輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法及其專用引物的制作方法

專利名稱：：輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法及其專用引物。
背景技術：
：面粉及其制品顏色是小麥品質遺傳改良的重要內容。脂肪氧化酶(Lipoxygenase，L0X)活性是影響面制品顏色和加工品質的主要因素，在小麥制品加工和貯存期間引起面粉和面制品失色、變白。通過遺傳育種途徑提高小麥LOX活性，培育LOX活性高的小麥品種是小麥品質改良的重要目標。研究人員已作過許多關于小麥LOX活性的遺傳研究，Borrelli等(1999)研究表明，基因型、環境以及基因和環境互作對LOX活性均有顯著的影響，但主要受遺傳因素影響。Leenhardt等(2006)對一粒小麥、硬粒小麥和普通小麥籽粒中類胡蘿卜素含量(葉黃素Lutein)和LOX活性進行了研究，發現在不同小麥類型中葉黃素含量依次顯著降低，而普通小麥LOX活性分別是硬粒小麥和一粒小麥的3倍和7倍。根據禾本科作物基因共線性原理，結合玉米和水稻中LOX活性相關基因的定位結果，Li等(1999)和Wang等(2008)推測控制小麥LOX活性的重要基因位于第4和第5同源染色體組上。目前，大量QTL定位結果也表明，普通小麥及硬粒小麥LOX活性基因位于第4和第5同源染色體組上，第4同源染色體尤為重要(HartandLangston,1977；Carrera等，2007)。此外，1A、7B等其它染色體上也存在QTL(Trufanov等，2007)。硬粒小麥4B染色體長臂上存在效應較大的QTL(Hessle等，2002)，而Carrera等(2007)和Pshenichnikova等(2008)也將控制普通小麥LOX活性的位點定位于4BL上。此外，水稻、硬粒小麥等谷物作物的LOX基因研究要比小麥深入，基因全序列已被克隆。普通小麥LOX基因全序列未克隆，其LOX基因cDNA全序列已克隆，但迄今為止還未開發出可應用于小麥育種的LOX基因分子標記。
發明內容本發明的目的是提供一種輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法及其專用引物。本發明提供的輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，同時用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；如果沒有得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有低籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；所述高籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為TSA234Hiirr1g-1以上；所述低籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為TOA234Hiirr1g-1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA組成的引物對。本發明提供的另一種輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法，包括如下步驟包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，分別用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果用引物對甲得到235bp的DNA片段且用引物對乙得到117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；如果用引物對甲沒有得到235bp的DNA片段且用引物對乙沒有得到117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有低籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；所述高籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為δΑΜπ—1以上；所述低籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為TOA234Iiiin-1g-1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA組成的引物對。本發明提供的鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，同時用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為TSAmmir^g-1以上；如果沒有得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為TOA234Hiirr1g-1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA組成的引物對。