L-氨基酸的生產方法

專利名稱：L-氨基酸的生產方法
技術領域：
本發明涉及使用微生物的L-氨基酸生產方法。L-氨基酸用于調味料、食品添加劑、飼料添加劑、化學制品、醫藥品等各個領域。
背景技術：
L-蘇氨酸、L-賴氨酸等L-氨基酸，是使用具有所述L-氨基酸生產能力的埃希氏菌屬細菌等L-氨基酸生產菌通過發酵方法來工業生產的。作為所述L-氨基酸生產菌，可以使用從自然界分離出來的菌株或該菌株的人工突變株、通過基因重組而增強了 L-氨基酸生物合成酶的重組體等。作為L-蘇氨酸的生產方法，可以列舉例如專利文獻1 4中記載的方法。而作為L-賴氨酸的生產方法，可以列舉例如專利文獻5 8中記載的方法。目前在基于發酵法的L-氨基酸工業生產中使用糖類即葡萄糖、果糖、蔗糖、廢糖蜜、淀粉水解物等作為碳源。L-氨基酸的發酵生產方法中經常使用的碳源是玉米、木薯等高等植物來源的淀粉的糖化物。它們的水分含量低且淀粉含量高，因而在工業上淀粉的獲得是容易的。與此相對的是，雖然以單位干燥重量計，微型藻類中所含的淀粉的含量能夠與玉米、木薯匹敵，但以單位藻類培養液計的干燥藻體重量不到1%。分離藻體、脫水、破碎細胞獲取淀粉、再進行純化等步驟繁雜且困難。專利文獻9 10或非專利文獻1中記載了使用微型藻類的淀粉來實施乙醇發酵，但未給出乙醇發酵的結果。此外，目前為止還沒有報導對微型藻類的淀粉進行糖化來將其用于氨基酸生產的實例。已知作為代表性氨基酸生產菌的大腸桿菌能夠以甘油為唯一碳源生長(非專利文獻2、，并且還能夠以碳鏈12以上的長鏈脂肪酸為唯一碳源生長(非專利文獻幻。因此， 非專利文獻4記載，大腸桿菌可以同化作為油脂水解物的長鏈脂肪酸和甘油中的任意一種，但其不具有脂肪酶活性，不能直接同化油脂。而且，已知通常長鏈脂肪酸的溶解度極低， 非專利文獻5中記載的溶解度測定結果是月桂酸為0. lg/L以上，而油酸為0. 0003g/L以下，棕櫚酸為0.00000003g/L以下。因此，同時同化水溶性高的甘油和脂肪酸是困難的，至今尚沒有使用作為長鏈脂肪酸和甘油的混合物的油脂水解物作為碳源，通過直接發酵法來進行L-氨基酸生產的報導。作為通常用作食用油脂的油料植物，大豆的種子或油棕(oil palm)的果實中含有20%左右的油脂。而如非專利文獻6報告的，已知微型藻類中有一些能夠生產油脂，且單位面積的油脂產量大幅高于油料植物。然而，與淀粉一樣，藻體分離、脫水、細胞破碎再純化的步驟繁雜而困難。因此，至今尚無使用藻類來源的油脂作為碳源、通過直接發酵法進行 L-氨基酸生產的報導。專利文獻1 日本特開平5-304969號公報專利文獻2 國際公開第98/04715號小冊子專利文獻3 日本特開平05-227977號公報專利文獻4 美國專利申請公開第2002/0110876號說明書專利文獻5 日本特開平10-165180號公報
專利文獻6 日本特開平11-192088號公報專利文獻7 日本特開2000-253879號公報專利文獻8 日本特開2001-057896號公報專利文獻9 美國專利申請公開第2006/135308號說明書專利文獻10 美國專利申請公開第2007/0202582號說明書非專利文獻 1 =Matsumoto, M. et al. 2003. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108 247-254非專利文獻2 :Lin，E. C. C. 1996. P. 307-342. In F. D. Neidhardt(ed.)， Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D. C.非專禾Ij文獻 3 :Clark，D. P. and Cronan Jr.，J. Ε· 1996. p. 343-:357. h F. D. Neidhardt(ed. ), Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularB iology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington,D.C.非專利文獻 4 =Brenner, D. J. and Farmer III，J. J. Family I. 2005. p. 587-669. In :D. J. Brenner,N. R. Krieg and J. T. Staley,Editors,Bergey' sManual of Systematic Bacteriology, Volume Two :The Proteobacteria Part B :The Gammaproteobacteria, Springer, New York非專禾Ij文獻 5 :Vorum，H. et al. 1992. Biochimica et Biophysica Acta, 1126 135-142.非專利文獻6 =Chisti Y. 2007. Biotechnol. Adv. 25 :294-306.

發明內容
本發明提供更高效的L-氨基酸生產方法，特別是，相對于傳統的以主要是高等植物來源的糖類作為碳源的利用微生物的L-氨基酸發酵生產方法，通過使用微型藻類來源的碳源，提供更廉價的L-氨基酸生產方法。本發明人等為解決上述課題進行了深入研究，結果發現，通過在以下述未完全純化的材料作為碳源的培養基中培養具有L-氨基酸生產能力的細菌，能夠高效地生產L-氨基酸通過用酶水解處理從微型藻類獲得的淀粉而得到的糖化物、微型藻類的藻體破碎物、 其含油脂的提取物、或對該提取物的分級物進行水解而得到的水解物。本發明正是基于上述認識而完成的。本發明的方法是一種生產L-氨基酸的方法，其中，在包含微型藻類(microalga) 的處理物的培養基中培養具有L-氨基酸生產能力的細菌，在培養物中生產并蓄積L-氨基酸，并從該培養物收集L-氨基酸，其中，該處理物促進所述細菌生產并蓄積L-氨基酸。所述處理物是例如(1)該微型藻類的培養物的破碎物；(2)該破碎物的提取物或分級物，其中包含來源于該微型藻類的有機物的混合物；或C3)該破碎物、該提取物或該分級物的水解物。所述處理物優選是對產生淀粉的微型藻類的藻體破碎物、或者所述藻體破碎物的含淀粉的提取物、或者所述提取物的分級物進行水解而得到的糖化物。所述糖化物優選是從微型藻類的藻體破碎物或所述藻體破碎物的含淀粉的分級物通過使用淀粉酶的酶反應而得到的反應產物。所述淀粉酶優選是葡糖淀粉酶。此外，所述處理物優選是對產生油脂的微型藻類的藻體破碎物、或者所述藻體破碎物的包含油脂的提取物、或者所述提取物的分級物進行水解而得到的水解物。所述水解物優選是從微型藻類的藻體破碎物或所述藻體破碎物的包含油脂的分級物使用脂肪酶進行酶反應而得到的反應產物。所述所述水解物可以是經過了乳化處理的。所述破碎物的獲取方法是選自高溫處理、有機溶劑處理、煮沸處理、強堿處理中的 1種以上方法。作為高溫處理，可以列舉例如在150°C以上的溫度下進行處理。所述微型藻類優選為屬于綠藻綱(Chlorophyceae)、Trebouxiophyceae或硅藻綱 (Bacillariophyceae)的藻類，更優選為屬于綠藻綱(Chlorophyceae)的藻類。所述細菌優選為屬于腸桿菌科的細菌或棒狀桿菌型細菌，更優選為屬于埃希氏菌屬的細菌。所述L-氨基酸例如為選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸中的1種或2種以上 L-氨基酸。當所述L-氨基酸為L-賴氨酸時，優選所述細菌的選自二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉移酶、 二氨基庚二酸差向異構酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脫酰基酶中的1種或2種以上的酶的活性被增強，和/或賴氨酸脫羧酶的活性被弱化。當所述L-氨基酸為L-蘇氨酸時，優選所述細菌的選自天冬氨酸半醛脫氫酶、thr 操縱子編碼的天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉移酶、以及蘇氨酸合酶中的 1種或2種以上的酶的活性被增強。當所述L-氨基酸為L-谷氨酸時，優選所述細菌的選自谷氨酸脫氫酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、以及甲基檸檬酸合酶中的1種或2種以上的酶的活性被增強， 和/或α-酮戊二酸脫氫酶的活性被弱化。優選所述培養基包含所述處理物作為碳源。此外，本發明還提供一種生產L-氨基酸的方法，其特征在于該方法包括下述步驟(a)在培養基中培養微型藻類，采用選自破碎、提取、分級以及水解中的1種以上的方法對該培養物進行處理，制備促進具有L-氨基酸生產能力的細菌生產并蓄積L-氨基酸的該微型藻類的處理物；(b)在該包含微型藻類的處理物的培養基中培養該細菌，從而在培養物中生產并蓄積L-氨基酸；以及(c)從該培養物收集L-氨基酸。所述處理物是例如(1)該微型藻類的培養物的破碎物；(2)該破碎物的提取物或分級物，其中包含來源于該微型藻類的有機物的混合物；或者( 該破碎物、該提取物或該分級物的水解物。所述破碎的方法優選是選自高溫處理、有機溶劑處理、煮沸處理和強堿處理中的1 種以上的方法。所述處理物制備步驟優選包括通過對產生淀粉的微型藻類進行破碎和/或提取和分級，并對所得處理物進行水解來進行糖化的步驟。所述進行糖化的步驟中優選使用淀粉酶實施酶反應。所述淀粉酶優選為葡糖淀粉酶。所述處理物制備步驟優選包括對產生油脂的微型藻類進行破碎和/或提取和分級，并對所得油處理物進行水解的步驟。所述水解步驟中優選實施使用脂肪酶的酶反應。所述水解物可以是經過乳化處理的。所述微型藻類優選是屬于綠藻門、不等長鞭毛門的藻類；更優選是屬于綠藻綱、Trebouxiophyceae或硅藻綱的藻類。所述微型藻類特別優選是屬于綠藻綱 (Chlorophyceae)的藻類。所述細菌優選是屬于腸桿菌科的細菌或棒狀桿菌型細菌；更優選是大腸桿菌。根據本發明，能夠更高效地生產L-氨基酸，特別是，通過使用微型藻類來源的廉價碳源，能夠廉價地生產L-氨基酸。發明的
具體實施例方式以下，對本發明進行具體說明。<1>本發明中使用的微型藻類及其培養方法本發明中的微型藻類(microalgae)可以使用任何微型藻類，優選在藻體內蓄積淀粉和/或油脂的微型藻類。藻類(algae)是指進行產氧型光合成的生物中，除主要在陸上生活的苔癬植物、 蕨類植物、種子植物以外的全部生物。藻類中包括分類在從屬于原核生物的藍細菌(藍藻) (cyanobacteria)到屬于真核生物的灰藻門(Glaucophyta)、紅藻門(紅藻)(Rhodophyta)、 綠藻門(Chlorophyta)、隱藻門(隱藻)(Cryptophyta)、定鞭藻門(定鞭藻)(Haptophyta)、 不等長鞭毛門(Heterokontophyta)、甲藻門(甲藻)(Dinophyta)、裸藻門(Euglenophyta)、 Chlorarachniophyta的各種單細胞生物和多細胞生物。所謂微型藻類，是上述藻類中除了屬于多細胞生物的海藻類以外的具有微觀結構的藻類(才rMr λ ^y
⑶藻類O多樣性i系統千原光雄裳華房(1999))。
以藻類為代表的植物多以淀粉作為儲藏多糖(Ball，S. G. and Morel 1, Μ. K. 2003. Annual Review ofPlant Biology, 54 :207-233) 已知多種蓄積淀粉的藻類，其中代表性的藻類有屬于綠藻門的蔥綠藻綱(Prasinophyceae)、綠藻綱(Chlorophyceae)、 Trebouxiophyceae、石莼綱(Ulvophyceae)、輪藻綱(Charophyceae)等。這其中，屬于綠藻綱(Chlorophyceae)以及"Trebouxiophyceae的藻類研究廣泛。作為屬于綠藻綱的藻類， 可以列舉衣藻屬(Chlamydomonas)；作為屬于jTrebouxiophyceae的藻類，可以列舉小球藻屬(Chlorella)。具體地，作為衣藻屬，可以列舉萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) (Ball, S. G. 1998.The Molecular Biology of Chloroplasts andMitochondria in Chlamydomonas, pp. 549—567. Rochaix J. -D. , Goldschmidt-Clermont Μ. , and Merchant S. (Eds) ,Kluwer AcademicPublishers)；作為小球藻屬，可以列舉Chlorella kessleri (舊稱 Chlorellavulgaris) (Izumo，A. et al. 2007. Plant Science 172:1138-1147)。更具體地，作為萊茵衣藻，可以列舉萊茵衣藻CC125株；作為Chlorella kessleri，可以列舉 Chlorella kessleri Ilh株。所述藻株例如分別保藏在德克薩斯大學藻類培養物保藏中心(The University of Texas at Austin, The Culture Collection ofAlgae (UTEX),1
8University Station A6700, Austin, TX 78712-0183，USA)，受理號為 UTEx 2244 和 UTEX 沈3，可以從UTEX獲得。Chlorella kessleri Ilh株先保藏在東京大學分子細胞生物學研究所IAM培養物保藏中心，保藏號C-531，然后轉移至獨立行政法人國立環境研究所微生物系統保存設施(NIES)。此外，該株還保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC、P. 0. Box 1549,Manassas, VA 20108, l,United States of America)，受理號ATCC11468，可以從ATCC 通過分售獲得。而且，還已知微型藻類中有一些蓄積油脂作為儲藏物質(Chisti，Y.2007. Biotechnol Adv. 25 :294-306)。作為這樣的藻類，熟知的有屬于綠藻門、不等長鞭毛門的藻類。綠藻門中，可以列舉屬于綠藻綱(Chlorophyceae)的藻類，作為屬于綠藻綱的藻類，可以列舉 Neochloris οleoabundans (Tornabene，T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5 :435-440) > 微球藻屬禾中(Nannochloris sp.)(Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :112-117)等。不等長鞭毛門分類成黃金 fe 藻 (Chrysophyceae) > IiI ^ (Dictyochophyceae)、Pelagophyceae> # Ifi ^ (Rhaphidophyceae)、5 (Bacillariophyceae)、！!藻 Β (Phaeophyceae)、黃參錄藻 Β (Xanthophyceae)、大眼藻綱(Eustigmatophyceae)，作為常用的屬于硅藻綱的藻類，可以 ^J^fiitM^lil^ (Thalassiosira pseudonana) (Tonon, T et al. 2002. Phytochemistry 61 :15-24) ο作為Neochloris oleoabundans,可以具體例舉Neochloris οIeoabundansUTEX 1185 株，作為 Nannochloris sp.，可以列舉 Nannochloris sp. UTEX LB1999 株，作為假微型海鏈藻，可以列舉假微型海鏈藻UTEX LB FD2株。所述菌株可以從德克薩斯大學藻類培養物保藏中心(The University of Texas atAustin, The Culture Collection of Algae (UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183，USA)獲得。關于微型藻類的培養已經取得了許多認識，小球藻屬、螺旋藻屬(Spirulina， Arthrospira)或者Dunaliella salina等，已經進行了大規模工業培養來用于食用 (Spolaore, P. et al. 2006. J. Biosci. Bioeng. 101 :87-96)。對于萊茵衣藻可以使用例如 0. 3XHSM 培養基(Oyama, Y. et al. 2006. Planta 224 :646-654)；對于 Chlorella kessleri 可以使用 0. 2 X Gamborg' s 培養基(Izumo，A. etal. 2007. Plant Science 172 1138-1147)等。Neochloris oleoabundans、微球藻屬種可以使用改進NORO培養基 (Yamaberi, K. et al. 1998. J. Mar. Biotechnol. 6 :44-48 ；Takagi, Μ. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :112-117)々 Bold ' s Basal Medium(Tornabene, T.G. et al.1983.Enzyme and Microb. Technol. 