操作方法。例如，按照冷泉港實驗室的《分子克隆》、《抗體》、《細胞》，以及《冷泉港實驗室 實驗方案》等通用的實驗手冊。本發明利用釀酒酵母的高效同源重組機制，制備了一種含有酵母2 μ質粒完整序 列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子、酵母終止子和目標外源基因釀酒酵母重組質粒。 該表達質粒中，除需表達的外源基因序列外，沒有非酵母基因序列，只能夠在釀酒酵母細胞 內生存，不會轉移。本發明所產生的釀酒酵母表達質粒充分發揮了釀酒酵母食品級微生物 的優勢，安全、高效，可以廣泛的用于表達各種外源基因。
圖1 克隆載體I3X-RH。圖2 酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Px。圖3 重組菊粉酶基因表達酵母質粒pHR-INU。圖4 釀酒酵母工程菌發酵液中重組菊粉酶酶活測定結果。
具體實施例方式實施例1 克隆載體Pinu-RH構建(l)pAG61質粒Notl酶切，電泳回收大腸桿菌質粒復制子(Ori)-氨芐青霉素抗性 基因(Ap1O部分，堿性磷酸酶處理去磷。(2)以克魯維酵母 Kluyveromyces cicerisporus CBS4857 基因組 DNA 為模板，以 Pl和P2為引物PCR擴增菊粉酶基因(GenBank登入號AF178979，序列如SEQ. ID. NO 13, Wen Τ. Q. , Cloning and analysis of the inulinase gene fromKluyveromyces cicerisporus CBS4857, World Journal of Microbiology &Biotechnology 19 :423-426,2003),GenBank 登入號為AF17897。)啟動子Pinu片段。以釀酒酵母S^Sc基因組DNA為模板，以P3和P4 為引物PCR擴增CYCl基因(S⑶登入號YJR048W)終止子Tcyc片段。按照各個片段設計的 酶切位點進行相應的限制性內切酶酶切處理。所用的4條引物的核苷酸序列如下克隆菊粉酶基因啟動子Pinu兩條引物序列是Pl :5，AG GCGGCGC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA3，(SEQ NO l)NotlP2 :5，ACMGCTT ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3，(SEQ NO 2)HindIII克隆CYCl終止子Tcyc兩條引物序列是P3 5' ATACTAGTGTCATGTAATTAGTTATGTCACGC(SEQ NO 3) SpelP4 :5，AGCGGCCGCGGTACCGGCCGCAAATTAAA (SEQ NO 4) Notl(3)構建多克隆位點區(MCS)分別合成MCS正反鏈P5、P6，經T4磷酸激酶作用磷酸化，變性退火形成MCS雙鏈，兩端分別為HindIII、Spel粘性末端。MCS正反鏈序列是P5 :5’ AGCTTGATATCGAGCTCCCGGGATCCAGCTGGGCCCGTCGACA (SEQ NO 5)P6 :5’ CTAGTGTCGACGGGCCCAGCTGGATCCCGGGAGCTCGATATCA (SEQ NO 6)(4)pAG61質粒Ori-Aplr片段、菊粉酶基因啟動子Pinu酶切產物、CYCl基因終止子 Tcyc和MCS雙鏈進行多片段連接、轉化大腸桿菌DH5 α，PCR鑒定轉化子，陽性轉化子抽取 質粒，測序鑒定，得到克隆載體Pinu-RH。實施例2 穿梭載體PHR-Pinu構建(l)pHCll載體Bgl I、Sal雙酶切，回收8. 71Λ大片段(包含完整2 μ質粒序列和 Leu2基因序列)，Klenow酶處理補平。(2)引物P7和P8PCR擴增菊粉酶基因啟動子Pinu,引物P9和PlOPCR擴增CYCl 基因終止子！"eye。Pinu PCR產物經EcoRl、BamHl雙酶切處理，iTcyc PCR產物經BamHl、 HindIII雙酶切處理，Pinu、Tcyc酶切片段與經過HindIII、EcoRl雙酶切處理的質粒pSP72 連接，轉化大腸桿菌DH5 α，PCR和測序鑒定，得到pSP72-Pinu-TCyC質粒。(3)pSP72-Pinu-Tcyc 質粒 BamHl 單酶切線性化，Klenow 酶補平，與(1)中 pHCll 酶切片段(8. 7kb)連接，轉化大腸桿菌DH5 α，PCR鑒定陽性轉化子，抽提質粒，測序確證，得 到酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Pinu。所用的4條引物核苷酸序列如下克隆菊粉酶基因啟動子Pinu兩條引物序列P7 :5， ATGGATCCGCGGCCGC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA (SEQ NO 7)BamHlP8 :5，ACGAATTCGTCGAC ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT(SEQ NO 8)EcoRl Sail克隆CYCl終止子Tcyc兩條引物序列P9 :5， TG AAGCTTGAGCTC TCATGTAATTAGTTATGTCACGCTT (SEQ NO 9)HindIII SaclPlO :5， ATGGATCCGCATGCGGTACCGGCCGCAAATTAAAG (SEQ NO 10)BamHl實施例3 菊粉酶基因表達盒構建以克魯維酵母 Kluyveromyces cicerisporus CBS4857 基因組 DNA 為模板，引 物Pll和P12PCR擴增菊粉酶基因開放閱讀框ORF，PCR產物經HindIII、Sail雙酶切后， 與同樣經過Hindlll、Sail雙酶切的Pinu-RH載體連接轉化大腸桿菌DH5 α，PCR鑒定 轉化子，抽提陽性轉化子重組質粒，測序鑒定，得到菊粉酶基因克隆于Pinu-RH載體MCS 區的重組質粒，該重組質粒具有Pirm啟動子-菊粉酶基因-Tcyc終止子組成的菊粉酶 基因表達盒(Pin-hu-Tcyc)，重組質粒經Notl酶切，電泳分離、回收菊粉酶基因表達盒 (Pin-Inu-Tcyc)。菊粉酶基因開放閱讀框ORF克隆引物Pll :5’ TGAAGCTTATGAAGTTAGCATACTCCCTCTTG(SEQ NO 11) HindIIIP12 :5’ CAGTCGACTTGTTCGTTAGTAAAGTAAGCCCA(SEQ NO 12) Sail
