修飾的胱抑蛋白a支架蛋白的制作方法

專利名稱：修飾的胱抑蛋白a支架蛋白的制作方法
修飾的胱抑蛋白A支架蛋白本發明涉及用于展示肽，如肽適體的新型支架蛋白。具體說，本發明涉及修飾的胱 抑蛋白A多肽和修飾的基于胱抑蛋白A(Stefin Α)的人工蛋白用作支架蛋白和展示系統的應用。
背景技術：
研究蛋白質相互作用對于理解許多生物學過程，如基因產物在健康和患病個體體 內的作用而言至關重要。具體說，肽適體已經成為分子醫學的基本理論和應用研究中使用 的重要的分子工具。由于它們能夠在胞內水平特異性結合給定的靶蛋白并使其失活，它們 提供了一種在體外和體內進行功能性蛋白質分析的實驗方案。它們也可用于胞外蛋白質。 關于在研究蛋白質功能的應用，這些工具可用于分子檢測、診斷和/或用作治療劑。肽和肽 適體可以溶液游離形式使用。然而，不受限制的小肽容易形成呈現受限的相互作用表面的 結構。而且，它們與靶分子結合后，常常發生構象熵降低，結合自由能降低，最終游離肽常常 不形成緊密的非共價復合物，這是個難題。此外，在細胞內肽快速降解，這限制了它們在研 究蛋白質體內相互作用中的有效性，這也是個難題。除了以游離溶液使用之外，感興趣的肽還可結合于物理支持物，或展示于較大的 多肽中。前者不容易應用于體內研究。而在后一種情況中，通過遺傳方法將肽插入簡單穩 定的支架蛋白的一級序列中。支架的折疊在構象上限制了肽，因此肽適體以高特異性和高 親和力結合其結合伙伴。在多肽中展示在本發明中非常重要。這種展示常常是用支架蛋白 進行的。現有技術支架包含滅活的葡萄球菌核酸酶、綠色熒光蛋白(GFP)和硫氧還蛋白 A(TrxA)，以及分離的蛋白質折疊，如葡萄球菌蛋白A的Z結構域、“親和蛋白(affibody) ”、 抗脂質運載蛋白(anticalin)和錨蛋白重復。現有技術中的支架蛋白還包括III型纖連蛋 白結構域(‘Fn3')、產生抗脂質運載蛋白的脂質運載蛋白家族蛋白質、后膽色素結合蛋 白(BBP)等。近期，WO 2006/131749記載了在胱抑蛋白A中產生若干合理突變，以改進其作為 支架的性能。修飾的胱抑蛋白A支架在以下三個位點包含突變LyS71-Leu73、V48D和G4W， 其稱為STM (胱抑蛋白A三突變體)。已證明，這三個突變的組合產生的蛋白質與人細胞蛋 白質的相互作用最少，具體說，已經無法檢測到這種蛋白質與其已知天然結合伙伴的相互 作用。然而，我們發現將肽插入該蛋白的71-73位會產生在插入肽末端對該蛋白的截短強 烈的選擇壓力。雖然這種截短的蛋白質可展示生物學功效，但觀察結果導致以下擔憂簡 單地插入71-73位而不引起截短的一小組肽可能不能與靶蛋白自由地相互作用，這是個難 題。而且，在單一位置上插入肽不可避免地限制了用于蛋白質相互作用的總表面積，進而限 制結合親和力，也可能限制特異性。如本發明所述，對胱抑蛋白A和修飾的基于胱抑蛋白A的人工蛋白如STM(胱抑蛋 白A三突變體)進行的新型突變提供了可替代的改進且更穩定的支架蛋白，也提供比現有 技術更佳多樣化的展示系統。而且，也不大可能預計到這些新型蛋白質支架/展示系統作為高效的展示實體。已經在胱抑蛋白A/STM蛋白中特定的不同區域上產生下文所述的新突 變，令人驚訝地發現它們不影響胱抑蛋白A/STM蛋白的構型或它們作為支架蛋白的潛在功 能。而且，通過進一步工程改造，可以用本發明的改進支架提供修飾，其中該支架具有多個 至今現有技術中不可能實現的插入。

發明內容
本發明第一方面提供修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其中該修飾包含 在選自下組的位點插入的單個突變或異源寡核苷酸編碼的肽(i)密碼子4上的突變，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或 異源寡核苷酸編碼的肽替代，所述另一氨基酸對于胱抑蛋白A不是色氨酸或對于STM不是 甘氨酸；或者(ii)在編碼包含或限定環1的氨基酸的密碼子46-M中的任何改變或異源寡核苷 酸編碼的肽插入；或者(iii)在編碼包含或限定環2的氨基酸的密碼子67-84中的任何改變或異源寡核 苷酸編碼的肽插入。在本申請的說明書和權利要求書中，術語“包含”、“含有”和這些術語的變化形式， 例如“包含著”和“包含了”的含義是“包括但不限于”，它們不旨在(且不會)排除其它部 分、添加劑、組分、整數或步驟。在本申請的說明書和權利要求書中，除非另有說明，單數形式也包括復數含義。具 體說，使用不定冠詞時，應理解為考慮到復數和單數含義，除非另有說明。應理解，除出現不相容的情況以外，在本發明的特定方面、實施方式或實施例中描 述的特征、整數、特性、化合物、化學部分或基團也可應用于本文所述的任何其它方面、實施 方式或實施例。本文提到支架蛋白時，指融合成一個蛋白質的序列，該術語也與融合蛋白同義。 “融合蛋白”指包含與一種或多種不同(即“異源”)肽或蛋白質結合的本發明支架蛋白的 蛋白質。插入異源肽或蛋白質使該融合蛋白能夠結合所需的靶點。本發明基于新的修飾，包括插入野生型胱抑蛋白A蛋白質本身(胱抑蛋白A優選 是人胱抑蛋白A)或者插入其三突變體STM，使它們成為適合用作穩定的支架蛋白的形式； 而伴隨的有利情況是，通過突變與組織蛋白酶或其它未知蛋白發生天然相互作用所需的殘 基消除生物學顯著的相互作用和活性，從而使它們呈生物中性。而且，應考慮到所選的突變 或插入位點能夠接受和限制插入的肽產生(例如)肽適體。盡管人體研究可能需要人支架， 但使用(例如)小鼠胱抑蛋白A在小鼠生物和/或疾病模型中進行研究可能有利，類似地， 衍生自其它物種或植物的胱抑蛋白A也可用于該特定物種中。因此，本發明的支架和展示 系統可用于任何所選的物種，胱抑蛋白A的產生依賴于使用者的要求。應理解，編碼胱抑蛋白A或其STM形式的密碼子4的氨基酸的DNA序列中的改變， 或者編碼包含或限定胱抑蛋白A或其STM形式的環1的氨基酸的密碼子46-54中的改變， 或者編碼包含或限定胱抑蛋白A或其STM形式的環2的氨基酸的密碼子67-84中的改變可 以相互獨立。也就是說，對胱抑蛋白A蛋白質的修飾可以在三個不同的獨立區域之一中進 行，即在4位中或者在限定環1或環2中。相似地，對三突變體形式STM的修飾也可在三個5特定的獨立位點之一中進行，即在4位中或者在限定環1或環2中。胱抑蛋白A或STM的 其余序列不變，它們包括下述序列。野生型人胱抑蛋白A的序列見下(SEQ ID N0:1)MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAGTNYYIKVRA⑶NKYMHLKV FKSLPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF三突變體STM的序列見下(SEQ ID NO :2)，用粗體和下劃線標出STM與野生型胱 抑蛋白A不同的突變位點MIP W GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQV D AGTNYYIKVRA⑶NKYMHLKVF NGP PGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF本文所用術語“突變”指遺傳物質中的永久性改變，突變可能是氨基酸殘基的加 入、缺失、插入或取代。優選地，在單個突變是胱抑蛋白A密碼子4的甘氨酸的實施方式中，其取代選自下 組G4V、G4I、G4L、G4M、G4F、G4P、G4N、G4V、G4Q、G4S、G4T、G4W、G4Y、G4R、G4H、G4K、G4D 禾P G4E。更優選地，該改變是G4R，也就是說，密碼子4中的甘氨酸被精氨酸取代。