5 :435-440 ；Archibald, P.A. and Bold, H. C. 1970. Phytomorphology20 :383-389)來進行培養。作為屬于硅藻綱的藻類，假微型海鏈藻適合使用 F/2 培養基(Lie, C. -P. and Lin, L. -P. 2001. Bot. Bull. Acad. Sin. 42 :207-214)等。此外，對于微型藻類的培養，還可以使用光生物反應器(W02003/094598號小冊子)。培養中大多添加相對于主培養的體積1-50%的前培養液來進行。初始pH優選為7-9的中性附近，培養中大多不進行pH調整，但有時視需要也可進行。培養溫度優選為 25-35°C，特別是附近是一般經常采用的溫度，但培養溫度只要是適合于所使用的藻類的溫度即可。培養液中大多通入空氣，經常采用的通氣量是單位培養液體積的每1分鐘的通氣量為0. l-2vvm(volume per volume per minute,體積每體積每分鐘)。而且，為了力口快生長，也會通入CO2，優選通入通氣量的0. 5-5%左右。光照射強度的最佳條件也因微型藻類的種類而異，經常采用的是1，000-10，OOOlux左右。光源通常是在室內使用白色熒光燈， 但并不限于此。也可以在室外利用太陽光來進行培養。視需要，還可以以適當強度攪拌或循環培養液。此外，已知如果氮源枯竭，藻類會在藻體內蓄積油脂(Thompson GA Jr. 1996. Biochim.Biophys.Acta 1302 :17-45)，可以在主培養中使用進一步限制了氮源濃度的培養基。本發明中，微型藻類的培養物包括包含藻體的培養液、從培養液回收的藻體。從培養液回收藻體的方法可以采用常規的離心分離、過濾或者使用絮凝劑 (flocculant)的借助重力的沉降等方法(Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20 :491-515)。<2>微型藻類的處理方法和微型藻類的處理物在本發明中，微型藻類的處理物是指這樣的處理物，其包含來源于破碎的微型藻類的細胞的有機物的混合物，可促進具有L-氨基酸生產能力的細菌生產并蓄積L-氨基酸； 這樣的處理物具體地可以列舉(1)該微型藻類的培養物的破碎物，( 該破碎物的包含來源于該微型藻類的有機物的混合物的提取物或分級物，或C3)該破碎物、該提取物或該分級物的水解物。“促進生產并蓄積L-氨基酸”或“促進L-氨基酸的生產和蓄積”是指處理物中所包含的、來源于破碎的微型藻類細胞的有機物混合物，在細菌增殖和L-氨基酸生產中，作為構成菌體成分和L-氨基酸的碳的供給源實質性地做出貢獻，只要是能夠做出這樣的貢獻的處理物，就包含在本發明的“促進對L-氨基酸的生產蓄積量有作用的處理物”之中。處理物是否促進L-氨基酸的生產和蓄積，可以通過在只是有無處理物不同、而其它均相同的條件下培養該細菌，并比較培養物中的L-氨基酸的生產蓄積量來確認。只要與未添加處理物的培養物中的L-氨基酸蓄積相比有所提高即可，優選與未添加培養物相比，L-氨基酸蓄積提高10%以上，優選20%以上，更優選30%以上。通過添加處理物，微生物的生長速度提高、培養基中的微生物菌體量增加，也屬于本發明的“促進生產并蓄積L-氨基酸”，與未添加的培養物相比，生長速度和菌體量優選增加10%以上，優選20%以上，更優選30%以上。此外，當處理物包含碳源時，只要能夠在細菌增殖及L-氨基酸生產中作為構成菌體成分和L-氨基酸的碳的供給源做出實質性貢獻，就屬于本發明的對L-氨基酸的生產蓄積量有促進作用的處理物。因此，與未添加處理物的條件相比L-氨基酸的生產蓄積量增加的情況，也包含在本發明的處理物中，優選與添加包含與所含碳源等量的純化物質的碳源相比，L-氨基酸生
產蓄積量更高。此外，與使用包含純化物質的碳源相比，純化碳源的處理步驟的縮短也可以說是 L-氨基酸生產蓄積提高。處理步驟的縮短時間優選縮短10%以上、優選20%以上、更優選 30%以上。作為處理物，除了上述的例子以外，可以以促進L-氨基酸生產蓄積為指標，通過破碎、提取、分級、水解及其任意組合，來獲得目的處理物。破碎培養物的方法只要是能夠充分破碎藻體的方法即可，可以是任何方法，例如， 優選采用高溫處理(例如在100°c以上的溫度(優選150°C以上、更優選175 215°C)條件下進行處理)、有機溶劑處理(例如利用甲醇氯仿混合溶劑進行處理)、煮沸處理、強堿處理、超聲波處理、弗氏細胞壓碎器處理等方法以及這些方法的任意組合。高溫處理還包括在稱為水熱反應這樣的條件下的高溫高壓反應。此外，還可以在對藻體進行干燥后，采用物理方法進行破碎。破碎的藻類來源的有機物溶液，可以直接以粗提取物的形式使用或者用于水解反應，也可以通過過濾、離心分離等除去細胞壁等不溶物，或者通過冷凍干燥等來進行濃縮。而且，也可以使用包含進行過某種程度的分級的淀粉的溶液。從藻體破碎物中進行淀粉的分級，可以基于比重差異例如通過在懸浮液中的沉降速度等，來分離回收蛋白級分。此外，還可以從藻體破碎物中進行油脂的分級。通過在藻體的破碎物或該破碎物的濃縮物中加入例如80%甲醇或80%丙酮，并使用已烷、氯仿等溶劑對其中的不溶性油脂進行提取，可以以粗脂溶性級分的形式提取油脂。本發明的微型藻類來源的有機物的混合物中，優選包含可以作為碳源利用的物質。這種情況下，可以減少或省略向用于氨基酸發酵的培養基中另行添加的碳源。作為可作為碳源利用的物質，可以列舉淀粉和/或油脂的水解物。在本發明的微型藻類來源的有機物的混合物中包含微型藻類生產的淀粉的情況下，可以將該糖化物添加到培養基中作為碳源。淀粉的糖化物例如可以從微型藻類來源的有機物溶液或其包含淀粉的分級物，通過酸水解等化學方法或使用淀粉酶的酶反應來獲得。淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成的高分子多糖類，所述直鏈淀粉由葡萄糖通過α-1，4-葡糖苷鍵鍵合成直鏈狀而成，所述支鏈淀粉在其分枝上具有α-1，4-葡糖苷鍵和α-1，6-葡糖苷鍵這兩者的直鏈。淀粉酶(amylase)是水解淀粉等的葡糖苷鍵的酶的總稱。根據作用部位的不同，大致分為α-淀粉酶(a-amylase EC3. 2. 1. 1)、β -淀粉酶 (β -amylase EC3. 2. 1. 2)和葡糖淀粉酶(glucoamylase EC3. 2. 1. 3)。α -淀粉酶是隨機切斷淀粉、糖原等α-1，4-葡糖苷鍵的內切型酶。淀粉酶是從淀粉的非還原性末端以麥芽糖為單位依次分解α-1，4-葡糖苷鍵的外切型酶。葡糖淀粉酶(也稱淀粉葡糖苷酶)是從淀粉的非還原性末端以葡萄糖為單位依次分解α -1,4-葡糖苷鍵的外切型酶，其也分解支鏈淀粉中所含的α-1，6_鍵。葡糖淀粉酶能夠從淀粉直接生成葡萄糖，因而在葡萄糖的生產中有廣泛應用，在本發明中它是優選的酶。谷物來源的淀粉的糖化反應在工業上也有著許多實施的實例(Robertson，G. H. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :353-365)。按照與這些實例相同的方式，可以從藻體通過酶反應而得到糖化物。在對包含破碎藻體的溶液進行酶處理時，作為前處理，優選組合使用煮沸、超聲波處理、堿處理等(Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172:1138-1147)。酶反應的條件可以根據所使用的酶的性質適宜設定。例如，對于淀粉葡糖苷酶 (Sigma-Aldrich 公司 A-9228)，優選酶濃度 2 20U/mL、溫度 40 60°C、pH4 6。而且， 如果在PH的制備中使用能夠被用于L-氨基酸生產的細菌所同化的有機酸作為緩沖液，則該有機酸可以與淀粉的糖化物一起作為碳源使用。例如，可以直接將酶反應產物添加到培養基中。在本發明中，由微型藻類生產的淀粉的糖化物是指如上述地，對淀粉進行水解， 生成細菌能夠同化的諸如麥芽糖或葡萄糖的寡糖或單糖而得到的物質。此外，由微型藻類生產的淀粉的糖化物可以是基本上全部的淀粉均被糖化，也可以一部分被糖化。優選地，淀粉的50重量％以上、更優選70重量％以上、特別優選90重量％以上轉化為葡萄糖。而且， 由微型藻類生產的淀粉的糖化物可以包含微型藻類生產的淀粉以外的碳水化合物物或其糖化物。在本發明的微型藻類來源的有機物的混合物中包含微型藻類生產的油脂的情況下，也可以將其水解物添加到培養基中作為碳源。可以將通過熱處理等對微型藻類的藻體進行破碎而得到的粗提取液直接進行水解，也可以對使用乙醇、甲醇-氯仿的混合物或丙酮等溶劑提取得到的有機物的混合溶液進行水解。所述溶液可以直接使用，也可以通過冷凍干燥、旋轉蒸發等處理進行濃縮。該溶液包含氨基酸等可作為有機氮源利用的成分、以及金屬類等對具有氨基酸生產能力的細菌的生長有效的成分，而且該溶液也可以作為非碳源的培養基成分使用。在本發明中，微型藻類產生的油脂可以是任何形態，只要能夠進行油脂水解、優選利用酶進行油脂水解即可，具體地可以列舉藻體破碎物、菌體破碎物的含油脂的提取物、從該提取物獲得的含油脂的分級物等。此外，所述提取物或分級物優選包含油脂以外的對氨基酸發酵有效的有機物。油脂是脂肪酸與甘油的酯，也稱為甘油三酯。作為微型藻類產生的油脂，優選其水解產生的脂肪酸的種類能夠被本發明的方法中使用的細菌作為碳源而同化，更優選這樣的脂肪酸的含量高。作為具有L-氨基酸生產能力的細菌能夠同化的長鏈脂肪酸的種類，可以列舉月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸等。此外，通常，除油脂以外，生物會包含通過水解而游離出脂肪酸的脂質(lipid)，脂質水解產生的脂肪酸也可以作為碳源使用。作為脂質，可以列舉簡單脂質(Simple Lipid)例如蠟(wax)、神經酰胺(Ceramide)，或者復合脂質例如磷脂(Wiospholipid)、糖脂(Glycolipid)等。在本發明中，油脂的水解物是指通過化學方法或酶方法等對上述微型藻類油脂進行水解而得到的水解物。作為化學水解法，通常采用在高溫O50-260°C )、高壓(5-6MPa) 條件下使油脂和水對向流動接觸的連續高溫水解法。此外，已知在強酸存在下或酸催化劑存在下會發生油脂水解(美國專利第4，218，386號)。此外，工業上還使用酶在低溫(30°C 左右)下進行反應(Jaeger, K. Ε. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15 :29-63)。作為所述酶，可以使用催化油脂水解反應的酶——脂肪酶。具體地，例如通過在小型壓力容器中加入等量的油脂和水，并于200°C加熱攪拌1 小時左右，可以獲得70-80%左右的水解率。工業上，采用高溫Q50-260°C)、高壓(5_6MPa) 條件。另一方面，采用酶法可以在更溫和的條件下進行水解。對水和油脂進行攪拌、同時在適合脂肪酶反應的溫度下進行酶反應，這對本領域技術人員而言是容易的。脂肪酶是工業上重要的酶,有著各種各樣的產業應用(Hasan, F. et al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39 :235-251)。所使用的酶可以是1種，也可以是2種以上。脂肪酶是將油脂水解成脂肪酸和甘油的酶，也稱作三酰甘油脂肪酶 (triacylglycerol lipase)、三酉先甘油酉旨月旨肪醇(triacylglyceride lipase)。脂肪酶見于各種生物，只要是催化上述反應的脂肪酶即可，可以使用任何物種來源的脂肪酶。近年來，進行了許多嘗試來使用脂肪酶從油脂和醇生產作為脂肪酸酯的生物柴油燃料(Fukuda，H.，Kondo, A.，and Noda, H. 2001. J. Biosci. Bioeng. 92，405-416)。作為微生物來源的代表性脂肪酶，已知芽胞桿菌屬(Bacillus)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)來源的多
12種月旨肪酶(Jaeger, K. Ε.，and Eggert, Τ. 2002. Curr. Opin. Biotechnol. 13 :390-397)。作為例子，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的LipA(GenBank登錄號 M74010)的編碼基因的堿基序列示于SEQ ID NO :1，氨基酸序列示于SEQlD NO :2。莢殼伯克霍爾德氏菌(Burkholderia glumae)來源的LipA (GenBank登錄號 X70354)的編碼基因的堿基序列示于SEQ ID NO :3，氨基酸序列示于SEQID NO :4。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)來源的 LipA(GenBank 登錄號 D50587) 的編碼基因的堿基序列示于SEQ ID NO :5，氨基酸序列示于SEQ IDNO :6。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)來源的脂肪酶(GenBank登錄號 M12715)的堿基序列示于SEQ ID NO :7，氨基酸序列示于SEQ ID NO :8。此外，作為酵母的南極假絲酵母(Candida antarctica)來源的脂肪酶(GenBank 登錄號Z30645)也是廣為利用的一種脂肪酶(Breivik, H.，Haraldsson, G. G. and Kristinsson,B. 1997. J. Am. Oil Chem. Soc. 74 :1425-1429)。該脂肪酶的編碼基因的堿基序列示于SEQ ID NO :9，氨基酸序列示于SEQ ID NO :10。而且，已知酵母皺褶假絲酵母(Candida rugosa)(即柱狀假絲酵母 (Candidacylindracea))中存在由不同基因編碼的5種以上的脂肪酶(Alberghina， L. andLotti，M. 1997. Methods Enzymo 1. 284 :246-260)。作為主要的脂肪酶，已知有 LIPl 和 LIP2，編碼LIPl的Iipl (GenBank登錄號)(64703)基因的堿基序列示于SEQ ID NO :11,LIP1 的氨基酸序列示于SEQ ID NO :12ο編碼LIP2的lip2 (GenBank登錄號X64703)基因的堿基序列示于SEQ ID N0:13，LIP2的氨基酸序列示于SEQ ID N0:14。而且，已知在Candida cylindracea等假絲酵母屬(Candida)酵母中，在常規編碼中編碼亮氨酸的CTG密碼子編碼 ^.UM (Kawaguchi, Y. et al. 1989. Nature 341 :164-166 ；Ohama, T. et al. 1993. Nucleic Acids Res. 21 :4039-404 。在SEQ ID NO :11 14中，為了方便起見，將CTG對應的氨基酸記載為Leu，而實際上是kr。所使用的上述脂肪酶可以從上述微生物的菌體或培養物制備得到，也可以使用編碼各脂肪酶的基因，利用基因工程技術，通過在其它宿主微生物中表達來制備。當將皺褶假絲酵母(柱狀假絲酵母)等CTG密碼子編碼絲氨酸的酵母來源的基因在其它宿主中進行表達時，有必要將CTG變更為編碼絲氨酸的其它常規密碼子(Schmidt-Dannert，C. 1999. Bioorg. Med. Chem. 7 :2123-2130)。作為脂肪酶的序列方面的特點包括，例如在活性中心Ser周圍具有稱為脂肪酶盒(lipase box)的GXSXG基序，以及脂肪酶、酯酶、絲氨酸蛋白酶中均可見的稱為催化三聯體(catalytic traid)的kr、Asp、His這3個殘基的保守性。例如，在SEQ ID NO :2所示的枯草芽孢桿菌來源的LipA的氨基酸序列中，脂肪酶盒子相當于第106位 110位，催化三聯體相當于第108位的kr、第164位的Asp以及第187位的His這3個殘基。已知油脂的水解物是脂肪酸與甘油的混合物，通常的油脂水解物中所含的甘油 /脂肪酸的重量比是10%左右。水解物可以是水解反應后的反應產物本身，但只要包含脂質來源的脂肪酸、甘油等能夠被細菌同化的碳源即可，也可以是對反應產物進行分級或純化而得到的物質。當水解物包含脂肪酸和甘油時，甘油/脂肪酸的重量比優選為2 50 100，更優選為5 20 100。在室溫附近的溫度下，油脂的水解物通常會分離成包含甘油的下層(水相)和包含脂肪酸的上層(油相)。如果收集下層，則可以獲得主要包含甘油的級分。如果收集上層， 則可以獲得主要包含脂肪酸的級分。在本發明中，可以使用它們中的任意一種作為碳源，但優選使用甘油和脂肪酸這兩者。當以水解物的形式使用包含甘油和脂肪酸這兩者的物質時，優選對水解物進行乳化處理。作為乳化處理，可以列舉添加乳化促進劑、攪拌、勻漿或超聲波處理等。可以認為通過乳化處理，細菌易于同化甘油和脂肪酸，L-氨基酸發酵效率更高。乳化處理只要是使得具有L-氨基酸生產能力的細菌更容易同化脂肪酸與甘油的混合物的處理即可，可以是任何的乳化處理。例如，作為乳化方法，可以考慮添加乳化促進劑、表面活性劑等。這里，作為乳化促進劑，可以列舉磷脂、留醇。此外，作為表面活性劑，非離子表面活性劑方面包括例如聚(氧化乙烯)去水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80)等聚氧化乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯、正辛基β-D-葡糖苷等烷基葡糖苷、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯等聚甘油脂肪酸酯等。