實施例4 分泌表達菊粉酶釀酒酵母工程菌構建及菊粉酶活性測定(1)酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Pinu經限制性內切酶&iCl、Sall雙酶切，去除 PSP72載體片段(大腸桿菌復制子Ori和氨芐青霉素抗性基因Af序列)，回收酵母載體部 分，與菊粉酶基因表達盒(Pin-INU-Tcyc) —起采用醋酸鋰法共轉化釀酒酵母菌株Y16 (劉 軼婷等，在雜合啟動子控制下乙肝病毒表面抗原SA-觀融合基因在酵母中的表達及調控， 復旦學報，37 (4) =399-444,1998)，轉化子涂布SD-Leu選擇性培養基，穿梭載體pHR-Pi nu 的酵母載體部分與菊粉酶基因表達盒在酵母細胞內發生同源重組，形成菊粉酶基因酵母表 達質粒pHR-hu(圖幻。挑選轉化子進行菊粉酶基因PCR鑒定，PCR陽性轉化子即為表達菊 粉酶的重組釀酒酵母工程菌。(2)工程菌接種于SD-Leu液體培養基中，30°C 250rpm培養22小時后，按照5% (ν/ν)比例接種與30ml YEPD培養基中，30°C 250rpm培養120小時，每隔24小時取樣測定 發酵液中菊粉酶酶活。具體結果如圖4所示，可見菊粉酶能達到約56U/ml。這說明，本發明獲得的重組表 達質粒系統能較高效表達外源基因。序列表<210>1<211>33<212>DNA<213>Artificial<400>1aggcggcgca aaacgacaag agaagcaaac aca33<210>2<211>35<212>DNA<213>Artificial<400>2acaagcttat ctaacaaaaa aaaaattaaa tgtgt35<210>3<211>32<212>DNA<213>Artificial<400>3atactagtgt catgtaatta gttatgtcac gc32<210>4<211>29<212>DNA<213>Artificial<400>4agcggccgcg gtaccggccg caaattaaa29
<210>5<211>43<212>DNA<213>Artificial<400>5agcttgatat cgagctcccgggatccagctgggcccgtcg aca<210>6<211>43<212>DNA<213>Artificial<400>6ctagtgtcga cgggcccagctggatcccgggagctcgata tea<210>7<211>40<212>DNA<213>Artificial<400>7atggatccgc ggccgcaaaacgacaagagaagcaaacaca<210>8<211>41<212>DNA<213>Artificial<400>8acgaattcgt cgacatctaaCSLSLSLSLSLSLSLSLSLattaaatgtg t<210>9<211>39<212>DNA<213>Artificial<400>9tgaagcttga gctctcatgtaattagttatgtcacgctt<210>10<211>35<212>DNA<213>Artificial<400>10atggatccgc atgcggtaccggcc gcaaat taaag<210>11<211>32<212>DNA434340413935100158]<213>Artificial0159]<400>110160]tgaagcttat gaagttagca tactccctct tg0161]<210>120162]<211>320163]<212>DNA0164]<213>Artificial0165]<400>120166]cagtcgactt gttcgttagt aaagtaagcc ca0167]<210>130168]<211>33250169]<212>DNA0170]<213>Artificial0171]<400>1332320172]gaattctcaaaccgaaatggggcgttgttttaccccaggtatccggttgtagttggcact600173]ggggatggaaaaaaatgatgttgatgttgagttagttgggttgagtcaattagtgcgtga1200174]aagtatcaccacttttgtcatccggcgtttctgtgcgaatC3.C3.C3.C3.C3.cacacagttt1800175]attggagcacttgtttctggcgtattcgtaattgttctgcggtgcggttctgtgtgcatt2400176]tttcctggggtgtctgccgcacctactcatcacccacgccgtgggtttgagccatggcgg3000177]aggtacgactgactggctgcctgcctgcctgactgactgcctgactgcaggaaaagaggg3600178]tttcgaaggaaaaacttttcctgtgttaatCCggCCgtgCgccgctgctcCclclclclt C