優選地，在單個突變是STM密碼子4的色氨酸的實施方式中，其取代選自下組 W4V、W4I、W4L、W4M、W4F、W4P、W4N、W4V、W4Q、W4S、W4T、W4G、W4Y、W4R、W4H、W4K、W4D 禾口 W4E。 更優選地，該改變是W4R，也就是說4位的色氨酸被精氨酸取代。已發現，編碼胱抑蛋白A或STM氨基端8個氨基酸的胱抑蛋白A開放閱讀框5’區 域中的改變能夠引入限制性內切酶切割位點或靶向重組位點。例如，在本文中已證明，改變 DNA序列以便在4位編碼(例如)精氨酸(取代野生型的甘氨酸，或STM中的色氨酸)后， 令人驚訝地產生穩定的蛋白質，該蛋白與STM的生物物理學特性相同，但此時開放閱讀框 具有獨特的限制性酶切位點，例如但不限于AvrII酶切位點，因此該蛋白用作可替代的高 效支架蛋白。優選地，在突變是編碼包含或限定胱抑蛋白A (SEQ ID NO :3QVVAGTNYY)或STM (SEQ ID NO 4 :QVDAGTNYY)環1的氨基酸的密碼子46巧4中的任何改變的實施方式中，該改變包 括例如QVLASTNYY(SEQ ID NO :5)。令人驚訝地證明，引入氨基酸序列，例如但不限于在48、 49和50位引入亮氨酸、丙氨酸、絲氨酸產生生物物理學特性與STM相同的蛋白質，因此它可 能是高效的支架。優選地，胱抑蛋白A中的突變在48-VAG-50中，STM中的突變在48-LAS-50中，以 便得到48-LXS-50，其中X是任何氨基酸。優選地，在突變是編碼包含或限定胱抑蛋白A (SEQ ID NO :6LKVFKSLPGQNEDLVLTG) 或STM(SEQ ID NO 7 :LKVFNGPPGQNED LVLTG)環2的氨基酸的密碼子67-84中的任何改變 的實施方式中，該改變包括例如SEQ ID NO :8，即LKVFNGPPGQNEDLVRSG。令人驚訝地證明， 氨基酸序列如精氨酸后接絲氨酸(以取代胱抑蛋白A或STM的亮氨酸82和蘇氨酸83)導 致產生類似于STM的穩定蛋白質，其適合用作展示肽適體的支架。優選地，胱抑蛋白A中的突變在71-KSL-73和82-LT-83中，STM中的突變在 71-NPG-73和82-LT-83中，以便得到71_NxP_73和82-RS-83，其中X是任何氨基酸。優選地，在本發明的另一實施方式中，在胱抑蛋白A和STM中還有一個位于 82-LT-83的突變，突變后得到82-XX-83，其中X是任何氨基酸。在特別優選的實施方式中，突變后得到82-RS-83。突變可以在82或83位上，或同時出現在這兩個位置上。優選地，該突變可以是本文所述突變與(例如但不限于)82-XX-83的任何組合，特 別優選的變體是至少在71-73位和/或82-83位上有突變。在另一方面，本發明涉及一種修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其包含在 選自下組的位點上的兩個突變或異源寡核苷酸編碼的肽插入(i)密碼子4上的突變，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或 異源寡核苷酸編碼的肽替代，所述另一氨基酸對于胱抑蛋白A不是色氨酸或對于STM不是 甘氨酸；和/或(ii)在編碼包含或限定環1的氨基酸的密碼子4644中的任何改變或異源寡核苷 酸編碼的肽插入；和/或(iii)在編碼包含或限定環2的氨基酸的密碼子67-84中的任何改變或異源寡核 苷酸編碼的肽插入。應理解，在本發明的這個方面，當修飾的胱抑蛋白A可包含兩個突變時，它可包括 例如，4位的突變和具有環1功能的密碼子46-54中的改變，或者它可包括4位的突變和具 有環2功能的密碼子67-84中的改變，或者它可包括具有環1功能的密碼子46-54中的改 變和具有環2功能的密碼子67-84中的改變。相似地，STM可包括4位的突變和具有環1功能的密碼子46-54中的改變，或者可 包括4位的突變和具有環2功能的密碼子67-84中的改變，或者可包括具有環1功能的密 碼子46-54中的改變和具有環2功能的密碼子67-84中的改變，或者可包括具有環2功能 的密碼子67-84中的改變。另一方面，本發明涉及一種修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其中所述修 飾是在三個位點上插入的突變或異源寡核苷酸編碼的肽(i)密碼子4上的突變，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或 異源寡核苷酸編碼的肽替代，所述另一氨基酸對于胱抑蛋白A不是色氨酸或對于STM不是 甘氨酸；和(ii)在編碼包含或限定環1的氨基酸的密碼子4644中的任何改變或異源寡核苷 酸編碼的肽插入；和(iii)在編碼包含或限定環2的氨基酸的密碼子67-84中的任何改變或異源寡核 苷酸編碼的肽插入。
因此，在本發明的這個具體實施方式
中，修飾的胱抑蛋白A和STM包括上述所有三 個突變。因此，修飾的胱抑蛋白A或STM支架蛋白在4位以及環1和環2中包括三個特定突變。另一方面，本發明涉及一種修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其包含上述 序列中的任何單個序列或其組合，但終止于胱抑蛋白A或STM的殘基73或者胱抑蛋白A或 STM的殘基84，其中在三個位置上插入或未插入新的氨基酸序列。我們已經發現，在STM的 NGP后插入氨基酸序列后，對終止密碼子存在強大的選擇壓力，但令人驚訝的是，這種截短 的蛋白質既穩定又能干擾靶蛋白的生物學功能。因此，本發明也包括截短或縮短的修飾的胱抑蛋白A和STM支架蛋白，理想情況 下，其在C末端縮短15或25個殘基，因而終止于胱抑蛋白A或STM的殘基73或84。本發7明也包括截短或縮短的修飾的胱抑蛋白A或STM，它們縮短15至25之間的任何整數個殘 基，因而終止于胱抑蛋白A或STM的殘基73至84。本發明優選包括所述的所有變體，因為通過將寡核苷酸插入經工程改造建立的開 放閱讀框中的限制性位點，每種變體都能在胱抑蛋白A或STM變體的一個或多個位點上引 入異源肽。因此，本發明提供基于以下內容的多種新支架在4位上插入該蛋白的獨特的異源肽，該蛋白的其余部分類似胱抑蛋白A或STM， 或者本文所述的其它變體之一。在46巧4位上，特別是48/49/50位上插入該蛋白的獨特的異源肽，該蛋白的其余 部分類似胱抑蛋白A或STM，或者本文所述的其它變體之一。在67-84位上，特別是71/72/73位上插入該蛋白的獨特的異源肽，該蛋白的其余 部分類似胱抑蛋白A或STM，或者本文所述的其它變體之一。在67-84位上，特別是82/83位上插入該蛋白的獨特的異源肽，該蛋白的其余部分 類似胱抑蛋白A或STM，或者本文所述的其它變體之一。插入4位和/或48/49/50位和/或71/72/73位和/或82/83位的多個肽的任何 組合。插入4位和/或48/49/50位和/或71/72/73位和/或82/83位的單個或多個肽 的任何組合，后接去除或取代胱抑蛋白A或STM的最后25個或最后15個氨基酸殘基的終 止密碼子。本發明支架蛋白和所述新突變的具體優點是它們能夠使用全部環1或環2，或者 環1和環2，以及氨基末端。并且，這些突變使得能夠遞呈至少和抗體所用相近大小的表面。 此外，它們各自可單獨使用，或者可成對使用，或者可與其它突變組合使用。相互作用表面 的不同位置，以及在不同位點插入的肽之間不同的相互作用可能提供該支架的新應用，例 如不能在一個位點上被遞呈從而產生有用相互作用的肽現在可用另一個肽遞呈，或者不同 位點上的肽組合使給定肽從非相互作用構象轉變為相互作用構象。