作為兩性離子表面活性劑，可以列舉屬于烷基甜菜堿的N，N-二甲基-N-月桂基甘氨酸甜菜堿等。除此以外，還可以使用Triton X-100、 聚氧化乙烯00)十六烷基醚(Brij-58)、壬基苯酚乙氧化物(Tergitol NP-40)等生物學領域通常使用的表面活性劑。而且，用于促進諸如脂肪酸的難溶性物質的乳化、均一化的操作也是有效的。該操作只要是促進脂肪酸與甘油的混合物的乳化、均一化的操作即可，可以是任何操作。具體地，可以列舉攪拌處理、勻漿器處理、均勻混合器處理、超聲波處理、高壓處理、高溫處理等， 更優選攪拌處理、勻漿器處理、超聲波處理以及它們的組合。將上述的利用乳化促進劑進行的處理與攪拌處理、勻漿器處理和/或超聲波處理相組合是特別優選的，所述處理理想的是在脂肪酸更為穩定的堿性條件下進行。作為堿性條件，優選PH9以上，更優選pHIO以上。甘油的濃度可以利用F-Kit Glycerol (Roche Diagnostics公司)這樣的試劑盒或各種生物傳感器來測定。此外，脂肪酸或油脂的濃度可以利用氣相色譜(Hashimoto， K. et al. 1996. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70 :22-30)々 HPLC(Lin, J. Τ. et al. 1998. J. Chromatogr. Α. 808 :43-49)來測定。<4>本發明中使用的細菌在本發明中，使用具有L-氨基酸生產能力的細菌。對于細菌沒有特殊限制，只要其能夠高效地從由微型藻類生產的有機物、特別是淀粉的糖化物或者油脂的水解物生產 L-氨基酸即可，可以列舉例如埃希氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬等屬于腸桿菌科的細菌，以及屬于短桿菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬的稱為棒狀桿菌型細菌等，但不限于此。可以對本發明中的L-氨基酸生產菌進行修飾，使得油脂水解物的同化能力提高。 這樣的修飾包括，例如，編碼在腸桿菌科細菌群中發現的轉錄因子i^adR(該因子調節脂肪酸代謝且具有DNA結合能力)的基因的缺損(DiRusso，C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267 8685-8691 ；DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7 :311-322)。具體地，大腸桿菌 (Escherichia coli)的fadR基因位于以Genbank登錄號U00096登錄的大腸桿菌MG1655 株的基因組序列上的堿基編號1，234，161 1，234，880，該基因編碼以GenBank登錄號 AAC74271登錄的蛋白質。fadR基因序列示于SEQ ID N0:15。本發明的L-氨基酸生產菌中，與甘油代謝相關的基因可以是經修飾的。作為與甘油代謝相關的基因，為了提高甘油同化性能，可以弱化glpR基因(EP1715056)的表達，或者強化 glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、 glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa 以及 talC 基因等甘油代謝基因(EP1715055A) 的表達。特別是，為了提高甘油同化性能，優選組合強化甘油脫氫酶基因(gldA)與PEP依賴型二羥基丙酮激酶基因(dhaKLM)基因或者ATP依賴型二羥基丙酮激酶基因(dak)。而且，還可以進一步強化果糖-6-磷酸醛縮酶(fsaB)的表達(W02008/102861)。此外，在甘油激酶(glpK)方面，優選使用解除了果糖-1，6-磷酸反饋抑制的脫敏型 glpK 基因(W02008/081959，W02008/107277)。腸桿菌科中包括屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、 光桿菌屬(Photorhabdus)、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、摩根氏菌屬、耶爾森菌屬等屬的細菌。特別優選通過NCBI (National Center for Biotechnology Information)的數據庫(http://www, ncbi. nlm. nih. Rov/Taxonomy/Browser/wwwtax. CgiYYid = 91347)中采用的分類方法分類在腸桿菌科中的細菌。對于可在本發明中使用的屬于埃希氏菌屬的細菌沒有特殊限制，包括例如 Neidhardt 等的著作(Neidhardt, F.C. Ed. 1996. Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp.2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D. C.)中表述的系統。具體地,可以列舉原型野生株K12株來源的大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC 47076)等。這些菌株可以從例如美國典型培養物保藏中心(地址P.O. Box 1549Manassas，VA 20108,United States ofAmerica)通過分售獲得。即，對各菌株賦予了對應的登錄號，可以利用該登錄號通過分售獲得。對應于各菌株的登錄號見美國典型培養物保藏中心的目錄。 這一點對于以下的附有ATCC號的菌株而言也是一樣的。所謂屬于泛菌屬的細菌，是指該細菌通過微生物學專家知曉的分類被分類在泛菌屬。成團腸桿菌的某些種，最近基于16S rRNA堿基序列分析等被重新分類為成團泛菌 (Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌((Pantoea stewartii))等(Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43 162-173)。在本發明中，屬于泛菌屬的細菌也包含這樣重新分類在泛菌屬的細菌。作為泛菌屬細菌的代表性菌株，可以列舉Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成團泛菌、檸檬泛菌(Pantoea citrea)。具體地，可以列舉下述菌株。Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(歐洲專利申請公開0952221 號說明書)Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(歐洲專利申請公開0952221 號說明書)此外，這些菌株在歐洲專利申請公開0952221號說明書中被描述為成團腸桿菌。 但是現在，如上所述，這些菌株通過16S rRNA的堿基序列解析等被重新分類為Pantoea ananatis。腸桿菌屬細菌的實例包括成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)、產氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)等。具體地，可以使用歐洲專利申請公開952221號說明書示例的菌株。作為腸桿菌屬的代表性菌株，可以列舉成團腸桿菌ATCC12287株。
作為歐文氏菌屬細菌，可以列舉解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)；作為克雷伯氏菌屬細菌，可以列舉植生克雷伯氏菌 (Klebsiella planticola)。具體地，可以列舉下述菌株。解淀粉歐文氏菌ATCC15580株胡蘿卜軟腐歐文氏菌ATCC15713株植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(歐洲專利申請公開955368號說明書)植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(歐洲專利申請公開955368號說明書)在本發明中，“棒狀桿菌型細菌”還包括傳統上被分類為短桿菌屬，而現在被分類為棒桿菌屬的細菌(Liebl, W. et al. 1991. Int. J. Syst. Bacteriol. ,41 :255-260)，以及與棒桿菌屬親緣關系非常近的短桿菌屬細菌。作為這樣的棒狀桿菌型細菌的例子，可以列舉以下細菌。嗜乙酰乙酸棒桿菌醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)；^醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)美棒Iflif (Corynebacterium callunae)谷氨酸棒桿菌百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)嗜熱產氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) (Corynebacteriumefficiens)力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)—I^feilf lif (Brevibacterium divaricatum)黃色短桿菌Brevibacterium immariophilum乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)角軍H短桿菌(Brevibacterium saccharoIyticum)生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)/feMfeiIflii (Corynebacterium ammoniagenes)白fe棒桿菌(Brevibacterium album)賭狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)具體地，可以示例出諸如下述的菌株。嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870木干胃(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806@酉享_木干胃(Corynebacterium a 1 kano 1 yticum) ATCC21511美棒桿菌(Corynebacterium callunae)ATCC15991
16
谷氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032, ATCC13060百合花棒桿菌(Corynebacteriumlilium)ATCC15990棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965嗜熱產氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)ATCC13868二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826，ATCC14067Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 (谷氨酸棒桿菌 ATCC13869)玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum) ATCC13825解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC19240產氨短桿菌(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871、ATCC6872白色棒桿菌(Brevibacterium album)ATCC15111蠟狀短桿菌(Brevibacterium cerinum) ATCC15112嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354在本發明中，具有氨基酸生產能力的細菌，是指具有在培養基中進行培養時生產 L-氨基酸并將L-氨基酸分泌至培養基中的能力的細菌。此外，優選地，是指能夠在培養基中蓄積優選0. 5g/L以上、更優選1. 0g/L以上的量的目的L-氨基酸的細菌。L-氨基酸包括 L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、 L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-纈氨酸。特別優選L-蘇氨酸、L-賴氨酸以及L-谷氨酸。以下，針對賦予如上所述的細菌L-氨基酸生產能力的方法、或者增強如上所述的細菌的L-氨基酸生產能力的方法進行說明。為了賦予L-氨基酸生產能力，可以使用在棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬細菌等 L-氨基酸生產菌的選育中沿用至今的方法，如獲取營養缺陷突變體、L-氨基酸類似物抗性菌株或代謝調節突變菌株，創建L-氨基酸生物合成系統統酶表達增強的重組菌株等等(參見《7 $ )酸発酵》，(株)學會出版七 > 夕一，1986年5月30日首次出版發行，第77-100 頁)。這里，在L-氨基酸生產菌的選育中，所賦予的營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變等性質可以是單獨一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達被增強的L-氨基酸生物合成系統酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可以將營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變等性質的賦予與生物合成系統酶的增強組合進行。具有L-氨基酸生產能力的營養缺陷突變體菌株、類似物抗性菌株或代謝調節突變菌株可如下獲得對親本菌株或野生型菌株施以常規突變處理，即X-射線或UV照射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍等處理；其后，從所得的突變菌株中選擇顯示營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變并且還具有L-氨基酸生產能力的菌株。此外，L-氨基酸生產能力的賦予或增強也可以通過利用基因重組增強酶活性來進行。在酶活性的增強方面，可以例舉對細菌進行修飾而增強參與L-氨基酸生物合成的酶的編碼基因的表達的方法。作為增強基因的表達的方法，可以這樣來實現將包含基因的DNA 片段導入適當的質粒，例如至少包含負責質粒在微生物內的復制增殖功能的基因的質粒載體，而得到擴增質粒，導入這樣的擴增質粒；或者，通過接合、基因轉移等使所述基因在染色體上多拷貝化；抑或在所述基因的啟動子區域導入突變(參照國際公開小冊子W095/34672 號)。當向上述擴增質粒或者染色體上導入目的基因時，用于表達所述基因的啟動子可以是能夠在棒狀桿菌型細菌中發揮功能的任何啟動子，可以是所使用的基因自身的啟動子，也可以是經修飾的啟動子。也可以通過適宜地選擇在棒狀桿菌型細菌中強力發揮功能的啟動子，或者通過使啟動子的-35、-10區域與共有序列接近，來進行基因表達量的調節。 諸如上述的增強酶基因表達的方法，記載于國際公開第00/18935號小冊子、歐洲專利申請公開1010755號說明書等。以下，針對賦予細菌L-氨基酸生產能力的方法、以及被賦予了 L-氨基酸生產能力的細菌進行示例。L-蘇氨酸生產菌作為優選的具有L-蘇氨酸生產能力的微生物，可以列舉增強了 L-蘇氨酸生物合成系統酶中的1種或2種以上活性的細菌。作為L-蘇氨酸生物合成系統酶，可以列舉天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)、thr操縱子編碼的天冬氨酸激酶 I(thrA)、高絲氨酸激酶(thrB)、蘇氨酸合酶(thrC)、夭冬氨酸氨基轉移酶(天冬氨酸轉氨酶)(aspC)。括號內為該基因的簡記符號(下同)。所述酶中，特別優選天冬氨酸半醛脫氫酶、天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉移酶以及蘇氨酸合酶。L-蘇氨酸生物合成系統基因可以導入蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細菌中。作為蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細菌，可以列舉例如蘇氨酸脫氫酶活性缺損的TDH6株(特開2001-346578 號)等。L-蘇氨酸生物合成系統酶的酶活性受終產物L-蘇氨酸的抑制。因此，為了構建 L-蘇氨酸生產菌，優選對L-蘇氨酸生物合成系統酶進行修飾以使所述酶不受L-蘇氨酸的反饋抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，蘇氨酸操縱子形成弱化子(attenuator)結構。