本發明提供的另一種鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，分別用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果用引物對甲得到235bp的DNA片段且用引物對乙得到117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為δΑΜπιΤ、—1以上；如果用引物對甲沒有得到235bp的DNA片段且用引物對乙沒有得到117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為TOAmmir^g—1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA組成的引物對。以上任一所述的方法中，所述待測小麥具體可為為CA0431小麥或泰山21小麥；所述脂肪氧化酶活性(A234HiirT1g-1)定義為以亞油酸為底物，每克小麥每分鐘反應產物在234nm吸光度下的增加值；所述反應產物為共軛二烯。本發明保護一種引物組合物，由引物對甲和引物對乙組成；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。本發明還保護引物對甲和/或引物對乙在制備如下㈧或⑶試劑盒中的應用(A)輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的試劑盒；(B)鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的試劑盒；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。本發明同時保護輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的試劑盒或鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的試劑盒，由引物對甲和/或引物對乙組成；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。引物對甲和/或引物對乙在輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥或鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。本發明還保護序列表的序列5所示的DNA片段(235bp的DNA片段)或序列表的序列6所示的DNA片段(117bp的DNA片段)。本發明應用分子數量遺傳學方法和小麥微衛星(microsatellite或SSR)技術在小麥染色體IA和4B長臂上發現了兩個小麥脂肪氧化酶活性的主效QTLQLpx.caas-lAL和QLpx.caas-4B,距主效QTL最近的分子標記分別為Xwmc312(遺傳距離為2.0)和Xgwm251(遺傳距離為1.2cM)，所述標記Xwmc312和Xgwm251可以在多個環境條件下被檢測至IJ，是穩定的分子標記，其效應也尤為突出。本發明同時還提供了LOX基因的SSR復合分子標記XWmc312/XgWm251，利用該復合標記采用多重PCR的方式，可以對小麥脂肪氧化酶基因LOX進行分子標記輔助選擇，從而培育出脂肪氧化酶活性高的優良小麥品種；此外，還可利用該分子標記檢測小麥中脂肪氧化酶的活性，檢測方法簡單易行、穩定可靠。本發明的方法及其專用引物將在小麥脂肪氧化酶活性性狀的檢測和小麥育種中發揮重要作用。圖1為復合區間作圖法在DH群體中優9507/CA9632中定位的脂肪氧化酶活性相關基因曲線圖。圖2為Xwmc312/Xgwm251對16個小麥品種的多重PCR擴增產物電泳圖。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、小麥LOX基因的SSR分子標記組合Xwmc312/Xgwm251的獲得用中國農科院作物所培育的LOX活性高的小麥品種‘中優9507’與PPO活性較低的小麥品種“CA9632”雜交，F1代種于試驗田中，抽穗時取花藥離體培養，并進行單倍體加倍，得到DH群體，然后進行LOX活性分析。田間試驗分別在中國農業科學院棉花研究所所(安陽)和山東農業科學院作物所(濟南)2個地點進行，每個地點重復2次，小區為3行區，行長2米，每行播種80粒。收獲后測試每個DH系的LOX活性。用125對SSR引物(wmc336a，Xgwml36，gdm33c，wmc329，wmc84b，Xgwm357，wmc469，wmc312,Xgwm448c,Xgwm99,wmc367,Xgwm26,gdm33b,wmc336b,wmc522,wmcl77,Xgwm356,wmcl91,Xgwm372,Xgwm425,Xgwm448b,Xgwm382,Xgwm312,Xgwm294,Xgwm410,Xgwm374,wmcl54,wmc257b,Xgwm261,Xgwm296,Xgwml57,Xgwm539,Xgwm349,wmc419,wmc256a,wmc200a,wmcl32c,wmc36a,wmc41,wmc410,wmc532,Xgwm66,Xgwm493,wmc326,wmc308c,Xgwml14c,Xgwm264a,Xgwm285,wmc291,Xgwm376,Xgwm247,Xgwm389,gdm72,wmc533,Xgwm3,wmcl70b,Xgwm645,Xgwm383,wmc236,wmcl32e,wmc297,wmc308a,wmc238,Xgwm495,wmc349,Xgwm6,Xgwm251,Xgwml49,wmc449,wmc459,wmc285,wmc473,gdml25,wmc308b,wmc457,gdml33a,Xgwml94,Xgwm293,wmc257a,Xgwml86,wmc327b,Xgwml26,gdml33c,wmc537,Xgwm67,wmcll8,gdml32b,Xgwml90,gdm68,Xgwml82,Xgwm272