CclC4200179]cttcatgagaaggagtttga3.3.3.3.3. C 3.3.3.3.aaattcacatataaaaagcgtatctcgaga4800180]tctcaaagtctcccttgaatCgtgtttgCCagttgtaactcatcctttattcttctattc5400181]tatctctctctttccttcccctaatcagcaattaaatccggggtaaggaagaattactac6000182]tgtgtgtaacggttatatttcgttttttattttttttttccattgccatagagaaagaaa6600183]SLSLSLSLSLSLSLSLSLSLgagagtttgtgaagatcttccattcgaatcccataagtgacacatttaat7200184]tttttttttgttagatatgaagttagcatactccctcttgcttccattggcaggagtcag7800185]tgcttcagttatcaattacaagagagatggtgacagcaaggccatcactaacaccacttt8400186]cagtttgaacagaccttctgtgcatttcactccatcccatggttggatgaacgatccaaa9000187]tggtttgtggtacgatgccaaggaagaagactggcatttgtactaccagtacaacccagc9600188]agccacgatctggggtactccattgtactggggtcacgctgtttccaaggatttgacttc10200189]ttggacagattacggtgcttctttgggcccaggttccgacgacgctggtgcgttcagtgg10800190]tagtatggttatcgattataacaatacttctggtttcttcaacagctctgtggacccaag11400191]acaaagagcagttgcagtctggaccttgtctaagggccca agccaagccc agcacatcag12000192]ttactcgttggacggtggttacaccttccaacactattccgacaacgccgtgttggacat12600193]caacagctccaacttcagagaccctaaggtgttctggcacgagggcgagaacggcgaaga13200194]tggtcgttggatcatggccgttgctgaatcgcaagtgttctctgtgttgttctactcttc13800195]tccaaacttgaaaaactggaccttggaatccaacttcacc atcacggtctggactggtac14400196]ccaatacgaatgcccaggtctagttaaggttccatacgac agtgttgctg actcttcgaa1500
ctcctccgactccaagccagactccgcatgggtcttgtttgtctccatcaaccctggtgg1560tccattgggtggttccgttacccaatactttgttggtgacttcaacggtactcacttcac1620tccaatcgacgaccaaaccagattcctagacatgggtaaggactactacgcactacaaac1680tttcttcaacactccaaacgagaaggacgtctacggtatcgcatgggcttctaactggca1740atacgcccaacaagccccaactgacccatggcgttcatctatgagtttggttagacaatt1800cacattgaaagacttcagcacaaaccctaactccgccgatgtcgtcttgaacagtcaacc1860agtcttgaactatgatgctttgagaaagaacggtaccacttacagcatcacaaactacac1920cgtcacctccgaaaacggcaagaagatcaagctagacaacccatccggttctcttgaatt1980ccatcttgaatacgtgtttaacggctccccagatatcaagagcaacgtgttcgctgatct2040ttccttgtacttcaagggtaacaacgacgacaacgaatacttgagattgggttacgaaac2100caacggtggtgccttcttcttggaccgtggccacaccaagattcctttcgtgaaggagaa2160cttgttcttcaaccaccaattggcagttaccaacccagtttccaactacaccacaaacgt2220cttcgacgtttacggtgtcattgacaagaacatcatcgaattgtacttcgacaacggtaa2280cgtcgtctccaccaacactttcttcttctc13<CC3HC3<3<Cgttattggtgaaattgacat2340caagtcaccatacgacaaggcttacaccattaactcatttaacgttacccaatttaacct2400ttgatctgatctgggcttactttactaacg3-3- C 3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.CC3.3.2460tcagtccttctcttcttacgatatgatatgattaaatgatgctatgaaatcatcttcttc2520ttaactttcttaaatcttacgcgtcacttactctatatacccgtttagctttgcctggtc2580acagcgacattttatataagtgtacgtattttcttttttt 