此外，任何這些新突變 均可用于全長胱抑蛋白A、全長STM、本文所述的全長蛋白質、或任何這些蛋白質的突變形 式，其中衍生自胱抑蛋白A或STM的最后一個殘基是MeA或其新變體的Leu73，或者是STM 或其新變體的1^073，或者是胱抑蛋白A或STM的最后15或25個氨基酸被截短插入的異源 肽的最后一個殘基。另一方面，本發明涉及分離核酸，其包含編碼上文所述的支架蛋白或多肽的氨基 酸序列的核苷酸序列。另一方面，本發明涉及一種鑒定能夠結合感興趣結構的靶肽的方法，該方法包括 提供上文所述的包含靶肽的修飾的胱抑蛋白A或STM蛋白作為支架蛋白；使所述支架蛋白 與所述感興趣結構相接觸；和監測所述支架和感興趣結構之間的結合，其中支架蛋白與感 興趣結構的結合能將所述靶肽鑒定為能夠結合所述結構的候選靶肽。在本發明的另一方面，所述支架蛋白選自下組SEQ ID NO 9 (SDM) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRSGYQVDKN KDDELTGF*SEQ ID NO :10 (SQM) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRSGYQVDKN KDDELTGF*
SEQ ID NO: 11 (SUC) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRSGYQVDKN KDDELTGF*SEQ ID NO :12 (SUM) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLTGYQVDKN KDDELTGF*SEQ ID NO :13 (SUN) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLTGYQVDKN KDDELTGF*SEQ ID NO :14(SDM~) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRS*SEQ ID N0:15(SDM—) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGP*SEQ ID NO 16 (SQM~) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRS*SEQ ID NO :17(SQM—) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGP*SEQ ID NO 18 (SUC~) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRS*SEQ ID NO :19(SUC—) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGP*SEQ ID NO 20 (SUM-) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLT*SEQ ID NO :21 (SUM—) :MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSL*SEQ ID NO :22 (SUN-) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLT*SEQ ID NO :23 (SUN—) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF KSL*SEQ ID NO :24 (SQT) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNADR VLTGYQVDKN KDDELTGF*SEQ ID NO :25 (SQL) :MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEA VQYKTQVLALAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNADR VLTGYQVDKN KDDELTGF*在本發明的另一方面，提供了本發明支架蛋白用作選自下組的試劑的應用診斷 劑、治療劑、生物標記物、結合和特異性檢測生物標記物的試劑、合理化藥物設計模板、藥物 發現靶點或試劑、抗體替代品和研究工具。在本發明的另一方面，提供了本發明支架蛋白用作融合蛋白的應用。上文所述的優選特征加以必要的修改也可應用于本發明的所有和各個方面。總之，上文和下文中記載的結果證明，本發明支架可以在多個位置上進行工程改 造，令人驚訝的是，單獨或組合的各個改變能良好耐受，但氨基端和環2中的插入會顯著增 加突變的失穩作用。因此，這些位點不能常規使用，令人驚訝的是，一些插入物可以耐受，這 使得我們可以使用它們提高(例如)SQM-環1中肽適體的結合親和力和特異性。此外，環1似乎能夠遞呈一系列肽，很少出問題。這非常令人驚訝，因為這是最短的環。發明詳述“缺失”指氨基酸或核苷酸序列由于失去一個或多個氨基酸殘基或核苷酸而發生 的改變。術語“插入”或“添加”指與參比序列，例如天然產生分子的序列相比，導致分子或 其代表中加入一個或多個氨基酸殘基或核苷酸的氨基酸或核苷酸序列的改變。“取代”指用 不同的氨基酸或核苷酸替代一個或多個氨基酸或核苷酸。為了改良作為支架的胱抑蛋白A或STM，需要能夠在替代位點和/或多個位點插入 異源肽。為此，需要改變編碼胱抑蛋白A或STM的開放閱讀框，以便引入可插入編碼異源肽 的寡核苷酸的限制性核酸內切酶識別位點。改變開放閱讀框幾乎不可避免地導致包含所表 達蛋白質的氨基酸序列改變。假定蛋白質已經被設計成功能和穩定性的最優組合，蛋白質 的氨基酸序列改變最可能引起(且最常觀察到)的后果是失去二級結構，因而穩定性降低。 在本發明中，該新型支架蛋白保持了穩定性(參見實施例和附圖)。為了確定也能改變新的胱抑蛋白A/STM的氨基酸序列的DNA(開放閱讀框)水平 的改變是否導致該蛋白穩定性降低，在大腸桿菌(E.coli)中表達本文所述的所有變體，用 圓二色性法將其二級結構組成與胱抑蛋白A作比較。發現所有蛋白質均在大腸桿菌中良好 地表達，通常表達至約^mg變體蛋白/毫升細菌培養物(

圖1)。用Ni-瓊脂糖和親和層析 技術將蛋白質純化至接近均一，將純化制劑稀釋至0. 3毫克蛋白質/毫升。通過圓二色性 法分析所得的各個樣品。這種方法包括在一系列近UV波長上掃描蛋白質，以使蛋白質的二 級結構元件(α-螺旋或β-折疊)影響光的橢圓率。二級結構的比例越大，對橢圓率的影 響越大。因為該影響受蛋白質濃度的影響，所以在臨分析前將蛋白質稀釋至0.;3mg/ml。由 于該影響與所分析蛋白質中的肽鍵數量成正比，所以顯示的是考慮了這一因素的摩爾橢圓 率。數據如圖3所示。該數據說明，STM和新變體之間二級結構的比例相當，STM中存在插 入物不會對其結構產生不良影響。注意到相對于其他變體而言兩種變體(SUN和SQM)的結 構增加。這可歸因于存在于所有這些蛋白質中的氨基末端尾中獲得二級結構，可由精氨酸 取代4位的甘氨酸(胱抑蛋白A)或色氨酸(STM)驅動，因為這是SUN和SQM之間共有的唯 一的改變，它們是具有這一改變的僅有的變體。支架正如本領域所熟知的那樣，術語“支架”指可將靶肽遞呈給溶劑、其自身結構不會 因靶肽而變形的蛋白質。可利用免疫沉淀實驗檢測肽到溶劑的遞呈。例如，可將能識別肽的 抗體的可獲得性作為肽遞呈給溶劑的指標。因此，為了檢測支架蛋白將肽遞呈給溶劑的能 力，表達包含該肽的支架，并用識別該肽的抗體嘗試免疫沉淀該支架-肽融合物。如果可用 該抗體免疫沉淀或捕獲該蛋白，就表明該肽被遞呈給溶劑，正如支架蛋白需要做到的那樣。 另外或或者，可通過磷酸化研究獲得肽被遞呈給溶劑的指示。通過將磷酸受體位點摻入靶 肽，然后在允許磷酸化的條件下使支架-肽融合物與關聯激酶相接觸，可驗證肽到溶劑的 遞呈。肽的磷酸化表明正確遞呈給溶劑。支架蛋白對因攜帶靶肽而引起變形的抗性可通過 諸如圓二色性或熱穩定性等技術來檢測。具體說，對未插入靶肽的支架蛋白的圓二色性與 攜帶靶肽的同一支架蛋白的圓二色性基本相同。這證明，支架蛋白中存在靶肽不會使攜帶 它的支架蛋白的結構受損或變形。檢測對靶肽引起變形的抗性的另一種方式是研究插入和 未插入靶肽的支架蛋白的熱穩定性。