,Xgwml14a,wmc215,wmcl32a,gdm33a,wmc201,Xgwm570,wmc256b,wmc32,wmc84a,Xgwml69,Xgwm518,Xgwml14g,Xgwml93,gdml32a,Xgwm325,wmc479,wmcl7,Xgwm276,Xgwm282,wmc36b,Xgwm264b,Xgwm569,Xgwm297,wmc402b,wmc396,wmc76,Xgwm400,Xgwm577,wmc323,wmcl32b,Xgwmlll,wmc346,wmc38,wmc438)、4對貯藏蛋白的STS引物(Glu-A3,Glu-B3,Gli-Bl,Glu-Dl)和26對AFLP引物組合(P41-M32e,P33_M38c，P42_M45c，P42_M45a，P32_M35e，P41_M32a，P42_M45h，P42_M45j，P32-M35b,P33-M38a,P31_M31a，P38-M46d,P42_M45g，P38_M46b，P38_M46a，P42-M45d,P42-M45e,P31-M31c,P42-M45f,P41-M32c,P35-M41d,Ρ42-Μ45,P35_M41a，P31-M31e,P35-M41b，P31-M31b)對該DH群體進行遺傳分析，應用MAPMAKER3.O軟件構建連鎖圖，并用Cartographer軟件包的復合區間作圖法(CIM)分別進行2個地點(北京、安陽)L0X活性的QTL分析。結果如圖1所示，表明在小麥染色體IA長臂(IAL)和4B長臂(4BL)上各有一個主效LOX活性基因，分別與微衛星標記Xwmc312和Xgwm251緊密連鎖，其中Xwmc312與LOX基因的遺傳距離為2.OcM，而Xgwm251與LOX基因的遺傳距離為1.2cM。實施例2、小麥脂肪氧化酶(LOX)活性的測定實施例所用的小麥品種(1)衡7228，購自河北省農林科學院旱作農業研究所)；(2)藁城8901，購自河北省藁城農業科學研究所)；(3)泰山269，購自山東省農科院作物所；(4)周892，購自河南省周口市農業科學院；(5)觀35，購自河北省農林科學院旱作農業研究所；(6)石新733，購自石家莊小麥新品種新技術研究所；(7)京9428，購自北京市種子公司；(8)CA0431；獲自中國農業科學院作物科學研究所的國家種質庫；(9)泰山21，購自山東省農科院作物所；(10)良星66，購自山東良星種業有限公司；(11)濟麥21，購自山東省農科院作物所；(12)周麥11，購自河南省周口市農業科學院；(13)藁城9411，購自河北省藁城農業科學研究所；(14)臨麥2號，購自山東省臨沂市農業科學研究所；(15)石6365，購自石家莊市農業科學研究院；(16)CA0477,獲自中國農業科學院作物科學研究所的國家種質庫。將上述16個冬小麥品種種植于中國農科院棉花研究所(安陽)和山東農科院作物所(濟南)，田間管理按常規方法進行，收獲籽粒。一、LOX活性測定按下述方法測定籽粒的LOX活性1、LOX的提取①精選約100粒種子，磨成全粉(S卩LOX活性定義中所指的粗麥粉)，稱取0.20g放入2mL的離心管中，加入ImL的0.ImM的磷酸緩沖液(PH=6.5)，放在混旋器上震蕩IOmin。②將震蕩完畢的離心管立刻放入4°C冰箱中lh，期間每隔IOmin搖晃一下離心管，使提取液與樣品充分接觸。③以12000rpm的轉速，在4°C條件下離心lOmin。④吸取上清液，即為脂肪氧化酶粗提物，4°C下保存(24h后降解作用明顯)。2、底物的制備①將240μ1Tween20和200μ1亞油酸(底物)依次加到IOOml的容量瓶中。②將5ml的0.IM磷酸緩沖液(pH=9)加入容量瓶中，待底物溶解后，用0.IM的磷酸緩沖液(6.5)補足至100ml，得到底物溶液；底物溶液中的亞油酸濃度在7.5mM左右，Tween20的濃度約為0.24%，整個過程必須在N2條件下進行操作。③將配制好的IOOml底物溶液分裝到1.5ml的離心管中，管中充入氮氣后蓋緊管蓋，保存于_80°C。3、LOX活性檢測①用0.ImM的磷酸緩沖液(PH=6.5)進行調零。②依次向比色皿中加入2.8mL0.ImM的磷酸緩沖液(PH=6.5)、180μ1步驟2的底物溶液和20μ1步驟1的LOX粗提物。③用分光光度計取1.Ocm比色皿，在234nm下測定混合液在120s內吸光度的增加值(ΔA234)，間隔IOs測定一次反應產物。LOX活性被定義為，每克粗麥粉每分鐘反應產物(共軛二烯)在234nm吸光度下的增加值<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>。LOX活性<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中AA234為234nm波長下IOs內吸光度的平均增加值。各個品種小麥的籽粒的LOX活性見表1。表1各個品種小麥的籽粒的LOX活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果表明=CA0431(籽粒LOX活性85.4A234Hiin^1g"1)和泰山21(籽粒LOX活性79.8A234HiirT1g-1)兩種小麥的LOX活性最高，均為75A234Hiin^1g"1以上。二、Xwmc312/Xgwm251復合分子標記用于檢測小麥脂肪氧化酶活性性狀的有效性驗證Xwmc312序列表中序列1和序列2所示的核苷酸組成的引物對；Xgwm251序列表中序列3和序列4所示的核苷酸組成的引物對。·歹[J15'—ccgacgcaggtgagcgaag-3'；序歹Ij2:5，-tgtgcccgctggtgcgaag-3，；序列3:5，-caactggttgctacacaagca_3，；序歹Ij4:5，-gggatgtctgttccatcttag_3，。