蘇氨酸操縱子的表達受到培養液中異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并且表達受到弱化作用的抑制。可通過去除弱化區中的前導序列或弱化子來實現該修飾(參照 Lynn, S. P. et al. 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69 ；國際公開第 02/26993 號小冊子；國際公開第2005/049808號小冊子)。蘇氨酸操縱子上游存在天然啟動子，可用非天然(non-naive)啟動子將其取代 (參考國際公開第98/04715號小冊子)。或者，可以構建蘇氨酸操縱.子使得蘇氨酸生物合成的相關的基因的表達受到λ噬菌體的阻遏物Oppressor)和啟動子的調控(參考歐洲專利第0593792號說明書)。而且，為了對細菌進行修飾使其不受L-蘇氨酸的反饋抑制， 也可以通過選擇對α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌株來實現。對于如上所述經修飾而不受L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子而言，優選的是其在宿主中拷貝數增加，或者是其連接于強啟動子而表達量提高。除了通過使用質粒的擴增來增加拷貝數，還可以通過使用轉座子、Mu噬菌體等向基因組上轉入蘇氨酸操縱子來增加拷貝數。理想的是，除了 L-蘇氨酸生物合成系統酶之外，還增強糖酵解系統、TCA循環和呼吸鏈中涉及的基因、調控這些基因表達的基因、和糖攝取基因。這些在L-蘇氨酸生產中有效的基因的實例包括轉氫酶基因(PntAB)(歐洲專利733712號說明書)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(PepC)(國際公開95/06114號小冊子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(歐洲專利877090號說明書)、棒狀桿菌型細菌或芽孢桿菌屬細菌的丙酮酸羧化酶基因(國際公開 99/18228號小冊子、歐洲申請公開1092776號說明書)。此外，增強賦予L-蘇氨酸抗性的基因、賦予L-高絲氨酸抗性的基因的表達，或賦予宿主L-蘇氨酸抗性、L-高絲氨酸抗性，也是理想的。賦予抗性的基因的實例包括rhtA基因(Livshits,V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154 :123-135)、rhtB 基因(歐洲專利申請公開第0994190號說明書)、rhtC基因(歐洲專利申請公開第1013765號說明書)和yfiK、 yeaS基因(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)。此外，關于對宿主賦予L-蘇氨酸抗性的方法，可參考歐洲專利申請公開第0994190號說明書、國際公開第90/04636號小冊子記載的方法。作為L-蘇氨酸生產菌和用于衍生L-蘇氨酸生產菌的親本株的例子，可以列舉 大腸桿菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國專利第5，175，107號、美國專利第5，705，371 號)、大腸桿菌472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美國專利第5，631，157號)、大腸桿菌 NRRL-21593 (美國專利第5，939，307號)、大腸桿菌FERM BP-3756 (美國專利第5，474，918 號)、大腸桿菌FERMBP-3519和FERM BP-3520 (美國專利第5，376，538號)、大腸桿菌 MG442 (Gusyatiner 等，1978. Genetika (俄語)，14 :947-956)、大腸桿菌 VL643 和 VL2055 (歐洲專利申請公開第1149911號)等屬于埃希氏桿菌屬的菌株，但不限于此。TDH-6菌株缺失thrC基因，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突變(leaky mutation)。該菌株的rhtA基因也有突變，該突變賦予對高濃度的蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。B-3996菌株攜帶PVIC40質粒，pVIC40是通過將含有突變的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到由RSF 1010獲得的載體中而獲得。這種突變的thrA基因編碼的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I對蘇氨酸的反饋抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19 日被保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics (全聯盟抗生素科學中心) (Nagatinskaya Street 3-A，117105 Moscow，Russia)，保藏號為 RIA 1867。該菌株也在 1987年4月7日保藏于俄羅斯國立工業微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), (IDorozhny proezd. ,IMoscow 117545, Russia), 保藏號為B-3996。還可以使用大腸桿菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作為L-蘇氨酸生產菌或用于衍生它的親本株。B-5318菌株是非異亮氨酸營養缺陷型的，其中溫度敏感的λ噬菌體Cl阻遏物和I3R啟動子取代了 PVIC40質粒中的蘇氨酸操縱子的調控區域。VKPM Β-5318菌株在 1990年5月3日國際保藏于俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM) (IDorozhny proezd.， 1Moscow117545, Russia)，保藏號為 VKPM B-5318。編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因位于以Genbank登錄號U00096登錄的大腸桿菌MG1655株的基因組序列上的堿基編號337 2，799，該基因編碼以GenBank登錄號AAC73113登錄的蛋白質。編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因位于以Genbank登錄號U00096登錄的大腸桿菌MG1655株的基因組序列上的堿基編號2，801 3，733，該基因編碼以GenBank登錄號AAC73114登錄的蛋白質。編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的thrC基因位于以Genbank登錄號U00096登錄的大腸桿菌MG1655株的基因組序列上的堿基編號3，734 5，020，該基因編碼以GenBank登錄號AAC73115登錄的蛋白質。這3個基因在編碼前導肽的thrL基因的下游以由thrL ABC構成的蘇氨酸操縱子的形式編碼。為了增加蘇氨酸操縱子的表達，優選從操縱子上除去影響轉錄的弱化子區域是有效的(國際公開第2005/049808號、國際公開第2003/097839號)。編碼對蘇氨酸的反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA 基因，加上thrB和thrC基因，可以作為一個操縱子從熟知的PVIC40質粒中獲得，該質粒存在于蘇氨酸生產株大腸桿菌VKPM B-3996菌株中，在美國專利No. 5，705，371中有詳述。rhtA基因是作為賦予高絲氨酸以及蘇氨酸抗性的基因(rht resistant tothreonine/homoserine,高絲氨酸/蘇氨酸抗性)而獲得的，其位于以Genbank登錄號 U00096登錄的大腸桿菌MG1655株的基因組序列上的堿基編號848，433 849，320 (互補鏈)，該基因編碼以GenBank登錄號AAC73900登錄的蛋白質。此外，已經證明提高rthA的表達的rhtA23突變是相對于ATG起始密碼子為_1位的位置上的G — A取代(Livshits， V. A. et al. 2003. ResMicrobiol. 154 123-135、歐洲專利申請公開第 1013765 號)。大腸桿菌的asd基因位于以Genbank登錄號U00096登錄的大腸桿菌MG 1655株的基因組序列上的堿基編號3，571，798 3，572，901 (互補鏈)，該基因編碼以GenBank登錄號AAC76458登錄的蛋白質。可以通過使用基于基因堿基序列制作的引物的PCR來獲得 (White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5 185-189 參照)。其它微生物的 asd 基因也可以以同樣的方式獲得。此外，大腸桿菌的aspC基因位于以Genbank登錄號U00096登錄的大腸桿菌MG 1655株的基因組序列上的堿基編號983，742 984，932 (互補鏈)，該基因編碼以GenBank 登錄號AAC74014登錄的蛋白質，可以通過PCR獲得。其它微生物的aspC基因也可以以同樣的方式獲得。L-賴氨酸生產菌以下，以L-賴氨酸生產菌及其構建方法為例進行說明。作為具有L-賴氨酸生產能力的菌株，可以例舉L-賴氨酸類似物抗性株或代謝調控突變株。作為L-賴氨酸類似物的例子，可以列舉氧化賴氨酸、賴氨酸氧肟酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下也簡記為“AEC”)、Y-甲基賴氨酸、α-氯己內酰胺等，但不限于此。對于所述賴氨酸類似物具有抗性的突變株，可以通過對屬于腸桿菌科的細菌或棒狀桿菌型細菌實施常規的人工突變處理來獲得。作為L-賴氨酸生產菌，具體可以列舉大腸桿菌AJ11442株(FERM ΒΡ-1543、NRRL Β-12185 ；參照特開昭56-18596號公報和美國專利第 4346170號說明書)、大腸桿菌VL611株(特開2000-189180號公報)等。此外，作為大腸桿菌的L-賴氨酸生產菌，也可以使用WC196株(參照國際公開第96/17930號小冊子)。此外，通過提高L-賴氨酸生物合成系統的酶活性也可以構建L-賴氨酸生產菌。所述酶活性的提高可以通過提高編碼酶的基因在細胞內的拷貝數、或對表達調節序列進行修飾來實現。用于增強基因表達的修飾可以通過例如利用基因重組技術提高細胞中基因的拷貝數來進行。例如，可以將包含gapA基因的DNA片段與在宿主細菌中發揮功能的載體、優選多拷貝型載體相連接，來制作重組DNA，然后再將其導入細菌進行轉化。提高基因的拷貝數還可以通過使如上所述的基因在細菌的基因組DNA上以多拷貝存在來實現。為了在細菌基因組DNA上多拷貝地導入基因，可以利用染色體DNA上多拷貝存在的序列作為靶標來進行同源重組。作為染色體DNA上多拷貝存在的序列，可以利用重復DNA或存在于轉移因子的端部的反向重復序列。此外，可以在存在于基因組上的gapA 基因的旁側隨機連接各種基因，也可以把多個這樣的基因來導入到基因組上的不必要的基因中。所述基因導入可以使用溫度敏感型載體，或者使用整合(integration)載體來實現。或者，也可以如特開平2-109985號公報所述那樣，將基因加載在轉座子上，使其發生轉移，從而將基因多拷貝地導入基因組DNA上。基因轉移到基因組上這一事實的確認， 可以通過以基因的一部分作為探針進行Southern雜交來確認。而且，除了上述的基因拷貝數擴增以外，基因表達的增強還可以通過下述方法實現采用國際公開00/18935號小冊子記載的方法，將基因組DNA上或質粒上的基因的各自的啟動子等表達調節序列替換為更強力的啟動子等表達調節序列，使各基因的-35、-10區域向共有序列接近，對提高基因表達的調節子進行擴增，或者對降低基因表達的調節子進行缺失或弱化。例如，Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、araBA啟動子、λ噬菌體的I3R啟動子、PL啟動子、tet啟動子、T7啟動子、φ 10啟動子等是已知的強力啟動子。 此外，還可以在gapA基因的啟動子區域、SD區域導入堿基取代等，將其修飾得更為強力。啟動子強度的評價方法和強力啟動子的例子在Goldstein等的論文(ftOkaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol.Annu. Rev. 1995. 1 :105-128)等中有記載。而且，已知對核糖體結合位點(RBQ與起始密碼子之間的間隔序列中，特別是對起始密碼子緊鄰上游的序列中的數個核苷酸的取代，對mRNA的翻譯效率有非常大的影響，可以對這些序列進行修飾。基因的啟動子等表達調節區域也可以使用啟動子搜索載體、GENEITX等基因解析軟件來確定。通過所述啟動子取代或修飾，基因的表達得到強化。表達調節序列的取代可以采用例如使用溫度敏感型質粒的方法、Red驅動整合法(W02005/01017O等。作為編碼L-賴氨酸生物合成系統酶的基因，可以列舉二氫吡啶二羧酸合成酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(IysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脫碳酸酶基因(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(以上、國際公開第96/40934 號小冊子)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(特開昭60-87788號公報)、天冬氨酸氨基轉移酶基因(aspC)(特公平6-1020 號公報)、二氨基庚二酸差向異構酶基因(dapF) (特開2003-135066號公報)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)(國際公開第00/61723號小冊子)等二氨基庚二酸途徑的酶的基因，或者高烏頭酸水合酶基因(特開2000-157276 號公報)等氨基已二酸途徑的酶等的基因。此外，親本菌株中涉及能量效率(energy efficiency)的基因(cyo) (EP 1170376A)、編碼煙酰胺核苷酸轉氫酶的基因(pntAB)(美國專利5，830，716)、編碼具有L-賴氨酸分泌活性的蛋白質的ybjE基因(W02005/073390)、編碼谷氨酸脫氫酶的基因(gdhA) (Valle F. et al. 1983. Gene 23 =199-209)或它們的任意組合的基因表達水平可以增加。而且，括號內為所述基因的簡記符號。已知大腸桿菌來源的野生型二氫吡啶二羧酸合成酶受L-賴氨酸的反饋抑制，大腸桿菌來源的野生型天冬氨酸激酶受L-賴氨酸的抑制和反饋抑制。因此，在使用dapA基