支架蛋白必須能夠接受肽插入物。優選地，該肽插入物具有36個或更少氨基酸， 優選20個或更少氨基酸。靶肽插入物優選具有12個或更少氨基酸。支架蛋白必須為已知結構。“已知結構”指晶體結構或溶液結構(NMR結構)必須 已知。本發明支架蛋白的優詵特征優選地，支架蛋白限定靶肽。通過比較靶肽在支架蛋白中時對結合靶肽的實體的 親和力與該肽不在支架蛋白中時的親和力來證明支架蛋白中存在約束作用。這兩種親和力 有差異表明支架蛋白限定該肽，呈現特定的三維構象。支架蛋白優選能限定肽，以至于其 存在于支架蛋白中時結合親和力升高。換言之，支架蛋白優選降低結合的熵耗(entropic cost)，從而與結合游離肽相比提高測定的親和力。在一些實施方式中，可通過N-末端或C-末端單獨融合于靶肽提供該約束。支架蛋白優選提供體內穩定性提高的靶肽。可通過比較支架蛋白中的靶肽的表達 與靶肽自身的表達來證明這種作用。優選地，在支架蛋白中，靶肽穩定性提高。支架蛋白優選為生物學中性。“生物學中性”指已消除與其它已知蛋白的相互作 用。而且，優選消除該蛋白所具有的任何信號轉導能力。因此，本發明的支架蛋白優選為 STM支架蛋白。生物學中性是本發明的一個優點，因為現有技術中的大部分支架蛋白不具備這項 性質。例如，硫氧還蛋白A用作細胞中天然氧化還原通路的顯性負(調節物)。而且，已知 它能抑制P53和BCL6信號轉導通路。有利的是，本發明的支架蛋白不干擾天然產生的信號 轉導通路。支架蛋白應該較小。“小”指小于25kDa，優選小于13kDa。最優選地，支架蛋白應 小于IlOaa (除靶肽插入物外)。優選地，本發明支架蛋白的構象穩定。“構象穩定”指不應發生構象改變。支架蛋 白優選不含絞鏈區。支架蛋白優選不含PH結構域。支架蛋白優選不含SH3結構域。支架蛋 白優選不含SH2結構域。支架蛋白優選不含'Wff'結構域。支架蛋白優選不含'WD'結 構域。支架蛋白優選不含HEAT重復。支架蛋白優選不含富脯氨酸的結構域。在細胞中，支 架蛋白優選不具有翻譯后修飾。支架蛋白優選不具有已知能促進構象改變的其它結構域。本發明支架蛋白優選不具有蛋白質-蛋白質相互作用結構域。如果蛋白質-蛋白 質相互作用結構域被突變致使其無功能，則認為該蛋白質不具有這些蛋白質-蛋白質相互 作用結構域。優選地，本發明支架蛋白沒有翻譯后修飾。因此，本發明支架蛋白優選不具有糖基 化位點。這是相對于現有技術的支架蛋白如抗肌萎縮蛋白的一個優點，因為翻譯后修飾本 身可干擾相互作用或產生假的相互作用。如上所述，肽插入物應不使支架蛋白變形。在這個標準上，綠色熒光蛋白不會被認 為是支架蛋白，因為至少三分之一的插入靶肽消除了綠色熒光蛋白的熒光。這證明，靶肽插 入物使蛋白質結構變形。因此，這不是本發明支架蛋白，因為本發明支架蛋白應該不會因靶 肽插入而變形。硫氧還蛋白A(TrxA)是現有技術中的一種支架蛋白。TrxA小而穩定。然而，在兩 個半胱氨酸殘基之間將靶肽插入TrxA。有利的是，本發明支架蛋白避免了此種安排，因為11TrxA中的半胱氨酸殘基可發生可逆的二硫鍵結合，這可能改變支架蛋白的構象并可能影響 遞呈的靶肽的構象。因此，靶肽的插入位點優選不在支架蛋白上的兩個半胱氨酸殘基之間。設計考虎支架蛋白優選具有以下一個或多個特征1)結構已知，以便在獲悉情況下選擇用于肽插入或取代的位點；2)足夠穩定，以限制一系列肽的折疊；3)生物學中性，即缺少與可能產生某表型的細胞蛋白質的相互作用；和4)在原核和真核環境中能夠類似地，優選相同地折疊，因此在一個系統中獲得的 數據可預測在另一系統中進行的實驗。本發明提供適合肽適體技術要求的支架。本發明支架蛋白優選具有上面定義的所 有標準。親代胱抑蛋白A的結構已知；工程改造的支架穩定并能耐受至少一個肽的插入而 不失去其生物物理學穩定性；它能夠遞呈用于產生功能性相互作用的各種肽；且不僅將所 有已知的生物學相互作用工程改造掉。講一步的應用本領域技術人員應理解，本發明支架蛋白中遞呈肽適體時，在微陣列中使用肽適 體特別有利。現有技術中的微陣列技術主要依賴抗體。然而，抗體結合陣列時，可能失去特 異性。而且，微陣列中所用的重組蛋白質可提供遞呈蛋白質的信息，但無法提供什么物質與 其結合的信息。相反，在檢測陣列時使用本發明支架蛋白中展示的肽適體可提供更多信息。 例如，觀察結合伙伴時，使用支架蛋白展示適體時產生有利的內容信息。這一優點被鑒定為 天然和知悉(informed)文庫的區別。因此，在另一方面，本發明涉及這些新型支架蛋白在 陣列上展示肽的應用。優選地，本發明支架蛋白是基于胱抑蛋白A的序列。“基于胱抑蛋白A的序列”指 支架蛋白應該具有胱抑蛋白A的98個氨基酸殘基中的至少30個，優選具有胱抑蛋白A的 氨基酸序列的25 %，優選具有胱抑蛋白A的氨基酸序列的30 %、40 %、50 %、60 %或70 %，優 選80 %、優選85 %、優選90 %、優選95 %或更多胱抑蛋白A序列。最優選地，該支架蛋白具 有胱抑蛋白A或STM的序列，或本文所述的新變體之一，并包括上述一個或多個突變。肽適體在體內破壞蛋白質-蛋白質相互作用的能力可能用于快速鑒定新的先導 藥物。而且，本發明能夠有利地促進候選小分子藥物在破壞蛋白質-蛋白質相互作用的應 用。有利的是，可實現包含翻譯后修飾位點如磷酸化位點的肽插入物的應用。這有利 于分析因靶肽磷酸化狀態而改變的相互作用。而且，它可用于鑒定以磷酸化依賴方式結合 的候選肽適體。在一些實施方式中，可能需要通過(例如)在靶肽插入物的任一側工程改造半胱 氨酸殘基，以便在靶肽插入物的任一側引入二硫鍵。如果僅以一種方式使用支架，這可能有 用。在這方面，需要注意家族II半胱氨酸蛋白酶抑制劑利用二硫鍵形成對應于一個優選插 入區域的二級結構元件。在本發明中，這可通過(例如)以下方式實現在支架多肽的C末 端，或者在靶肽內如靶肽的C末端加入一個半胱氨酸，并在第二個位置如該支架的N末端或 靶肽的N末端插入第二個半胱氨酸殘基，從而使它們交聯。然而，優選避免以此方式對肽進 行共價約束。因此，在本發明的優選支架中，靶肽優選不側接半胱氨酸殘基。