提取各個小麥品種的籽粒的基因組DNA作為模板，分別用Xwmc312和Xgwm251對18份小麥品種進行單標記的PCR擴增。聚丙烯酰胺凝膠電泳分別檢測PCR產物。提取各個小麥品種的籽粒的基因組DNA作為模板，同時用Xwmc312和Xgwm251對18份小麥品種進行復合標記的多重PCR擴增。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物。PCR擴增的反應體系均為20μ1總體積中包含1XPCR緩沖液(50mmol·L^1KCl,IOmmol.L-1Tris·HC1，0.01%明膠)、MgCl21.5mM、dNTP(A/T/C/G)各250μΜ、TaqDNA聚合酶1U、每條引物4pmol、模板DNA80ng。PCR擴增的反應條件均為首先94°C變性5min；然后94°C變性lmin，55°C退火55sec，72°C延伸lmin，共40個循環；最后72°C延伸lOmin。電泳檢測的方法均為電泳緩沖液為pH8.O的IXTBE；制膠用6%聚丙烯酰胺膠儲存液(尿素420.2g，丙稀酰胺60.Og,N，N-甲叉雙丙烯酰胺3.16g，IOXTBE50ml,定容至1000ml)60ml，10%過硫酸銨(APS)300μ1，TEMED60μ1，混合均勻后灌膠，膠型為380mm/300mm/0.4mm；電泳程序為首先IOOW預電泳30min，插60孔加樣梳，點樣后80W電泳60mino電泳結束后進行銀染程序(1)脫色與固定將膠板放入10%冰醋酸中輕搖30min；(2)漂洗用蒸餾水漂洗3次，每次3min;(3)銀染IL1%的AgNO3溶液中加2ml37%的甲醛，放入膠板輕搖30min；(4)蒸餾水漂洗約20sec；(5)顯影在預冷的IL30%的Na2CO3溶液中加2ml甲醛和200μ1NaS2O3溶液，放入膠板輕搖直到目標片段顯示出來；(6)終止迅速將膠板轉入10%冰醋酸溶液中，終止顯色反應；(7)用蒸餾水飄洗2min;(8)將膠板自然干燥后，記錄帶型并用數碼相機照相。分別用XwmC312和Xgwm251進行PCR擴增的擴增產物的電泳圖疊加后，與同時用Xwmc312和Xgwm251進行PCR擴增的擴增產物的電泳圖完全一致。表明用Xwmc312/Xgwm251引物組合，通過多重PCR的方式檢測小麥品種LOX活性的結果與單標記檢測的結果是一致的，由于多重PCR具有簡單、快捷，經濟、高效的優點，在育種實踐中加以應用將能提高選擇的效率。同時用Xwmc312和Xgwm251進行PCR擴增的擴增產物電泳圖見圖2。圖2中，M為DNAladderpUC18，1為衡7228，2為藁城8901，3為泰山269，4為周892，5為觀35，6為石新733，8為京9428，9為CA0431，10為泰山21，11為良星66，12為濟麥21，13為周麥11，14為藁城9411，16為臨麥2號，17為石6365，18為CA0477。回收各個特異條帶，進行測序，測序結果表明，具有相同堿基個數的DNA片段同樣具有相同的核苷酸序列。根據組成DNA片段的堿基個數，分別將各個條帶命名為Xwmc312_227、Xwmc312_235>Xwmc312_247、Xgwm251_113、Xgwm251_117禾口Xgwm251_125。Xwmc312_235的核苷酸序列如序列表中序列5所示，Xgwm251117的核苷酸序列如序列表中序列6所示。同時用Xwmc312和Xgwm251進行PCR擴增的擴增產物電泳共出現了9種帶型Xwmc312_235/Xgwm251_117,Xwmc312_247/Xgwm251_117,Xwmc312_235/Xgwm251_113,Xwmc312_227/Xgwm251_117,Xwmc312_235/Xgwm251_125,Xwmc312_247/Xgwm251_113,Xwmc312_247/Xgwm251_125,Xwmc312_227/Xgwm251_113禾口Xwmc312_227/Xgwm251_125；其中Xwmc312_227、Xwmc312_235禾口Xwmc312_247是以Xwmc312(序列1和序列2)進行擴增的特異性條帶；而Xgwm251113、Xgwm251117和Xgwm251125是以Xgwm251(序列3和序列4)進行擴增的特異性條帶。以CA0431和泰山21的基因組DNA為模板的PCR擴增產物均為帶型Xwmc312_235/Xgwm251_117。LOX活性和電泳結果聯合分析，CA0431和泰山21這兩種小麥的LOX活性明顯高于其它小麥品種，PCR擴增產物均為帶型XWmc312_235/XgWm251_117，從而證明帶型為Xwmc312_235/Xgwm25L117的小麥品種LOX活性高。權利要求輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，同時用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；如果沒有得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有低籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；所述高籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為75A234min-1g-1以上；所述低籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為70A234min-1g-1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。