21因和IysC基因時，優選這些基因是不受L-賴氨酸的反饋抑制的突變型基因。作為編碼不受L-賴氨酸的反饋抑制的突變型二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA，可以列舉編碼具有第118位的組氨酸殘基被取代成酪氨酸殘基的序列的蛋白質的DNA。此外，作為編碼不受L-賴氨酸的反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的DNA，可以列舉編碼具有第352 位的蘇氨酸殘基被取代為異亮氨酸殘基、第323位的甘氨酸殘基被取代為天冬酰胺殘基、 第318位的甲硫氨酸被取代為異亮氨酸的序列的AKIII的DNA(關于這些突變體，可參見美國專利第5661012號和第6040160號說明書)。突變型DNA可以通過利用PCR等的定點突變方法獲得。而且，作為包含編碼突變型氫吡啶二羧酸合成酶的突變型dapA和編碼突變型天冬氨酸激酶的突變型IysC的質粒，已知有廣宿主域質粒RSFD80、pCAB l、pCABD2 (美國專利第6040160號說明書)。用該質粒轉化的大腸桿菌JM109株(美國專利第6040160號說明書)命名為AJ12396，該株于1993年10月觀日保藏在日本通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(現為獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心)，保藏號FERM P-13936 ；并于1994年11月1日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERMBP-4859。 RSFD80可采用公知方法從AJ12396株獲取。在L-賴氨酸生產中，作為這樣的酶，有高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(cadA， ldcC)、蘋果酸酶等，該酶的活性降低或缺損的菌株記載于國際公開第1095/^23864號、第 W096/17930號小冊子、第W02005/010175號小冊子等。為了使賴氨酸脫羧酶活性降低或缺損，優選降低編碼賴氨酸脫羧酶的cadA基因和IdcC基因這兩者的表達。降低這兩個基因的表達可以按照W02006/078039號小冊子所述的方法來進行。作為降低或者缺損所述酶活性的方法，可以采用常規的突變處理法或基因重組技術，在基因組上的上述酶的基因中導入使得細胞中該酶的活性降低或缺損的突變。這樣的突變的導入可以如下地實現例如，通過基因重組缺損染色體上的編碼酶的基因，或者對啟動子、shine-dalgarno(SD)序列等表達調節序列進行修飾，等等。此外，還可以這樣完成向基因組上的編碼酶的區域導入氨基酸取代(錯義突變)、或者導入終止密碼子(無義突變)、或者導入添加或缺失一 二個堿基的移碼突變，或者使基因的一部分或整個區域缺失(Wang，J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :9405-9410 ；Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :594-602 ；Qiu, Ζ. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272 8611-8617 ；ffente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol. Chem. 266 :20833-20839)。此外，酶活性的降低或缺損還可以這樣實現構建編碼突變酶的基因，其中編碼區域整體或部分缺失，通過同源重組等用該基因取代染色體上的正常基因，或者將轉座子、IS因子導入到該基因中。例如，為了通過基因重組導入使得上述酶的活性降低或缺損的突變，可以采用諸如以下的方法。對目的基因的部分序列進行修飾，制備不產生正常發揮功能的酶的突變型基因，用含該基因的DNA轉化屬于腸桿菌科的細菌，通過突變型基因與染色體上的基因之間發生重組，可以將染色體上的目的基因替換成突變型。如上所述的利用同源重組的基因取代包括稱為 “Red 驅動整合(Red-driven integration)” 的方法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 :6640-6645)、組合使用 Red 驅動整合法與 λ 噬菌體來源的切出系統(Cho，Ε. H.，Gumport, R. I.，Gardner, J. F. J. 2002. Bacteriol. 184 =5200-5203)的方法(參照W02005/010175號)等使用線性DNA的方法，或者使用含溫度敏感型復制起點的質粒的方法等(美國專利第6303383號、特開平05-007491 號公報)。此外，基于如上述的利用了同源重組的基因取代的位點特異性突變導入還可以利用在宿主中不具有復制能力的質粒來進行。作為優選的L-賴氨酸生產菌，可以列舉大腸桿菌WC196 Δ cadAAldcC/ PCABD2 (W02006/078039)。該菌株是通過在WC196株中破壞編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和 IdcC基因、并導入包含賴氨酸生物合成系統基因的質粒pCABD2(美國專利第6，040，160 號)而構建的菌株。WC196株是由大腸桿菌K-12來源的W3110株出發，用突變型IysC基因替換W3110株染色體上的野生型IysC基因，而后賦予AEC抗性而選育得到的菌株(美國專利第5，827，698號)，所述突變型IysC基因編碼第352位的蘇氨酸被替換成異亮氨酸， 從而解除了 L-賴氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶III (美國專利第5，661，012號)。WC196 株被命名為大腸桿菌AJ13069，已于1994年12月6日保藏在工業技術院生命工學工業技術研究所(現為獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心、〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERM P-14690 ；并于1995年9月四日轉(為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERM BP-5252(美國專利第)5，827，698 號)。WC196 AcadA Δ IdcC本身也是優選的L-賴氨酸生產菌。WC196 Δ cadA Δ IdcC被命名為AJ110692，并于2008年10月7日國際保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566日本國茨(城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERM ΒΡ-11027。)pCABD2包含編碼具有解除了 L-賴氨酸反饋抑制的突變的大腸桿菌來源二氫吡啶二羧酸合成酶(DDPQ的突變型dapA基因、編碼具有解除了 L-賴氨酸反饋抑制的突變的大腸桿菌來源天冬氨酸激酶III的突變型IysC基因、編碼大腸桿菌來源二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因、以及編碼乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)來源二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因(國際公開第W095/16042、W001/53459號小冊子)。增強如上所述的L-賴氨酸生物合成相關酶的基因表達的方法、降低酶活性的方法對于其它編碼L-氨基酸生物合成酶的基因也同樣適用。作為具有L-賴氨酸生產能力的棒狀桿菌型細菌，可以列舉AEC抗性突變株(乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum) AJ 11082 (NRRLB-11470)株等參照特公昭56-1914號公報、特公昭56-1915號公報、特公昭57-14157號公報、特公昭57-14158號公報、特公昭57-30474號公報、特公昭58-10075號公報、特公昭59-4993號公報、特公昭 61-35840號公報、特公昭62-24074號公報、特公昭62-36673號公報、特公平5-11958號公報、特公平7-11M37號公報、特公平7-11M38號公報)；生長需要L-高絲氨酸等氨基酸的突變株(參照特公昭48-28078號公報、特公昭56-6499號公報)；顯示AEC抗性、且需要L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸等氨基酸的突變株(參照美國專利第3708395號以及第3825472號說明書)；顯示DL-α -氨基-ε -己內酰胺、α -氨基-月桂內酰胺、天冬氨酸-類似物、磺胺類藥、醌類、N-月桂酰亮氨酸抗性的L-賴氨酸生產突變株；顯示草酰乙酸脫碳酸酶(脫羧酶)或呼吸體系酶抑制劑抗性的L-賴氨酸生產突變株(特開昭50-53588號公報、特開昭50-31093號公報、特開昭52-102498號公報、特開昭53-9394號公報、特開昭53-86089號公報、特開昭55-9783 號公報、特開昭55-9759號公報、特開昭56-3四95號公報、特開昭56-39778號公報、特公昭 53-43591號公報、特公昭53-1833號公報)；需要肌醇或乙酸的L-賴氨酸生產突變株(特開昭55-9784號公報、特開昭56-8692號公報)；對氟代丙酮酸或34°C以上的溫度顯示敏感性的L-賴氨酸生產突變株(特開昭55-9783號公報、特開昭53-86090號公報)；對乙二醇顯示抗性、且生產L-賴氨酸的短桿菌屬或棒桿菌屬的生產突變株(美國專利第4411997號說明書)等。L-半胱氨酸生產菌L-半胱氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如用編碼反饋抑制抗性絲氨酸乙酰轉移酶的不同cysE等位基因轉化的大腸桿菌JM15 (美國專利6，218，168，俄羅斯專利申請2003121601)，具有過表達編碼適于向細胞分泌有毒物質的蛋白的基因的大腸桿菌W3110 (美國專利5，972，663)，半胱氨酸脫巰基酶(cysteinedesulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(特開平11-155571號)；由cysB 基因編碼的半胱氨酸調節子的正向轉錄調控物活性增強的大腸桿菌W3110(國際公開第 0127307 號)，等等。L-亮氨酸生產菌L-亮氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括，但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株對亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美國專利第 6，124，121號))或對亮氨酸類似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等)有抗性的大腸桿菌菌株(特公昭62-34397號和特開平8-70879 號)；通過國際公開第96/069 號中描述的基因工程方法獲得的大腸桿菌菌株；大腸桿菌 H-9068 (特開平8-70879號)，等等。用于本發明的細菌可以通過增加涉及L-亮氨酸生物合成的一種以上的基因的表達來加以改進。這些基因的實例可優選例舉以編碼解除了 L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶的突變IeuA基因(美國專利第6，403，342號)為代表的IeuABCD操縱子中的基因。此外，可以通過增加編碼從細菌細胞分泌L-氨基酸的蛋白的一種以上的基因的表達來改進用于本發明的細菌。這類基因的實例包括1^2682和1^2683基因(ygdH基因)(歐洲專利申請公開第1239041號)。棒狀桿菌型細菌中的L-異亮氨酸生產菌的例子包括擴增了編碼支鏈氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒狀桿菌型細菌(特開2001-169788)、通過與L-賴氨酸生產菌進行原生質體融合而被賦予了 L-異亮氨酸生產能力的棒狀桿菌型細菌(特開昭62-74293)、 增強了高絲氨酸脫氫酶的棒狀桿菌型細菌(特開昭62-91193)、蘇氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特開昭 62_195四3)、α -酮丙二酸(α -ketomalonic acid)抗性菌株(特開昭61-15695)和甲基賴氨酸抗性菌株(特開昭61-15696)。L-組氨酸生產菌L-組氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株大腸桿菌M株(VKPM B-5945、俄羅斯專利第2003677號)、大腸桿菌80株 (VKPM B-7270、俄羅斯專利第2119536號)、大腸桿菌NRRLB-12116-B12121 (美國專利第 4，388，405 號)、大腸桿菌 H-9342(FERM BP-6675)以及 H-9343 (FERM BP-6676)(美國專利第6，344，347號)、大腸桿菌H-9341 (FERM BP-6674)(歐洲專利申請公開第1085087號)、 大腸桿菌AI80/pFM201 (美國專利第6，258，554號)，等等。L-組氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子還包括如下菌株，所述菌株中編碼 L-組氨酸生物合成系統酶的1種以上的基因的表達增強。相關基因的實例包括ATP磷酸核糖基轉移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP環化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基亞氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸異構酶基因(pho sphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酉先胺轉移酶基因(hisH)、組氨醇磷酸氨基轉移酶基因(hisC)、組氨醇磷酸酶基因(hisB)、組氨醇脫氫酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI編碼的L-組氨酸生物合成系統酶被L-組氨酸所抑制，因此還可以通過向ATP磷酸核糖基轉移酶基因(hisG)中引入誘導可賦予對反饋抑制的抗性的突變，來有效地增加產生L-組氨酸的能力(俄羅斯專利2003677和2119536)。具有L-組氨酸生產能力的菌株具體實例包括大腸桿菌FERM-P 5038和5048，其已經導入了攜帶編碼L-組氨酸生物合成系統酶的DNA的載體(特開昭56-005099號)，導入了用于氨基酸輸送的基因的大腸桿菌菌株(歐洲專利申請公開第1016710號)，賦予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素抗性的大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270，俄羅斯專利2119536號)，等等。L-谷氨酸生產菌 L-谷氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括、但不限于大腸桿菌 (E. coli)VL334thrC+(EP 1172433)等屬于埃希氏菌屬的菌株。大腸桿菌VL3!34 (VKPM B-1641)是L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中有突變(美國專利4，278，765)。利用可在野生型大腸桿菌菌株K_12 (VKPM B-7)細胞中增殖的噬菌體 Pl，通過常規轉化方法來轉移thrC基因的野生型等位基因。結果，獲得了 L-異亮氨酸營養缺陷型的L-谷氨酸生產菌VL3!MthrC+(VKPM B-8961)。L-谷氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于L-谷氨酸生物合成系統酶中的1種或2種以上的活性得到增強的菌株。作為所述基因的例子，可以列舉 谷氨酸脫氫酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、異檸檬酸脫氫酶 (icdA)、順烏頭酸水合酶(acnA，acnB)、檸檬酸合酶(gltA)、甲基檸檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、丙酮酸脫氫酶(aceEF，IpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(PPsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸變位酶(pgmA，pgml)、磷酸甘油酸激酶 (Pgk)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapA)、丙糖磷酸異構酶(tpiA)、果糖二磷酸醛縮酶(fbp)、 磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸異構酶(pgi)等。所述酶中，優選谷氨酸脫氫酶、 檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基檸檬酸合酶。作為經過了修飾使得檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達增加的菌株的例子，可以列舉歐洲專利申請公開第1078989號、歐洲專利申請公開第955368號以及歐洲專利申請公開第952221號中公開的菌株。作為L-谷氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子，還可以列舉下述酶的活性降低或缺損的菌株，所述酶催化從L-谷氨酸生物合成途徑改道而合成L-谷氨酸以外的化合物。作為這樣的酶的例子，可以列舉異檸檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脫氫酶