總之應理解，不同支架可能在它們所遞呈的肽上強加一個位移(bias)，以使靶肽 的研究宜包括在一個以上支架上遞呈的肽和/或文庫，以便最大程度提高成功的可能性。本發明支架使得研究人員能夠將體外觀察延伸至胞內環境，反之亦然，并使得能 夠在體外鑒定或產生可用于細胞內部而無需擔憂折疊方式或二硫鍵的氧化狀態的工具。基于本發明支架的肽適體是可用于驗證藥物靶點的工具，該藥物靶點可用作診斷 或預后檢測的組件，或甚至構成治療人類疾病的先導化合物的基礎。優選基于全長人蛋白 的本發明支架可用作生物治療劑和/或用于基因治療。IEIi本文所用術語“靶肽”指感興趣的肽。靶肽優選為異源肽。異源指從其通常環境中 分離的肽，優選是具有在攜帶、包含或展示它的支架蛋白的序列中通常不存在的序列的肽。 如果該肽具有在支架蛋白序列之外的地方出現的序列，為了使其成為“異源”，該序列將位 于支架蛋白以外(out of context)，即不占據支架蛋白多肽內的天然存在的位置(地址)。 在這一方面，“位置”指線性氨基酸鏈內的位置，而不是三維空間中相對于其它氨基酸殘基 的位置。靶肽可以是人造肽，例如通過構建用于摻入該支架蛋白的肽文庫產生的肽。在這 些實施方式中，出于本發明目的考慮人造肽應是“異源”肽。肽適體是用于研究細胞中的蛋白質功能的由支架蛋白約束和遞呈的肽。其中一些 能夠破壞蛋白質-蛋白質相互作用，一些能夠建立識別模塊，以便產生用于對蛋白質功能 進行胞內分析的分子工具包。設計或鑒定可以特異性和高親和力地結合給定蛋白質的小分子的能力是許多實 驗，包括蛋白質微陣列的開發、在活細胞環境中進行蛋白質分析和驗證候選藥物靶點中的 限速步驟。實際上，蛋白質-蛋白質相互作用可由折疊蛋白質的小表面介導。這導致將在 穩定蛋白質(成為支架)內遞呈的小肽表面用作蛋白質識別模塊。這種試劑在本文中稱為 肽適體，它已被用于破壞多種系統中的蛋白質生物活性。與游離肽相比，肽適體更容易被遞送，在細胞中更穩定，它們的受限折疊導致較低 的結合熵耗，因此對靶蛋白的親和力提高。在分子工具包的設計中，肽適體的蛋白質工程改 造允許它們提供識別官能團，但這種可能尚未完全實現。肽適體與其靶點的親和力為10"6 M 5x10" 9M,相比而言抗體/靶點相互作用的IQ為10' 7至10" 11M0利用多重插入提高相 互作用的表面積時，預計肽適體能夠匹配或可能超過抗體的結合親和力。然而，肽適體明顯 能夠在體內破壞蛋白質-蛋白質相互作用。在酵母或哺乳動物細胞中進行肽適體篩選，這 不同于對有可能錯誤折疊的原核表達的蛋白質進行的肽或抗體文庫噬菌體展示篩選。雖然大多數廣泛使用的支架是大腸桿菌(Escherichia coli)蛋白質硫氧還蛋白 (TrxA)，但已經使用許多其他蛋白質。這種技術的成功取決于該支架的堅固性，但三分之一 的肽可能使GFP失穩，而許多基于TrxA的肽適體在培養的人類細胞中不能穩定表達，這提 示，此種支架的剛性也可能不足以在不使其自身部分展開的情況下遞呈肽。從一個支架中 取出并放入另一個支架中的肽常常會失去與其靶蛋白相互作用的能力，增加了篩選與給定 靶點相互作用的受限物質失敗的可能性，除非使用合適的支架。最后，現有技術中沒有嚴格 鑒定遞呈肽所用支架的生物學活性，導致人們關心肽適體表達時觀察到的任何表型都可能 (至少部分可能)是因支架作用產生且不是插入的肽。因此，我們產生了用于遞呈受限肽的 各種各樣的堅固的生物學中性支架。我們尋求一種可以在一系列實驗系統中穩定表達、同時遞呈能夠與多種靶點發生功能性相互作用的肽的蛋白質。這種支架通過提高其堅固性顯 著改進了肽適體技術。此外，使用多個支架中的文庫對各個靶點進行同時篩選時，通過擴展 可用支架庫，本發明有利地提高了在對更多靶蛋白篩選中獲得命中的可能性。胱抑蛋白A胱抑蛋白A是半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)家族的半胱氨酸組織蛋白酶 (木瓜蛋白酶家族的溶酶體肽酶)的蛋白質抑制劑的初始成員。半胱氨酸蛋白酶抑制劑家 族的胱抑蛋白亞組是相對較小(約100個氨基酸)的單結構域蛋白質。它們沒有已知的翻 譯后修飾，并缺少二硫鍵，這提示它們能夠在各種胞外和胞內環境中相同地折疊。SteA本身 是98個氨基酸的單體、單鏈、單結構域蛋白質。已經分析過^eA的結構，這有利于通過合 理突變HMeA變為STM支架。半胱氨酸蛋白酶抑制劑的唯一已知的生物學活性是抑制組 織蛋白酶活性，這使得我們能夠不斷地檢測我們工程改造的蛋白質的殘留生物學活性。因 此，我們公開了對天然MeA的蛋白質工程改造可產生可用作肽適體支架的變體。現有技術 中的肽適體遇到了在細胞實驗中鑒定生物學活性的困難，這至少部分由各種現有支架的性 能欠佳所致。本發明提供一種對于想要在體外和體內研究蛋白質-蛋白質相互作用的人大 有裨益的有用支架。胱抑蛋白A序列“基于”胱抑蛋白A的支架具有衍生自胱抑蛋白A的序列。衍生自胱抑蛋白A的序 列優選包含胱抑蛋白A野生型序列，優選包含一個或多個本文所述的修飾(突變)。本領域 技術人員可以明顯看出，可以在不背離本發明的情況下對支架序列作出小修飾。具體說，本 發明涉及與本文所示序列至少25 %，35 %，45 %，55 %或60 %相同，優選至少70 %、優選至 少80%、優選至少85%、優選至少90%、優選至少92%、優選至少94%、優選至少95%、優 選至少96%、優選至少97%、優選至少98%、優選至少99%或者甚至更多相同的氨基酸序 列和/或核苷酸序列，然而在各個情況下，如果序列變異不會對支架將靶肽遞呈給溶劑的 能力造成不良影響，并且不會恢復或產生生物學功能，例如野生型胱抑蛋白A具備、但被本 發明突變消除的生物學功能，則這種序列變異被認為是“小”修飾。而且，小修飾也可包括本文所述的胱抑蛋白A或胱抑蛋白A衍生序列的小的缺失 或加入，例如在胱抑蛋白A衍生多肽中加入或缺失10個氨基酸或更少氨基酸。因此，本發 明涉及相對于本文所述的胱抑蛋白A或STM序列總共加入或缺失40個氨基酸或更少、優選 30個氨基酸或更少、優選20個氨基酸或更少、優選15個氨基酸或更少、更優選10個氨基 酸或更少、優選9個氨基酸或更少、優選8個氨基酸或更少、優選7個氨基酸或更少、優選6 個氨基酸或更少、優選5個氨基酸或更少、優選4個氨基酸或更少、優選3個氨基酸或更少、 優選2個氨基酸或更少、優選1個氨基酸的氨基酸序列。加入或缺失總數是重要因素，以使 9個或更少的氨基酸差異可能意味著缺失9個氨基酸，或缺失三處每處三個氨基酸，或加入 兩處每處三個氨基酸和缺失一處三個氨基酸，等等。本發明也涉及相應的核酸變體。在每 種情況下，如果序列變異不會對支架將靶肽遞呈給溶劑的能力產生不良影響，且不會恢復 或產生生物學功能，例如野生型胱抑蛋白A所具備的生物學功能，則該序列變異被認為是 “小”修飾。胱抑蛋白A和STM突變在討論突變位點時，“接近”意味著在7個氨基酸以內、優選5個氨基酸以內、優選3個氨基酸以內、優選2個氨基酸以內、優選在標稱氨基酸處或兩個相鄰氨基酸之一處。在插入中，優選在核酸水平引入限制性酶切位點，優選獨特的限制性酶切位點以 利于后期插入。重組核酸技術領域的這些知識和常識使得本領域技術人員能夠引入相關的 限制性酶切位點，同時保持該支架的關鍵特征。“獨特”指在支架蛋白的編碼序列中獨特。 可使用非獨特位點，但優選獨特位點以便于插入和操作該構建物。使用(例如)兩個或多 個位點來促進去除和取代MeA環1的密碼子67-84中任何密碼子的序列時，這兩個或多個 位點優選是各自獨特的。然而，如果這兩個或多個位點相同，可能有利地簡化去除和取代操 作，例如可能只包括一個限制性酶處理步驟。本發明所屬領域的技術人員能夠進行這些選 擇。在優選實施方式中，引入兩個相同位點以去除和取代該環。優選地，用于突變編碼序列 的限制性位點是不同的，以便利用不同的限制性酶在編碼序列的這四個位置上進行插入或 修飾，從而利于操作。4位突變術語“4位突變”在本文中用于描述在胱抑蛋白A的G4位點或STM的W4位點周 圍，優選接近上述位點或優選在上述位點中的突變，突變指加入或插入或取代MeA或STM 的氨基末端氨基酸殘基。這類突變優選接近ftx)3，優選接近G4(胱抑蛋白A)或W4(STM)。 這類突變優選靠近人胱抑蛋白A或STM的ftx)3，或優選在人胱抑蛋白A或STM的中。 最優選是用R取代殘基4。在優選實施方式中，除上文所述的環1和/或2的其它突變外，4位位點用作一級、 二級或三級插入位點。R而非G的存在能提高識別(靶點結合)表面的可及性，因為R是帶 正電的氨基酸，能防止α螺旋環覆蓋識別位點。而且，所述改變單獨出現時使適體失穩，但 適體結合靶點后會穩定化。密碼子46-54中的突變術語“密碼子46-54中的突變”在本文中用于描述在MeA的VAG位點或STM的 DAG位點周圍，優選接近上述位點或優選在上述位點中的突變。VAG位點是位于人^eA殘 基46-50的QVVAG位點的殘基48-50。DAG位點是位于STM殘基46-50的QVDAG位點的殘 基 48-50。它優選指VAG/DAG位點周圍、優選接近該位點或優選在該位點中的加入或插入或 取代。它優選指VAG/DAG位點中的加入或插入。在優選實施方式中，46巧4位點用作一級、二級或三級插入位點，與本文上述突變 聯合使用。在一個優選實施方式中，VAG/DAG位點的突變是LAS。實驗證明，修飾D48L和G50S導致細菌系統中的表達水平提高。密碼子67-84中的突變術語“密碼子67-84中的突變”在本文中用于描述人胱抑蛋白A的L73-L80環或 STM的P73-L80環周圍，優選接近所述環或優選在所述環上的突變。該術語可以指該位點上的加入、插入或取代。在一個實施方式中，突變可包括用任何肽序列優選用一系列不同的靶肽序列(優 選每個胱抑蛋白支架分子只有一個靶肽序列)，即文庫取代L73和L80之間或P73和L80之 間的整個環。