2.輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，分別用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果用引物對甲得到235bp的DNA片段且用引物對乙得到117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；如果用引物對甲沒有得到235bp的DNA片段且用引物對乙沒有得到117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有低籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；所述高籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為75A234HiirT1g-1以上；所述低籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為70A234HiirT1g-1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。3.鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，同時用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為75A234HiirT1g-1以上；如果沒有得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為70A234HiirT1g-1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。4.鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，分別用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增；如果用引物對甲得到235bp的DNA片段且用引物對乙得到117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為75A234rnirT1以上；如果用引物對甲沒有得到235bp的DNA片段且用引物對乙沒有得到117bp的DNA片段，待測小麥的脂肪氧化酶活性為70A234HiirT1g-1以下；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述待測小麥為CA0431小麥或泰山21小麥；所述脂肪氧化酶活性體現為每克小麥粉每分鐘催化亞油酸生成共軛二烯的能力，以234nm下共軛二烯吸光度的增加值計量。6.引物組合物，由引物對甲和引物對乙組成；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。7.引物對甲和/或引物對乙在制備如下㈧或⑶所述試劑盒中的應用(A)輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的試劑盒；(B)鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的試劑盒；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。8.輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的試劑盒或鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀的試劑盒，由引物對甲和/或引物對乙組成；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。9.引物對甲和/或引物對乙在輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥或鑒定小麥的籽粒脂肪氧化酶活性性狀中的應用；所述引物對甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述引物對乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對。10.序列表的序列5或序列表的序列6所示的DNA片段。全文摘要本發明公開了一種輔助鑒定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀小麥的方法及其專用引物。方法步驟如下以待測小麥的基因組DNA為模板，同時用引物對甲和引物對乙進行PCR擴增，如得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待測小麥為候選的具有高籽粒脂肪氧化酶活性性狀的小麥；高籽粒脂肪氧化酶活性性狀為籽粒的脂肪氧化酶活性為75A234min-1g-1以上；引物對甲是序列表的序列1和序列2所示DNA組成的引物對；引物對乙是序列表的序列3和序列4所示DNA組成的引物對。本發明的方法簡單易行、穩定可靠，可對小麥脂肪氧化酶基因LOX進行分子標記輔助選擇，培育出脂肪氧化酶活性高的優良小麥品種，還可檢測小麥中脂肪氧化酶的活性。本發明的方法及其專用引物將在小麥脂肪氧化酶活性性狀檢測和小麥育種中發揮重要作用。文檔編號C12N15/11GK101812519SQ20101012805公開日2010年8月25日申請日期2010年3月17日優先權日2010年3月17日發明者何中虎,夏先春,耿洪偉申請人:中國農業科學院作物科學研究所