25(sucA)、磷酸乙酰轉移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羥基酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶 (ilvl)、甲酸乙酰轉移酶(pfl)、乳酸脫氫酶(Idh)、谷氨酸脫羧酶(gadAB)等。α -酮戊二酸脫氫酶活性缺損、或α-酮戊二酸脫氫酶活性降低的屬于埃希氏菌屬的細菌及其獲取方法在美國專利第5，378，616號和第5，573，945號中有記載。作為具體例子，可以列舉下述菌株。大腸桿菌W3IIOsucA Kmr大腸桿菌AJU624(FERM BP-3853)大腸桿菌AJU6^(FERM BP-3854)大腸桿菌AJ1^49(FERM BP-4881)大腸桿菌W3110sucA: :Kmr是通過破壞大腸桿菌W3110的α -酮戊二酸脫氫酶基因(以下也稱“sucA基因”)而得到的菌株。該菌株的α-酮戊二酸脫氫酶完全缺損。此外，作為α -酮戊二酸脫氫酶活性降低的棒狀桿菌型細菌，可以例舉以下菌株。乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum) L30-2 株(特開 2006-340603 號說明書)乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum) Δ S 株(國際公開 95/34672 號小冊子)乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172 ；參照法國專利公報9401748號說明書)黃色短桿菌AJU822 (FERM BP-4173 ；法國專利公報9401748號說明書)谷氨酸棒桿菌AJU823 (FERM BP-4174 ；法國專利公報9401748號說明書)谷氨酸棒桿菌L30-2株(特開2006-340603號)作為L-谷氨酸生產菌的其它例子，可以列舉屬于埃希氏菌屬、且對天冬氨酸代謝拮抗物質有抗性的菌株。所述菌株可以缺損α-酮戊二酸脫氫酶，可以例舉大腸桿菌 AJ13199 (FERM BP-5807)(美國專利第5，908，768號)，以及還降低了 L-谷氨酸分解能力的 FFRM P-12379(美國專利第 5,393,671 號)；AJ13138 (FERM BP-5565)(美國專利第 6，110，714 號)等。作為Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產菌的例子,可以列舉Pantoeaananatis AJ13355株。該菌株是從靜R縣磐田市的土壤中作為能夠在低pH下在含L-谷氨酸和碳源的培養基中生長的菌株而分離出來的菌株。Pantoeaananatis AJ13355于1998年2月19 日被保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(地址〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERM P-16644 ；于1999年1月11日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERM BP-6614。而且，該菌株在分離出來時被鑒定為成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)，并作為成團腸桿菌AJ13355保藏，但近年來通過16S rRNA的堿基序列解析等，其被重新分類為Pantoea ananatis。此外，作為Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產菌，可以列舉α -酮戊二酸脫氫酶 (aKGDH)活性缺損、或者a KGDH活性降低的屬于泛菌屬的細菌。作為這樣的菌株有缺損 AJ13355株的a KGDH-El亞基基因(sucA)而得到的AJ13356 (美國專利第6，331，419號)， 以及從AJ13355株中作為粘液質低生產突變菌株選擇出來的SC17株衍生的sucA基因缺損株SC17sucA(美國專利第6，596，517號)。AJ13356于1998年2月19日保藏于工業技術院生命工學工業技術研究所(現為獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心、 〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERM P-16645，并于1999年1月11日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERM BP-6616。AJ13355 以及AJ13356在上述保藏機構是作為EntercAacter agglomerans保藏的，但是在本說明書中，將其描述為Pantoeaananatis。此外，SC17sucA株的內部編號為AJ417，已于2004年2 月沈日保藏于前述的產業技術綜合研究所專利生物保藏中心，保藏號FERMBP-08646。而且，作為屬于Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產菌，可以列舉SC17sucA/ RSFCPG+pSTVCB 株、AJ13601 株、NP106 株以及 NAl 株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株是在SC17sucA株中導入大腸桿菌來源的包含檸檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(PPsA)和谷氨酸脫氫酶基因(gdhA)的質粒RSFCPG以及乳發酵短桿菌 (Brevibacteriumlactofermentum)來源的包含檸檬酸合酶基因(gltA)的質粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株是從該SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株中作為低pH下顯示出對高濃度 L-谷氨酸的抗性的菌株而選擇出的菌株。此外，NP106株是質粒RSFCPG+pSTVCB從AJ13601 株脫落而得到的菌株。AJ13601株于1999年8月18日保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(亍305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)， 保藏號FERMP-17516，并于2000年7月6日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERM BP-7207。而且，作為賦予棒狀桿菌型細菌L-谷氨酸生產能力的方法，可以采用擴增編碼動力敏感離子通道(mechanosensitive channel)的yggB基因的方法(國際公開 W02006/070944號)，導入在編碼區域內具有突變的突變型yggB基因的方法。yggB基因位于以Genbank登錄號NC_003450登錄的谷氨酸棒桿菌ATCC13032株的基因組序列上的堿基編號1，337，692 1，336，091 (互補鏈)，該基因編碼以GenBank登錄號NP_600492登錄的膜蛋白質(也稱為NCgl 1221)。作為賦予或者增強L-谷氨酸生產能力的其它方法，還可以列舉賦予對有機酸類似物、呼吸鏈抑制劑等的抗性的方法，和賦予對細胞壁合成抑制劑的敏感性的方法。例如 賦予單氟乙酸抗性的方法(特開昭50-113209)、賦予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法 (特開昭57-065198)、削弱脲酶的方法(特開昭52-038088)、賦予丙二酸抗性的方法(特開昭52-038088)、賦予苯并吡喃酮或萘醌類抗性的方法(特開昭56-1889)、賦予HOQNO抗性的方法(特開昭56-140895)、賦予α -酮丙二酸抗性的方法(特開昭57-2689)、賦予胍抗性的方法(特開昭56-35981)和賦予青霉素敏感性的方法(特開平4-88994)，等等。作為這樣的抗性菌的具體例子，可以列舉諸如下述的菌株。黃色短桿菌AJ3949 (參照 FERM ΒΡ-2632 特開昭 50-113209)谷氨酸棒桿菌AJl 1628(參照 FERM P-5736 ；特開昭 57-065198)黃色短桿菌AJl 1355 (參照FERM P-5007 ；特開昭56-1889號公報)谷氨酸棒桿菌AJl 1368 (參照FERM P-5020 ；特開昭56-1889號公報)黃色短桿菌AJl 1217(參照FERM P-4318 ；特開昭57-2689號公報)谷氨酸棒桿菌AJl 1218 (參照FERM P-4319 ；特開昭57-2689號公報)黃色短桿菌AJl 1564(參照FERM P-5472 ；特開昭56-140895公報)黃色短桿菌AJ11439 (參照FERM P-5136 ；特開昭56-35981號公報)
谷氨酸棒桿菌H7684 (參照FERM BP-3004 ；特開平04-88994號公報)乳發酵短桿菌(Brevibacteri um lactofermentum) AJl 1426 (參,照 FERMP—5123 ； 特開平56-048890號公報)谷氨酸棒桿菌AJl 1440(參照FERM P-5137 ；特開平56-048890號公報)乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum) AJl 1796 (參照 FERMP-6402 ；特開平58-158192號公報)L-苯丙氨酸生產菌L-苯丙氨酸生產菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生產菌的親本株的實例，可以列舉， 但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶以及酪氨酸阻遏物缺損的大腸桿菌 AJ12739(tyrA: :TnlO, tyrR) (VKPMB-8197)(國際公開 03/044191 號)，攜帶了編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的突變型pheA34基因的大腸桿菌 HW1089(ATCC55371)(美國專利第 5，354, 672 號)，大腸桿菌MWEC101_b (KR8903681)、大腸桿菌 NRRL B-1214UNRRL B_12145、NRRL B-12146 以及 NRRLB-12147 (美國專利第 4,407,952 號)等。此外，也可以使用攜帶了編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因的大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERMBP-12662)以及命名為 AJ l 04的大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)作為親本株(EP 488424B1) 0此外，還可使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質的活性增加的屬于埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產菌(美國專利申請公開2003/0148473號以及 2003/0157667、國際公開 03/044192 號)。作為屬于棒狀桿菌型細菌的苯丙氨酸生產菌，可以使用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性減弱的谷氨酸棒狀桿菌BPS-13株(FERMBP-1777)，K77 (FERM BP-2062) 和K78(FERM BP-2063)(歐洲專利公開公報331145號，特開平02303495)，酪氨酸營養缺陷株(特開平05049489)等。此外，對于苯丙氨酸生產菌，通過進行修飾使得將副產物攝入細胞內，例如通過增加L-色氨酸攝取基因tnaB或mtr或者L-酪氨酸攝取基因tyrP的表達量，也可以獲得高效地生產L-苯丙氨酸的菌株(EP1484410)。L-色氨酸生產菌L-色氨酸生產菌或用于誘導L-色氨酸生產菌的親本株的例子包括、但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株大腸桿菌JP4735/pMU3(^8 (DSM10122)和JP6015/ PMU91 (DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，該酶由突變的trpS基因編碼(美國專利5，756，345)；大腸桿菌SV164(pGH5)，其具有編碼不受絲氨酸反饋抑制性的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼不受色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)的trpE等位基因(美國專利6，180，373)；色氨酸酶缺陷的大腸桿菌 AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264) (美國專利4，371，614)；磷酸烯醇丙酮酸的生產能力增加的大腸桿菌AGX17/pGX50， pACKG4-pps(W09708333，美國專利6，319，696)等等。此外，還可以使用由yedA基因或yddG 基因編碼的蛋白的活性增強的屬于埃希氏菌屬的L-色氨酸生產菌(美國專利申請公開 2003/0148473 和 2003/0157667)。
作為L-色氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子，還可以列舉選自鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶 (aroG)、3_脫氫奎寧酸合酶(aroB)、莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5_烯醇酸丙 ||酉先莽草酸 3- 舞酸合Sl (aroA, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)、分支酸合酶(aroC)、預苯酸脫水酶、分支酸變位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1種或2種以上酶的活性增強的菌株。預苯酸脫水酶和分支酸變位酶以雙功能酶(chorismatemutase/ prephenate dehydrogenase (CM/PDH))的形式被pheA基因編碼。所述酶之中，特別優選磷酸甘油酸脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脫氫奎寧酸合酶、莽草酸脫水酶、莽草酸激酶、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、預苯酸脫水酶、分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者都受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此可以向這些酶中引入使反饋抑制解除的突變。具有此類突變的菌株的具體實例包括具有脫敏型鄰氨基苯甲酸合酶的大腸桿菌SV164、和通過將質粒 pGH5(國際公開94/08031)導入大腸桿菌SV164而獲得的轉化菌株，所述質粒pGH5包含編碼解除了反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的突變serA基因。L-色氨酸生產菌或用于誘導L-色氨酸生產菌的親本株的例子還包括導入了包含編碼抑制解除型鄰氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操縱子的菌株(特開昭57-71397號，特開昭62-244382號，美國專利第4，371，614)。此外，可以通過增加色氨酸操縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達來賦予L-色氨酸生產能力。色氨酸合酶由α和β亞單位組成，這兩種亞單位分別由trpA和trpB基因編碼。另外，可以通過增強異檸檬酸裂合酶-馬來酸合酶操縱子的表達來改進L-色氨酸生產能力(國際公開2005/103275)。作為棒狀桿菌型細菌，可以使用下列菌株磺胺胍(sulfaguanidine)抗性株谷氨酸棒桿菌AJ12118(FERM BP-478，特許01681002號)、導入了色氨酸操縱子的棒狀桿菌型細菌(特開昭63M0794號公報)，導入了編碼棒狀桿菌型細菌來源的莽草酸激酶的基因的棒狀桿菌型細菌(特開01994749號公報)。L-脯氨酸生產菌作為L-脯氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子，可以列舉ilvA基因缺損、且能夠生產L-脯氨酸的大腸桿菌702ilvA(VKPM B-8012)(歐洲專利公開公報1，172，433號) 等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。本發明中使用的細菌，可以通過增加一種以上參與L-脯氨酸生物合成的基因的表達來進行改良。作為L-脯氨酸生產菌所優選的基因的例子，可以列舉編碼解除了 L-脯氨酸反饋抑制的谷氨酸激酶的ProB基因(德國專利第3127361號)。而且，本發明中使用的細菌，可以通過增加一種以上編碼從細菌細胞中分泌L-氨基酸的蛋白質的基因的表達來進行改良。作為這樣的基因，可以列舉1^682基因和1^683基因(ygdH基因)(歐洲專利公開公報1，239，041號)。作為具有L-脯氨酸生產能力的屬于埃希氏菌屬的細菌的例子，可以列舉NRRL B-12403以及NRRL B-1M04 (英國專利第2075056號)、VKPMB-8012 (俄羅斯專利申請 2000124295)、德國專利第3127361號所述的質粒突變體、Bloom F. R等(The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34)所述的質粒突變體等大腸桿菌株。L-精氨酸生產菌