在核酸水平，優選的突變是產生用于插入該環的限制性酶切位點，更優選用于取 代該環編碼序列的兩個限制性位點的突變。特別優選的限制性酶切位點是RsrII限制性位點ο在優選實施方式中，環2位點用作一級、二級或三級插入位點，與本文上述突變聯 合使用。在NGP處工程改造有突變的兩種新的本發明支架(SQM具有L82R和T83S、SQT具 有E78A和L80R)各自在大腸桿菌中高表達，這最出于意料，因為它們與親代蛋白明顯不同。 如圓二色性法所顯示，SQM和SQT均具有穩定的結構，這是出乎意料的，因為它們與親代蛋 白明顯不同。插入這些適體的肽是可接觸溶劑的，如抗體結合實驗所示，這些蛋白質連接于固 體表面時優選保持其結合和功能。而且，由于三個插入物的位置它們的表面積增加，因此產 生較高的親和力結合，實驗證明具有某特定組肽的SQM能正確折疊，且不會形成可能遮蔽 結合位點的二聚體，這與STM的情況相反，因而提供優于現有技術的顯著優勢。而且，可通 過本發明支架，利用(例如)SQM制備肽適體文庫，從而鑒定因存在多個結合表面可能與人 體組織中的靶點相互作用的適體。MA優選地，插入物接近人胱抑蛋白A的L73-L80環或STM的P73-L80環、或優選位于 上述環中，更優選具有退火序列編碼的兩個殘基LeuAla，因此該支架蛋白比原始的胱抑蛋 白A長2個殘基。突變組合本發明支架蛋白優選基于胱抑蛋白A或STM，其包含至少一個上述突變。優選地， 支架蛋白包含至少兩個或所有三個上述突變。本發明支架蛋白優選具有所有三個上述突 變，該蛋白的其余部分類似于胱抑蛋白A或STM或其它變體之一。此外或或者，當末端突變 位于72/73位或82/83位時，其后接去除或取代胱抑蛋白A或STM的最后25個或最后15個 氨基酸的終止密碼子。有利的是，靶肽可插入三個優選突變位點中的任何一個突變位點中。 在高度優選的實施方式中，基于胱抑蛋白A/STM的支架蛋白允許使用總共三個表面。它們 是4位、環1和環2限定的表面(圖2)。固相和微陣列如上所述，本發明可應用于微陣列。在固相實施方式，如微陣列實施方式中，優選 工程改造本發明支架蛋白，以利于其結合或連接于該測定的固相基質上。這優選通過粘合 于金涂層，或通過與生物素結合進行。為了工程改造支架以便粘合于金涂層，優選將一個或 多個Cys殘基引入支架蛋白的C或N末端。為了工程改造支架以便通過附連生物素進行固 定，優選將一個或多個拷貝的八氨基酸生物素結合域(‘streptag')引入所述支架。可通 過這些或任何其它合適方式中的一種或多種方式進行固定。優選固定本發明的支架蛋白。 優選工程改造本發明的支架蛋白以進行固定。優選用固定的支架蛋白進行本發明的相互作 用檢測。本發明的其它優勢基于胱抑蛋白A的支架蛋白優于使用肽，因為它們可以在體內使用。而且，使用重 組系統的成本低于使用合成肽。而且，基于相同的原因構建文庫的成本低于使用合成文庫，也因為它們可利用核酸操作合理設計。這能降低對復雜的肽合成化學過程的依賴。基于胱抑蛋白A的支架蛋白優于現有技術例如噬菌體展示，因為它們在細胞內 部，而噬菌體展示依賴于胞外相互作用。而且，本發明支架蛋白可作用于天然靶點，而非重 組靶點。這能產生一個額外優點，即允許檢測正確地磷酸化或糖基化的翻譯后修飾的蛋白 質，或在體內翻譯后修飾、但如果在體外產生可能不能正確形成的蛋白質。本發明支架蛋白的另一項優點是它們能夠檢測天然產生的一系列剪接變體和翻 譯后修飾變體，這些變體在體內產生，不需要單獨制造和測定或區分它們進行分析。本發明的另一項應用是在將微懸臂作為與基于胱抑蛋白A的支架蛋白發生相互 作用的讀出機中的應用。而且，本發明支架蛋白特別適合與電化學和/或薄膜晶體管型讀 出機一起使用。本發明支架的另一項優點是本發明肽適體可代替抗體，結果證明，它們的性能可 能更好，例如用肽適體檢測⑶K2比抗體更快。因此，肽適體而非抗體的應用意味著在生產 分子探針的過程中需要使用的動物更少，這為科學研究提供了顯著優勢。下面通過實施例的方式描述本發明，其中參照了以下附圖。附圖簡要說明圖1顯示STM和變體在大腸桿菌中的表達和溶解度；圖IA顯示SUN、SUM和STM變 體，圖IB顯示SUC和SDM變體，圖IC顯示SQM變體。圖2顯示采用Cn3D軟件和PDB協同IDVD產生的STM變體的匪R解析結構，其中 標出了密碼子4位、環1中的密碼子48-50位、環2中的密碼子67-84位以及91-92位密碼 子(Martin 等，1995 “人胱抑蛋白 A 的三維解析結構”(The three-dimensional solution structure of human stefin A), JMol Biol，第 246 卷，第 331-43 頁)。標明了突變產生 修飾的胱抑蛋白A蛋白的區域。圖 3 顯示了 SDM、SUC、AUM、SUN、SQM、STM W4R 和 STM 參比曲線的圓二色(CD)譜分 析，其測定因結構不對稱造成的左手極化光與右手極化光的吸光度差異，以便說明STM和 新變體之間保留的二級結構的比例。圖 4 顯示長時間儲藏后，STM、SDM、SQM、SUM、SUN、SUC, ρ印6M、ρ印9Μ 和 ρ印 10Μ 的 圓二色(⑶)譜分析。圖5顯示STM、SDM、SQM、SUM、SUN、SUC, ρ印6M、ρ印9Μ和ρ印10Μ的獨立制劑的圓 二色(⑶)譜分析。圖6 顯示 SQT 和其表位標記變體-SQT-AUI (1)、SQT-AUI (2)、SQT-HA (2)、 SQT-myc (1)、SQT-myc (2)、SQT-AUI (1)、AUI (2)、SQTAUI (1)、HA (2)和 SQT-AUI (1)、myc (2) 的圓二色(⑶)譜分析。圖 7 顯示表位標記的 SQM 變體-SQM-myc (1)、SQM-AUI (2)、SQM-myc (η) AUI (1)、 SQM-AUI (1)、HA (2)、SQM-myc (η)、AUI (1)、HA (2)、SQM-HA (N-末端)、SQM-myc (2)、SQM (21 隨機-環 1)、SQM-AUI (1)、SQM(AUIx2、環 1)、SQM-HA (η)、AUI (1)、SQM-HA (η)、myc (2)、 SQM-AUI (1)、myc (2)、SQM-HAx2 (η)、AUI (1)、myc (2)、SQM-HA(η)、AUI (1)、myc (2)和稱為 ρ印22 (Trx)的肽適體的圓二色(CD)譜分析。圖8A顯示用抗-AUI抗體對AUI肽進行的免疫沉淀，圖8B顯示SQM-myc (環1)免 疫沉淀，圖8C顯示SQT-HA(環2~)免疫沉淀。17