3.3.3.3.3. ttctattcta2640accttagaaaagtgccctttaaaccagctgtcctggcactatatctttatcatgtgccgg2700tcgctttccctttccgtttcccttttcctttcaattggtggcctggaattccgaactcat2760tttcgcatctgaaactaattctcgaaacctttaacatcaaacaattgaaaagatcatcat2820caccagaaataagaaaaagatcaacacaacagctaataacagtacgaaagaaagatcgct2880cgagtgaaaaggcagccaagaccggtcattcgatctgggtctagactgattatagacata2940ccaattgcactcagtaagaaaatgagtttcaaatttgacgatgacggtgtggtaaaagaa3000tttcacggcgacaccatcatatgccatattCC t C3HC3<3<3<ccgaattcttcaacaaattg3060ttggacttctaccgttttgcgaaacgactttccttctacgacaagatcaccctacttcct3120ccttcaagctaccacgttacgatcatgaattgctgccacgaacacgatcgttctgagggc3180cactggcccaaaggtaatcgatccggacacaagcatgctgcggtgtacatctacatctga3240ccaacattctaacgtccgagaatgcggccactgcgggctctgctgattccgaactcgaat3300tacaggtgta tcacagccct gccta33251權利要求
1.一種食品級釀酒酵母重組質粒的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)構建含有酵母2μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子和酵母終止 子的穿梭質粒酵母載體部分；(2)構建含有酵母啟動子、酵母終止子和目標外源基因的外源基因表達盒；(3)將(1)獲得的穿梭質粒酵母載體部分與( 獲得的外源基因表達盒共轉化相應營 養缺陷型釀酒酵母菌株，在營養缺陷選擇性培養基上篩選培養轉化子；(4)分離純化獲得包含酵母2μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子、 酵母終止子和目標外源基因的釀酒酵母重組質粒。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的穿梭質粒含有大腸桿 菌質粒復制子、抗生素抗性基因、釀酒酵母2 μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵 母啟動子和酵母終止子的序列，切除大腸桿菌質粒復制子和抗生素抗性基因，獲得穿梭質 粒酵母載體部分。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的酵母啟動子是酵母菊粉酶基因 啟動子、TEFl基因啟動子、ADHl基因啟動子、ADH2基因啟動子、GAPDH基因啟動子、GALl基 因啟動子、GALlO基因啟動子中的任意一種，或者其中兩種及兩種以上啟動子的融合啟動 子。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的酵母終止子是菊粉酶基因終止 子、CYCl基因終止子、TEFl基因終止子、ADHl基因終止子中的一種或者幾種。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的酵母營養缺陷篩選基因是LEU2、 ADE2、URA3、TRP1或者HI S3中的一種或者幾種。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的目標外源基因是菊粉酶基因、 TEFl基因、ADHl基因或者ADH2基因中的任意一種。
7.一種釀酒酵母重組質粒，其特征在于，該重組質粒含有酵母2 μ質粒完整序列、酵母 營養缺陷篩選基因、酵母啟動子、酵母終止子和目標外源基因。
8.—種酵母-大腸桿菌穿梭質粒，其特征在于，該穿梭質粒含有酵母終止子、釀酒酵母 2μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子、大腸桿菌質粒復制子和抗生素抗 性基因的序列，上述各部分依次連接，大腸桿菌質粒復制子和抗生素抗性基因兩側均有酶 切位點。
9.一種食品級的釀酒酵母菌株，其特征在于，該菌株含有權利要求7所述的重組質粒。
10.權利要求1所述制備方法的應用，其特征在于，所述的目標外源基因是菊粉酶基 因，利用含有菊粉酶基因的釀酒酵母重組質粒發酵培養，表達獲得菊粉酶。
全文摘要
本發明屬于生物基因工程技術領域，提供了一種食品級釀酒酵母重組質粒的制備方法首先，構建含有酵母2μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子和酵母終止子的穿梭質粒酵母載體部分；同時，構建含有酵母啟動子、酵母終止子和目標外源基因的外源基因表達盒；然后，將穿梭質粒酵母載體部分與外源基因表達盒共轉化相應營養缺陷型釀酒酵母菌株，在營養缺陷選擇性培養基上篩選培養轉化子；最后，分離純化獲得目的釀酒酵母重組質粒。該表達質粒只能夠在釀酒酵母細胞內生存，不會轉移，可以安全、高效的廣泛的用于表達各種外源基因。
文檔編號C12R1/865GK102051374SQ200910198660
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月11日 優先權日2009年11月11日
發明者劉建平, 李育陽, 江佳稀 申請人:復旦大學