L-精氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括、但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌237菌株(VKPM B-7925)(美國專利申請公開2002/05831 及其帶有突變的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄羅斯專利申 it 2, 001, 112，869)，大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926)(歐洲專利公開公報1，170，358號)， 引入了編碼N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的精氨酸生產株(歐洲專利公開公報1，170, 361號)，等等。L-精氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子還包括編碼L-精氨酸生物合成系統酶的1種以上基因的表達增加的菌株。相關基因的實例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶基因(argC)、鳥氨酸乙酰轉移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鳥氨酸轉氨酶基因(argD)、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、 精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。L-纈氨酸生產菌L-纈氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于經修飾而過表達 iIvGMEDA操縱子的菌株(美國專利5，998，178)。優選將衰減所需的ilvGMEDA操縱子的區域移除以使操縱子的表達不會被產生的L-纈氨酸所削弱。此外，優選將操縱子中的ilvA 基因破壞從而降低蘇氨酸脫氨酶的活性。L-纈氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子還包括具有氨酰t-RNA合成酶突變的突變株(美國專利5，658，766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970，該菌株在編碼異亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突變。已將大腸桿菌VL1970在1988年6月M日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM) (IDorozhny Proezd. , 1 Moscow 117545，Russia)， 保藏號為VKPM B-4411。此外，還可以使用生長需要硫辛酸(lipoic acid)的突變株和/或缺乏H+-ATP酶的突變株(國際公開96/06926)作為親本株。作為棒狀桿菌型細菌中的L-纈氨酸生產菌，包括例如通過修飾而增強了編碼 L-纈氨酸生物合成相關酶的基因的表達的菌株。L-纈氨酸生物合成相關酶的實例包括由ilvBNC操縱子編碼的酶，S卩，由ilvBN編碼的乙酰羥酸合酶、由ilvC編碼的異構還原酶 (isomero-reductase)(國際公開00/50624)。此外，由于iIvBNC操縱子受到L-纈氨酸和 /或L-異亮氨酸和/或L-亮氨酸的操縱子表達調控(transcriptional regulation)，所以最好解除弱化作用，以解除由所生成的L-纈氨酸導致的表達抑制。作為具有L-纈氨酸生產能力的棒狀桿菌型細菌，可以通過降低或者缺損至少一種與減少L-纈氨酸產生的物質代謝途徑相關的酶的活性來進行。例如，可以考慮降低涉及L-亮氨酸合成的蘇氨酸脫水酶的活性，或降低涉及D-泛酸合成的酶的活性(國際公開 W00050624)。其它賦予L-纈氨酸生產能力的方法還包括例如賦予對氨基酸類似物等的抗性的方法。例如，可以列舉L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸營養缺陷性的、并對D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的、并且具有L-纈氨酸生產能力的突變菌株(FERM P-1841， FERM P-29，特公昭53-025034)，對聚酮類有抗性的突變菌株(FERM P-1763, FERM P-1764 ； 特公平06-065314)，在以乙酸為唯一碳源的培養基中對L-纈氨酸有抗性、且在以葡萄糖為唯一碳源的培養基中對丙酮酸類似物(氟代丙酮酸(fluoropyruvic acid)等)敏感的突變菌株(FERM BP-3006, BP-3OO7,特許:30( 9 號)。L-異亮氨酸生產菌L-異亮氨酸生產菌或用于衍生L-異亮氨酸生產菌的親本株的例子包括，但不限于對6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突變株(特開平5-304969號)，對異亮氨酸類似物如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突變株，以及對DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變株(特開平5-130882號)。此外，還可以使用以編碼涉及L-異亮氨酸生物合成的蛋白(如蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥酸合酶 (acetohydroxatesynthase)等)的基因轉化的重組菌株作為親本株(特開平2_458號， FR0;356739，和美國專利第 5，998，178 號)。屬于棒狀桿菌型細菌的L-異亮氨酸生產菌的例子包括擴增了編碼支鏈氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒狀桿菌型細菌(特開2001-169788)、通過與L-賴氨酸生產菌進行原生質體融合而被賦予了 L-異亮氨酸生產能力的棒狀桿菌型細菌(特開昭62-74293)、 增強了高絲氨酸脫氫酶的棒狀桿菌型細菌(特開昭62-91193)、蘇氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特開昭 62_195四3)、α -酮丙二酸(α -ketomalonic acid)抗性菌株(特開昭61-15695)和甲基賴氨酸抗性菌株(特開昭61-15696)。L-甲硫氨酸生產菌L-甲硫氨酸生產菌或用于衍生它的親本株的例子包括、但不限于L-蘇氨酸營養缺陷株、對正亮氨酸有抗性的突變株(特開2000-139471號)。而且，還可以使用缺損了甲硫氨酸阻遏物的菌株、用編碼高絲氨酸轉琥珀酰酶、胱硫醚Y-合酶等L-甲硫氨酸生物合成相關蛋白質的基因轉化過的重組菌株作為親本株(特開2000-139471號)。在通過基因重組來培育上述L-氨基酸生產菌時，所使用的基因不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不損害所編碼的蛋白質的功能的前提下，還可以使用該基因的同源物、人工修飾體等具有保守突變的基因。即，還可以是下述基因，所述基因編碼具有在公知的蛋白質的氨基酸序列中包含一個或數個位置上的一個或數個氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白質。這里，所謂“一個或數個”，雖然因氨基酸殘基的種類或其在蛋白質的立體結構中的位置而異，但具體地是指優選1 20個、更優選1 10個、更優選1 5個。作為保守突變，當取代部位為芳族氨基酸時，是指在Wie、Trp, Tyr之間相互取代的突變，當取代部位為疏水性氨基酸時，是指在Leu、lie、Val之間相互取代的突變，當取代部位為極性氨基酸時，是指在Gin、Asn之間相互取代的突變，當取代部位為堿性氨基酸時，是指在Lys、Arg, His之間相互取代的突變，當取代部位為酸性氨基酸時，是指在Asp、Glu之間相互取代的突變，當取代部位為帶有羥基的氨基酸時，是指在％r、Thr之間進行相互取代的突變。保守突變的代表是保守取代，作為可視作保守取代的取代，具體地可以列舉從Ala到Ser或Thr 的取代，從Arg到Gin、His或Lys的取代，從Asn到Glu、Gin、Lys、His或Asp的取代，從 Asp 到 Asn、Glu 或 Gln 的取代，從 Cys 到 Ser 或 Ala 的取代，從 Gln 到 Asn、Glu、Lys、His、 Asp或Arg的取代，從Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，從Gly到Pro的取代，從His 到 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 的取代，從 Ile 到 Leu、Met、Val 或 Wie 的取代，從 Leu 到 lie、 Met、Val 或 Phe 的取代，從 Lys 到 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 的取代，從 Met 到 lie、Leu、Val或Phe的取代，從Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，從Ser到Thr或Ala的取代，從 Thr到Ser或Ala的取代，從Trp到Phe或Tyr的取代，從Tyr到His、Phe或Trp的取代， 以及從Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基于基因所來源的微生物的個體差異、種間差異等情形而天然發生的突變 (mutant或variant)而產生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。這樣的基因例如可以這樣獲得采用定點突變法對公知基因的堿基序列進行修飾，使得被編碼的蛋白質的特定部位處的氨基酸殘基包含取代、缺失、插入或增加。而且，具有如上所述的保守突變的基因還可以是編碼下述蛋白質的基因就編碼的氨基酸序列全長而言，其與野生型蛋白質具有80%以上、優選90%以上、更優選95%以上、特別優選97%以上的同源性，且具有與野生型蛋白質等同的功能。此外，可以將基因序列中各自的密碼子取代為易于在基因所導入的宿主中使用的密碼子。具有保守突變的基因可以通過突變劑處理等常規突變處理中使用的方法來獲得。此外，基因還可以是下述DNA，所述DNA與公知基因序列的互補序列或可由所述互補序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有與公知基因產物等同的功能的蛋白質。 這里，“嚴格條件”，是指形成所謂特異性雜交體，但不形成非特異性雜交體的條件。舉例說明在具有高同源性的DNA之間、例如具有80%以上、優選90%以上、更優選95%以上、 特別優選97%以上的同源性的DNA之間發生雜交，而同源性低于上述的DNA之間則不發生雜交的條件；或者在與常規Southern雜交的洗滌條件即60°C、1 X SSC、0. 1 % SDS，優選 0. 1XSSC、0. SDS，更優選68°C、0. 1XSSC、0. 1 % SDS相當的鹽濃度、溫度下，洗滌1次更優選2 3次的條件。作為探針，也可以使用基因的互補序列的一部分。這種探針可以通過PCR制備，其中PCR以基于公知的基因序列制備的寡核苷酸為引物，以包含這些堿基序列的DNA片段為模板來進行。例如，當使用300bp左右長度的DNA片段作為探針時，雜交的洗滌條件可以是例如 50°C、2XSSC、0. 1% SDS0上述的關于基因同源物以及保守突變的記載，同樣適用于前述的脂肪酶基因。<3>L_氨基酸的生產方法在本發明的L-氨基酸生產方法中，用含微型藻類的所述處理物的培養基培養具有L-氨基酸生產能力的細菌，在培養物中生產并蓄積L-氨基酸，并從該培養物收集L-氨基酸。或者，(a)用培養基培養微型藻類，將該培養物用選自破碎、提取、分級以及水解中的 1種以上方法進行處理，制備促進具有L-氨基酸生產能力的細菌的L-氨基酸生產蓄積的該微型藻類的處理物；(b)用該包含微型藻類的處理物的培養基培養該細菌，在培養物中生產并蓄積L-氨基酸；(c)從該培養物收集L-氨基酸。優選包含所述處理物作為碳源，在這種情況下，特別優選包含淀粉的糖化物或者油脂的水解物的處理物。所述“作為碳源”是指能夠在細菌增殖以及L-氨基酸生產中作為構成菌體成分以及L-氨基酸的碳元素的供給源做出實質性貢獻。如果與未添加由微型藻類生產的有機物的培養基相比，在使用添加了水解物的培養基進行培養的情況下，細菌的生長或者L-氨基酸的生成蓄積良好，則可以做出所述水解物是碳源的評價。而且，培養基可以僅包含由微型藻類生產的有機物作為碳源，也可以還包含其它碳源。
本發明的方法可以采用分批培養(batch culture)、流加培養 (Fed-batchculture)、連續培養法(continuous culture)中的任何方法,培養基中的油脂水解物可以包含在初始培養基中，也可以包含在流加培養基中，或者包含于這兩者中。流加培養是指下述培養方法將培養基連續地或間歇地添加至培養容器中，并且在培養完成之前不從容器中取出培養基。此外，連續培養指下述培養方法連續地或間歇地將培養基流加至培養容器中，同時從容器中取出培養基(通常而言，等于所流加的培養基的量)。“初始培養基”的意思是在流加培養或連續培養中，在流加流加培養基之前的分批培養中所用的培養基(培養開始時的培養基)；“流加培養基”的意思是在進行流加培養或連續培養時，提供至發酵罐的培養基。此外，分批培養(batch culture)是指每批一次準備新的培養基，將菌株接種到其中，并且直至收獲都不加入培養基。所使用的由微型藻類生產的有機物，可以使任何濃度，只要該濃度適于L-氨基酸生產即可。培養基中含有的作為淀粉糖化物的葡萄糖濃度是優選0.05w/V% 50w/V%左右、更優選0. 1 八％ 4(^八％左右、特別優選0.2 八％ 2(^八％左右。培養基中含有的作為油脂水解物的甘油以及脂肪酸的量理想的是0. 01 10W/v%、優選0. 02 5W/v%、更優選0. 05 2W/v%左右。由微型藻類生產的有機物可以單獨使用，也可以與葡萄糖、果糖、 蔗糖、廢糖蜜、淀粉水解物等其它碳源組合使用。這種情況下，由微型藻類生產的有機物與其它碳源可以以任意比率混合，但理想的是，碳源中的由微型藻類生產的有機物的比率為 10重量％以上、更優選50重量％以上、更優選70重量％。優選的其它碳源是，葡萄糖、果糖、 蔗糖、乳糖、半乳糖、廢糖蜜、淀粉水解物、生物質水解而得到的糖液等糖類、乙醇、甘油等醇類、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸類。此外，當在存在有機酸作為緩沖液的條件下進行淀粉的酶水解時，可以將該有機酸與糖化物一起添加到培養基中作為碳源。碳源中的淀粉糖化物與有機酸的比率可以是任意的，優選為1 1 1 3。作為有機酸可以是任意的，只要所使用的細菌能夠同化即可， 可以例舉乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等，特別優選乙酸。培養開始時的由微型藻類生產的淀粉的糖化物與油脂的水解物的優選初始濃度如上述，但根據培養中由微型藻類生產的淀粉的糖化物與油脂的水解物的消耗情況，可以添加由微型藻類生產的有機物的混合物。而且，在本發明中，可以在培養的全部步驟中均包含一定濃度的藻類來源的有機物，也可以僅將其添加在流加培養基或者初始培養基中，而如果其它碳源充足的話，還可以存在一定時間的油脂水解物不足的時期。“暫時性地”可以是指例如全部發酵時間中的10% 以內或20%以內、最大30%以內的時間里油脂水解物不足。像這樣油脂的水解物的濃度有時暫時性地變為0、但存在利用包含由藻類生產的有機物的培養基進行培養的期間的情形， 包含在如上述的本發明的“培養基包含由藻類生產的有機物作為碳源”的表述中。所使用的培養基中除了包含由藻類生產的有機物以外，可以使用在利用微生物進行的L-氨基酸發酵生產中傳統上一直使用的培養基。即，可以使用除了碳源以外、還包含氮源、無機離子以及視需要的其它有機成分的常規培養基。這里，作為氮源，可以使用硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨、尿素等無機銨鹽或硝酸鹽，大豆水解物等有機氮，氨氣、氨水等。此外，還可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆水解物等。 培養基中可以僅包含所述氮源中的1種，也可以包含2種以上。所述氮源可以在初始培養