圖9顯示用在不同位置具有不同表位的肽適體進行的微陣列實驗結果。圖10顯示在SQM支架中抗體/表位相互作用的表面等離振子共振(SPR)測定結 果。圖IOA比較了固定在化學吸附的SQM(Nt Ha,Ll Aul,L2 Myc)單層(黑色)上的IOmM 磷酸鹽緩沖液(pH 7. 3)配制的33nM抗-Myc (紅色)、抗-Ha (藍色)和抗-Aul (綠色)溶 液。圖IOB顯示擬合至飽和動力學函數M= (CxBmax)/(C+K)的不同濃度的抗-Myc下的SPR 反應，產生的平衡常數為50x10—1。圖11顯示包含插入環1(上)或環2(中)或氨基酸末端(下)的864個隨機肽 適體的微陣列的結果。圖12顯示將肽適體用于SQM (SQM-pep6)和SQT (SQT-peplOm)以檢測兩份人 (HeLa)細胞裂解物中內源性cdk2表達。實施例1參照圖2，顯示了胱抑蛋白A的三維結構和胱抑蛋白A中被突變以生成新的本發明 支架蛋白的三個位點。這些位點是胱抑蛋白A的G4位或STM的W4位；限定環1密碼子 46-54中任何一個，特別是密碼子48-50位；任何密碼子；限定環2的密碼子67-84中任何 一個，特別是70-73的突變。通過突變如上所述胱抑蛋白A序列產生用作支架蛋白的修飾 的胱抑蛋白A或STM多肽。在上文所述的序列中給出得到的基于胱抑蛋白A但具有特定突 變的蛋白質。實施例2圖1顯示STM和示范性變體在大腸桿菌中的表達。將STM和本文所述變體的開 放閱讀框克隆到一種大腸桿菌表達載體pET30a+中，該表達載體經工程改造在氨基末端尾 上包含額外官能團，如半胱氨酸殘基(在所有變體中均出現)或Mi^pII標簽(僅在STM 中)。與其它變體相比，插入的Str印II標簽的額外8個氨基酸造成在STM蛋白遷移中的 微小差異。在不存在(_)或存在(+)異丙基-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的條件下培 養攜帶這些表達構建物的大腸桿菌細胞，IPTG能誘導STM和變體蛋白的表達(用*標出)。 在37°C誘導3小時后，超聲裂解細胞，將16，OOOxg離心10分鐘后回收的全細胞裂解物(T) 或可溶( 部分加載到15%聚丙烯酰胺凝膠上。用考馬斯藍染色觀察蛋白質。通過此種方 法的測定，可溶組分中所示各蛋白(SUN、SUM、STM、SUC、SDM和SQM) 100%可回收，這表明變 體蛋白在大腸桿菌中仍然能夠折疊。實施例3在基于胱抑蛋白A的新支架蛋白和/或STM的生產中，已采用一種合理方法來設 計新肽。新的本發明支架蛋白需要具有理想支架所需具備的可廣泛用于體外和體內研究的 品質，還需要將這些標準應用于新支架設計。從穩定的小胞內蛋白酶抑制劑胱抑蛋白A或STM開始，我們工程改造了許多保持 母體蛋白的穩定構象的生物學中性支架。我們預計，修飾的新支架蛋白能夠在已知相互作 用物質和文庫篩選中遞呈結合于感興趣靶點的肽。基于支架的分子工具可應用于各種生物 學途徑研究，并可用于驗證藥物靶點。MeA是98個氨基酸的單體、單結構域蛋白質，其未接 受已知的翻譯后修飾并缺少二硫鍵。MeA顯示出顯著的熱穩定性、在90. 8°C觀察到可逆轉 變(transition)、折疊焓為490kJ/mol，這些是MeA-基支架的所有重要特征。實施例4
將STM變體表達質粒(均使用pET30a+)轉化到大腸桿菌中。將單個菌落接種到 培養物中，37°C振蕩培養過夜(在軌道振蕩器上250rpm振蕩培養)。第二天早晨，將過夜培 養物各0. 5mL接種到500mL補充有卡那霉素的新鮮培養基中，以維持對pET30質粒的選擇。 培養物達到對數中期(0D600 0. 6-0. 8)時，誘導變體蛋白表達。將該培養物再于37°C振 蕩培養3小時。離心收獲大腸桿菌細胞，并用FP (French Press)裂解。離心澄清該裂解物， 用Ni-螯合物親和層析由所得上清液純化STM變體蛋白。為此，每20mL裂解物使用0. 5mL Ni-NTA瓊脂糖(凱杰公司(QIAgen) )0用5OmL Falcon試管于700g離心該樹脂2分鐘，棄 去上清液。用2.5mL Ix平衡/洗滌緩沖液洗滌該樹脂三次，每次洗滌的具體步驟是將該樹 脂重懸于緩沖液、然后700g 4°C離心2分鐘、去除上清液。將裂解物與洗滌的金屬親和樹 脂混合，在輥上4°C孵育2小時。保留一份裂解物進行后續分析。通過700g 4°C離心5分 鐘和去除上清液從裂解物中分離樹脂。保留另一份裂解物，以便對結合效率進行后續分析。 通過以下方法洗滌該樹脂六次將珠重懸于IOmL洗滌緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM咪唑，pH 7.4)，然后70(^41離心2分鐘，再去除上清液。在室溫下用ImL洗脫緩沖液 (50mMNaH2P04,300mM NaCl，150mM咪唑，pH7. 4)培育樹脂10分鐘。700g離心該懸液5分鐘， 保留上清液。再重復該步驟兩次，以便再產生兩份洗脫組分。保留蛋白質濃度最高的組分， 4°C儲存。在圓二色譜分析中，用50mM磷酸緩沖液pH 7.4緩沖交換該樣品。在分析當天將 樣品稀釋至約0. 3mg/ml，用納米滴(NanoDrop)分光光度計進行精確的蛋白質測定。如圖所 示，臨分析前加入ImM DTT。用Jasco J715分光偏振計在200460nm處測定⑶譜。用摩 爾蛋白質濃度標準化該譜圖，對殘留摩爾橢圓率作圖，以便最大程度降低樣品之間的偽像 (artefact)。實施例5為了確定基于胱抑蛋白A和STM的本發明新支架蛋白的構象是否穩定以及在 DNA (開放閱讀框)水平作出的導致新的胱抑蛋白A/STM變體氨基酸序列改變的改變是否導 致該蛋白穩定性降低，表達本文所述的所有變體，并進行圓二色性分析，以將其二級結構組 成與胱抑蛋白A作比較。由圖1可以看出，所有蛋白質在大腸桿菌中等同地表達，一般表達 至約^mg變體蛋白/毫升細菌培養物。接著，用Ni-瓊脂糖通過親和層析將蛋白質純化至 接近均一，在進行圓二色譜分析之前將純化制劑稀釋至0. 3mg/ml。如上所述，圓二色性分 析包括在一系列近UV波長上掃描蛋白質，以使蛋白質的二級結構元件(α-螺旋或β-折 疊)影響光的橢圓率。從圖3可以看出，在STM和通常稱為SDM、SQM、SUM、SUN和SUC的本發明新變體 (參見上文中的SEQ ID NO 9-13)之間二級結構的比例保持不變，并且STM中存在插入物 不會對其結構造成不良影響。特別需要注意的是，與其他測試的支架蛋白相比，有兩種變 體(SUN和SQM)似乎顯示出結構增加。這可歸因于存在于所有這些蛋白質中的氨基末端尾 中獲得二級結構，可由精氨酸取代4位的甘氨酸(胱抑蛋白A)或色氨酸(STM)驅動，因為 這是SUN和SQM之間共有的唯一的改變，它們是具有這一改變的僅有的變體。考慮到SUN、 SUM、SUC和SDM中的小改變時，結果表明218nm處大拐點的位置基本不受各改變的影響(圖 3)，這表明，與通常預計氨基酸改變會使蛋白質失穩不同，胱抑蛋白A衍生物中二級結構的 比例不受氨基酸改變的影響。相反，各變體之間的內彎深度明顯不同(圖3).實施例619