33基中使用，也可以在流加培養基中使用。此外，初始培養基、流加培養基可以使用相同的氮源，也可以在流加培養基中使用與初始培養基不同的氮源。本發明的培養基中，除了碳源、氮源之外，優選還包含磷酸源、硫源。作為磷酸源， 可以利用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、焦磷酸等磷酸多聚物等。此外，作為硫源，只要包含硫原子即可，優選硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽等硫酸鹽，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸，這其中優選硫酸銨。此外，培養基上述成分之外，還可以包含生長促進因子(具有生長促進效果的營養素)。能夠使用的生長促進因子包括微量金屬、氨基酸、維生素、核酸以及含有前述物質的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解物等。作為微量金屬，可以列舉鐵、錳、 鎂、鈣等；作為維生素，可以列舉維生素Bi、維生素B2、維生素B6、煙酸、煙酰胺、維生素B12 等。這些生長促進因子可以包含在初始培養基中，也可以包含在流加培養基中。此外，在使用其生長需求氨基酸等的營養缺陷型突變株時，優選在培養基中添補所需求的營養素。特別是，對于可在本發明中使用的L-賴氨酸生產菌而言，大多如后述地強化了 L-賴氨酸生物合成途徑，而弱化了 L-賴氨酸分解能力，因此，優選添加選自L-蘇氨酸、L-高絲氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1種或2種以上。初始培養基和流加培養基的培養基組成可以相同，也可以不同。此外，初始培養基與流加培養基的硫濃度可以相同，也可以不同。而且，當流加培養基的流加分多個階段進行時，各流加培養基的組成可以相同，也可以不同。而且，本發明中使用的培養基只要是包含碳源、氮源以及視需要而定的其它成分的培養基即可，可以是天然培養基，也可以是合成培養基。由藻類生產的有機物中除了包含碳源以外，還包含可用于氨基酸的成分。與常規的培養基相比，本發明中使用的培養基，視需要可以減少氮源以及其它成分。培養優選在需氧條件下實施1 7天，培養溫度為20°C 45°C、優選 45°C、 特別優選33 42°C。培養優選為通氣培養，優選進行調節使得氧濃度為飽和濃度的5 50%、理想的是10%左右。此外，培養中的pH優選為5 9。而且，為了調整pH，可以使用無機或者有機的酸性或者堿性物質，例如碳酸鈣、氨氣、氨水等。在如上所述的條件下，通過培養優選10小時 120小時左右，培養液中可以蓄積顯著量的L-氨基酸。蓄積的L-氨基酸的濃度只要是能夠從培養基或菌體收集、回收的濃度即可，優選為lg/L以上、更優選50g/L以上、更優選100g/L以上。此外，在生產L-賴氨酸等堿性氨基酸時，可以采用下述方法來進行生產，所述方法中采用下述方法進行發酵、并回收目的堿性氨基酸進行控制使得培養中的pH為6. 5 9. 0、而培養結束時的培養基的pH為7. 2 9. 0，并且控制發酵中發酵罐內壓力為正，或者， 向培養基中供給二氧化碳或含有二氧化碳的混合氣體，使得存在培養基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子為至少2g/U20mM)以上的培養期，并且以所述碳酸氫根離子和/或碳酸根離子作為以堿性氨基酸為主的陽離子的反荷離子(特開2002-65287、US2002-0025564A EP 1813677A)。此外，在L-谷氨酸發酵中，還可以使用已調整至能夠使L-谷氨酸析出的條件的液體培養基，使進行培養的同時L-谷氨酸在培養基中析出。作為L-谷氨酸析出的條件，可以例舉pH5. 0 4. 0、優選ρΗ4· 5 4. 0、更優選ρΗ4· 3 4. 0、特別優選ρΗ4· 0 (歐洲專利申請公開第1078989號說明書)。就從培養液回收L-氨基酸而言，可以組合常規的離子交換樹脂法、沉淀法以及其它公知方法來實施。而且，當L-氨基酸在菌體內蓄積時，例如可以利用超聲波等破碎菌體， 并通過離心分離除去菌體，采用離子交換樹脂法等從所得上清中回收L-氨基酸。回收的 L-氨基酸可以是游離體的L-氨基酸，也可以是鹽，包括硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽.、Φ^Ρ鹽ο此外，本發明中收集到的L-氨基酸除了包含目的L-氨基酸以外，還可以包含微生物菌體、培養基成分、水分以及微生物的代謝副產物。所收集的L-氨基酸的純度為 50% 以上、優選 85% 以上、特別優選 95% 以上(US5, 431,933, JP1214636B, US4, 956, 471, US4, 777，051，US4946654, US5, 840358，US6,238，714，US2005/0025878)。實施例1以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明。本實施例中使用了從德克薩斯大學藻類培養物保藏中心(The University of Texas at Austin, TheCulture Collection of Algae (UTEX), IUniversity Station A6700, Austin, TX78712-0183, USA)獲得的 Chlorella kessleri Ilh 株(UTEX 263)、Neochlorisoleoabundans UTEX 1185 株、 Nannochloris sp. UTEX LB 1999 株以及假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)UTEX LB FD2 株。〔實施例1 (1)〕微型藻類Chlorella kessleri的培養將Chlorella kessleri 在裝有 IOOmL 的 0. 2 X Gamborg's B5 培養基(日本制藥) 的500mL容量三角燒瓶中，以30°C、光強度10，OOOlux(Τ0ΜΥ公司制造的培養裝置CL-301) 的條件振蕩培養6天，以此為前培養液。而且，光源使用的是來自熒光燈的白色光。在裝有 0. 2XGamborg' s B5培養基800mL的IL容量培養基瓶中添加前培養液16mL，在培養溫度 30°C、光強度10，OOOlux，并以500mL/min通入空氣與(X)2的混合氣體使(X)2濃度達到3%的條件下，培養12天。(0.2XGamborg's B5培養基
KNO3500mg/L
MgSO4 · 7H2050mg/L
NaH2PO4 · H2O30mg/L
CaCl2 · 2H2030mg/L
(NH4)2SO426. 8mg/L
Na2-EDTA7. 46mg/L
FeSO4 · 7H205. 56mg/L
MnSO4 · H2O2mg/L
H3BO30. 6mg/L
ZnSO4 · 7H200. 4mg/L
KI0. 15mg/L
Na2MoO2 · 2H200. 05mg/L
CuSO4 · 5H200. 005mg/L
CoCl2 · 6H200.005mg/L
120 0C 15分鐘高壓蒸汽滅菌
〔實施例1⑵〕從Chlorellakessleri制備淀粉糖化液通過離心分離沉淀出IL實施例1 (1)的培養液中的藻體，向該沉淀物中加入SOmL 的乙醇并懸浮藻體，然后煮沸30分鐘。對該懸浮液進行離心分離使藻體沉淀，然后用 80mL的乙醇洗滌2次，再于干燥器內進行干燥。向該干燥藻體中加入40mL的0. 2M Κ0Η, 煮沸30分鐘，再使用超聲波裝置(Kubota公司INS0NAT0R 201MA)進行15，OOOffUO分鐘的處理，從而將細胞破碎。向該破碎液中加入8mL的IM乙酸溶液、250U的淀粉葡糖苷酶 (Sigma-Aldrich公司，于55°C反應18小時反應。反應結束后，使用生物技術分析儀AS210(&ikUra kiki)對反應產物中的葡萄糖進行了定量。即使將酶濃度改變為原來的 2倍，生成的葡萄糖量也基本沒有變化，由此可以推定淀粉中的大部分被轉化為葡萄糖。通過離心分離除去藻體破碎物(殘渣)，將上清作為氨基酸發酵的碳源使用。〔實施例1(3)〕以Chlorella kessleri來源的淀粉糖化液作為碳源的L-賴氨酸生產培養作為L-賴氨酸生產菌，使用了國際公開第2006/078039號小冊子中記載的大腸桿菌 WC196 Δ cadAA ldcC/pCABD2o 將 WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2 在含有 20mg/L 鏈霉素硫酸鹽的LB瓊脂培養基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L)中 37°C培養20小時。刮取瓊脂培養基上的細胞，接種到裝有40mL含20mg/L鏈霉素硫酸鹽的 L-賴氨酸生產培養基的500mL容量三角燒瓶中，培養溫度37°C，進行了 M小時培養。在主培養中，使用從Chlorella kessleri生產的淀粉制備的實施例1 ( 的糖化液(葡萄糖量為2.75g/L)以及制備該糖化液時作為緩沖液利用的乙酸4. 8g/L作為碳源。作為對照，使用含相同濃度的葡萄糖或乙酸兩者之一的培養基、以及含葡萄糖和乙酸這兩者作為碳源的培養基實施了培養。(L-賴氨酸生產培養基組成)(A 區)碳源葡萄糖2. 75g/L乙酸 4. 8g/L(B 區)(NH4) 2S04 24g/LKH2PO4 lg/L酵母提取物2g/LFeSO4 · 7H20 10mg/LMnSO4 · 4H20 lOmg/L(C 區)碳酸鈣15g/LA區、B區115°C高壓蒸汽滅菌10分鐘，C區180°C干熱滅菌3小時。冷卻至室溫后，將三者混合，加入終濃度lg/L的MgSO4 · 7H20溶液。培養結束后，使用生物技術分析儀AS210 (Mkura kiki)確認了葡萄糖的消耗，通過活菌數計數測定了生長程度，使用BF_5(王子計測機器)測定了 L-賴氨酸量。每組使用兩個燒瓶進行培養，結果的平均值示于表1。當分別以試劑葡萄糖和乙酸作為單獨的碳源時，分別蓄積了 1. lg/L和0. 3g/L的 L-賴氨酸。當混合試劑葡萄糖和乙酸作為碳源時，蓄積了 1.4g/L的L-賴氨酸，這相當于各碳源單獨使用時的L-賴氨酸蓄積量的合計。在使用與之相同濃度的、由藻類生產的淀粉來源的葡萄糖以及乙酸時，觀察到了高于同等程度的1.8g/L的L-賴氨酸蓄積，表明它們是有效的碳源。[表 1]表 1
權利要求
1.一種生產L-氨基酸的方法，其特征在于，在包含微型藻類的處理物的培養基中培養具有L-氨基酸生產能力的細菌，從而在培養物中生產并蓄積L-氨基酸，并從該培養物收集 L-氨基酸，其中，該處理物促進所述細菌生產并蓄積L-氨基酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述處理物是(1)所述微型藻類的培養物的破碎物；( 所述破碎物的提取物或分級物，其中包含來源于所述微型藻類的有機物的混合物； 或(3)該破碎物、該提取物或該分級物的水解物。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述處理物是對產生淀粉的微型藻類的藻體破碎物、或所述藻體破碎物的含淀粉的提取物、或所述提取物的含淀粉的分級物進行水解而得到的糖化物。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述糖化物是從微型藻類的藻體破碎物或所述藻體破碎物的含淀粉的分級物通過使用淀粉酶進行酶反應而得到的反應產物。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述淀粉酶是葡糖淀粉酶。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述處理物是對產生油脂的微型藻類的藻體破碎物、或者所述藻體破碎物的含油脂的提取物、或者所述提取物的含油脂的分級物進行水解而得到的水解物。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述水解物是從微型藻類的藻體破碎物或所述藻體破碎物的含油脂的分級物通過使用脂肪酶進行酶反應而得到的反應產物。
8.根據權利要求6 7中任一項所述的方法，其特征在于，所述水解物經過了乳化處理。
9.權利要求1 8中任一項所述的方法，其特征在于，所述微型藻類的破碎方法為高溫處理。
10.根據權利要求1 9中任一項所述的方法，其特征在于，所述微型藻類的破碎方法是在100°C以上的溫度下進行處理。
11.權利要求1 10中任一項所述的方法，其中，所述微型藻類是屬于綠藻門 (Chlorophyta)或不等長鞭毛門(Heterokontophyta)的藻類。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述微型藻類是屬于綠藻綱 (Chlorophyceae) Λ Trebouxiophyceae ^ ^! (Baci 1 Iariophyceae)的
13.根據權利要求1 12中任一項所述的方法，其中，所述微型藻類是屬于綠藻綱的藻類。
14.根據權利要求1 13中任一項所述的方法，其中，所述細菌是屬于腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)的細菌或棒狀桿菌型細菌。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述屬于腸桿菌科的細菌是大腸桿菌 (Escherichia coli)0
16.根據權利要求1 15中任一項所述的方法，其中，所述L-氨基酸為選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸中的1種或2種以上的L-氨基酸。
17.根據權利要求15所述的方法，其中，所述L-氨基酸為L-賴氨酸，且所述細菌中選自二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉移酶、二氨基庚二酸差向異構酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脫酰基酶中的1種或2種以上的酶的活性被增強，和/或賴氨酸脫羧酶的活性被弱化。
18.根據權利要求15所述的方法，其中，所述L-氨基酸為L-蘇氨酸，且所述細菌中選自天冬氨酸半醛脫氫酶、thr操縱子編碼的天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉移酶、以及蘇氨酸合酶中的1種或2種以上的酶的活性被增強。
19.根據權利要求15所述的方法，其中，所述L-氨基酸為L-谷氨酸，且所述細菌中的選自谷氨酸脫氫酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、以及甲基檸檬酸合酶中的1種或 2種以上的酶的活性被增強，和/或α -酮戊二酸脫氫酶的活性被弱化。
20.根據權利要求1 19中任一項所述的方法，其中，所述培養基包含所述處理物作為碳源。
21.—種生產L-氨基酸的方法，其特征在于，(a)在培養基中培養微型藻類，并通過選自破碎、提取、分級和水解中的1種以上的方法對該培養物進行處理，來制備促進具有L-氨基酸生產能力的細菌生產并蓄積L-氨基酸的該微型藻類的處理物；(b)在包含所述微型藻類的處理物的培養基中培養所述細菌，從而在培養物中生產并蓄積L-氨基酸；以及(c)從該培養物收集L-氨基酸。
22.根據權利要求21所述的方法，其中，所述處理物是(1)所述微型藻類的培養物的破碎物；( 所述破碎物的提取物或分級物，其中包含來源于該微型藻類的有機物的混合物； 或者C3)該破碎物、該提取物或該分級物的水解物。
23.根據權利要求21所述的方法，其中，所述破碎是通過選自高溫處理、有機溶劑處理、煮沸處理和強堿處理中的1種以上的方法進行的。
24.根據權利要求21 23中任一項所述的方法，其中，所述處理物制備步驟包括通過對產生淀粉的微型藻類進行破碎和/或提取和/或分級，并對所得處理物進行水解以將其糖化的步驟。
25.根據權利要求M所述的方法，其特征在于，在所述糖化步驟中使用淀粉酶進行酶反應。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述淀粉酶為葡糖淀粉酶。
27.根據權利要求21 23中任一項所述的方法，其中，所述處理物制備步驟包括對產生油脂的微型藻類進行破碎和/或提取和/或分級，并對所得的油處理物進行水解的步驟。
28.根據權利要求27所述的方法，其中，在所述水解步驟中使用脂肪酶進行酶反應。
29.根據權利要求27或觀中任一項所述的方法，其中，所述水解物經過了乳化處理。
30.根據權利要求21 四中任一項所述的方法，其中，所述微型藻類是屬于綠藻門或不等長鞭毛門的藻類。
31.根據權利要求30所述的方法，其中，所述微型藻類是屬于綠藻綱、 Trebouxiophyceae或娃藻綱的藻類。
32.根據權利要求31所述的方法，其中，所述微型藻類是屬于綠藻綱的藻類。
33.根據權利要求21 32中任一項所述的方法，其中，所述細菌是屬于腸桿菌科的細菌或棒狀桿菌型細菌。
34.根據權利要求33所述的方法，其中，所述屬于腸桿菌科的細菌是大腸桿菌。
全文摘要
通過在包含微型藻類的可促進該細菌生產并蓄積L-氨基酸的處理物(例如微型藻類的培養物的破碎物、含有該微型藻類產生的有機物的混合物的該破碎物的抽提物或分級物、或者該破碎物、該抽提物或該分級物的水解物等)的培養基中，特別是在包含淀粉的糖化物或者油脂的水解物的培養基中，培養具有L-氨基酸生產能力的細菌，在培養物中生產并蓄積L-氨基酸，并從該培養物收集L-氨基酸，來生產L-氨基酸。
文檔編號C12P13/14GK102348806SQ20098010289
公開日2012年2月8日 申請日期2009年1月23日 優先權日2008年1月23日
發明者羽城周平, 臼田佳弘, 鈴木茂雄 申請人:味之素株式會社