研究了貯存的影響。圖4顯示，用pH7. 4的磷酸緩沖液4°C儲存所檢測的所有支架 蛋白變體的濃縮母液兩周后，分析新鮮稀釋的相同樣品時二級結構的比例保持不變(與圖 5相比)。這是無法預測的，因為至此大多數蛋白質已被完全變性或因吸附于儲存容器而丟 失，除非加入大量載體蛋白。此步驟，即加入載體蛋白的步驟不合需要，因為目的是使用高 度純化的肽適體制劑以最大程度降低診斷和分析實驗中因無關蛋白質如載體蛋白質的存 在而產生的非特異性信號。總之，新支架蛋白胱抑蛋白A變體可儲存于簡單的磷酸緩沖液 中，沒有明顯不良影響。此觀察結果意味著，這種性能可能有助于所述新支架蛋白胱抑蛋白 A變體的工業應用。實施例7也對變體STM、SDM、SQM、SUM、SUN、SUC和三種肽適體ρ印6M、ρ印9Μ和ρ印IOM進 行圓二色譜分析(圖6)。加入DTT，以防止所表達的變體蛋白的氨基末端尾中存在的半胱 氨酸殘基形成可能影響實驗的分子間二硫鍵。存在或不存在DTT不會改變觀察到的二級結 構，但在不存在情況下獲得的譜圖更易于解釋，因為DTT本身能在近UV區產生信號。這些 結果表明，DTT不會影響本發明支架蛋白的二級結構。實施例8評估了除環1和環2中的改變外在4位也包含突變，即在單個支架中包含多個插 入位點的SQM變體(SEQ ID NO :10)作為支架蛋白展示系統的能力。分別在4位、48位和 72/82位插入肽(HA、AUl或MYC)，產生圓二色譜數據(圖7)。圓二色譜分析數據表明，新 插入位點不僅能夠遞呈肽進行相互作用，還能在不顯著丟失結構的情況下實現這一目的。實施例9使用兩種方法測定氨基酸改變對支架結構的影響。簡言之，第一種方法是測定工 程改造的蛋白質在大腸桿菌中的相對表達水平，其基本原理是大部分氨基酸改變可能使該 蛋白失穩。下表1給出了由細菌培養物表達各種支架變體的表達產率，產率記作每升培養 物中純化蛋白的毫克數。表 權利要求
1.一種修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其中所述修飾包含在選自下組的位 點插入的單個突變或異源寡核苷酸編碼的肽(i)密碼子4上的突變，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或異源 寡核苷酸編碼的肽替代，所述另一氨基酸對于胱抑蛋白A不是色氨酸或對于STM不是甘氨 酸；或者( )在編碼包含或限定環1的氨基酸的密碼子46-M中的任何改變或異源寡核苷酸編 碼的肽插入；或者(iii)在編碼包含或限定環2的氨基酸的密碼子67-84中任何改變或異源寡核苷酸編 碼的肽插入。
2.如權利要求1所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在于，所述4 位突變對于胱抑蛋白A是G4R，對于STM是W4R。
3.如權利要求1所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在于，所述突 變是密碼子46-54中的任何改變，對于胱抑蛋白A是48-VAG-50、對于STM是48-LAS-50。
4.如權利要求3所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在于，所述突 變是48-LXS-50，X是任何氨基酸。
5.如權利要求1所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在于，所述突 變是密碼子67-84中的任何改變，對于胱抑蛋白A是71-KSL-73、對于STM是71-NPG-73。
6.如權利要求5所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在于，所述突 變是71-NxP-73，X是任何氨基酸。
7.如前述任一項權利要求所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在 于，其終止于胱抑蛋白A或STM的殘基73或84處。
8.如權利要求7所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在于，所述終 止殘基73或84后接去除或取代胱抑蛋白A或STM的最后25個或最后15個氨基酸殘基的 終止密碼子。
9.如權利要求7或8所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM支架蛋白，其特征在 于，將異源寡核苷酸編碼的肽插入胱抑蛋白A或STM的殘基73或84和末端終止密碼子之 間。
10.如權利要求9所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其特征在于，所述 異源寡核苷酸編碼的肽包含20個或更少氨基酸。
11.如前述任一項權利要求所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或STM蛋白，其特征在于，除 所述突變外，所述蛋白的其余部分類似于胱抑蛋白A或STM。
12.—種修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其包含在選自下組的位點上的兩個 突變或兩個異源寡核苷酸編碼的肽插入(i)密碼子4上的突變，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或所述 異源寡核苷酸編碼的肽替代；和/或( )在編碼包含或限定環1的氨基酸的密碼子46-M中的任何改變或異源寡核苷酸編 碼的肽插入；和/或(iii)在編碼包含或限定環2的氨基酸的密碼子67-84中的任何改變或異源寡核苷酸 編碼的肽插入。
13.如權利要求14所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其還包括權利要 求2-11中所述的任何一個或多個特征。
14.一種修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其包含以下位置插入的三個突變或 異源寡核苷酸編碼的肽(i)密碼子4上的突變，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或所述 異源寡核苷酸編碼的肽替代；和( )在編碼包含或限定環1的氨基酸的密碼子46-M中的任何改變或異源寡核苷酸編 碼的肽插入；和(iii)在編碼包含或限定環2的氨基酸的密碼子67-84中的任何改變或異源寡核苷酸 編碼的肽插入。
15.如權利要求14所述的修飾的胱抑蛋白A多肽或修飾的STM蛋白，其還包括權利要 求2-11中所述的任何一個或多個特征。
16.—種多肽，其包含 SEQ ID NO :9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24和25中任一項所列的氨基酸序列。
17.如權利要求19所述的多肽，其特征在于，任何一個氨基酸序列還包含一個或多個 插入其中的異源寡核苷酸編碼的肽。
18.如前述任一項權利要求所述的包含在任何一個或多個突變位點中插入的異源寡核 苷酸編碼的肽的多肽作為支架蛋白的應用。
19.如前述任一項權利要求所述的多肽用作選自下組的試劑的應用診斷劑、治療劑、 生物標記物、結合和特異性檢測生物標記物的試劑、合理化藥物設計模板、藥物發現靶點或 試劑、抗體替代品和研究工具。
20.一種鑒定能夠結合感興趣結構的靶肽的方法，所述方法包括(i)提供權利要求1-17中任一項所述的修飾的胱抑蛋白A或STM蛋白，其包含靶肽；( )將所述支架蛋白與所述感興趣結構相接觸；和(iii)監測所述支架和所述感興趣結構之間的結合，其中所述支架蛋白與所述感興趣 結構發生結合后則可將該靶肽鑒定為能夠結合所述結構的候選靶肽。
全文摘要
本發明提供用于展示肽如肽適體的新型支架蛋白。該新型支架蛋白是胱抑蛋白A或STM(胱抑蛋白A的一種變體)的修飾形式，可用作支架蛋白和展示系統。
文檔編號C12N15/10GK102056942SQ200980122473
公開日2011年5月11日 申請日期2009年4月16日 優先權日2008年4月18日
發明者E·讓德拉, 費林諾 P·哥 申請人:利茲大學, 醫療研究局