逆境耐受性的制作方法

專利名稱：：逆境耐受性的制作方法
技術領域：
：本發明涉及鑒定和獲得能夠在植物中改變逆境耐受性，特別是耐寒性的方法。本發明也涉及這樣獲得的分離的核酸。本發明此外涉及獲得具有改變的逆境耐受性的植物以及通過本發明的方法獲得的植物。本發明還涉及具有改變的對寒冷逆境的耐受性的酵母菌株。背景環境逆境狀況，例如太陽能、水或養分的短缺或過量、高鹽度和污染(例如重金屬污染)，可以對植物生長具有重要影響，并可以顯著地降低植物產量。滲透逆境_一種類型的環境逆境-可通過過量的鹽度、干旱、過熱、寒冷或凍結的狀況而誘導。寒冷逆境可通過低于允許特定植物物種最適宜生長的范圍的溫度誘導。各植物物種或品種具有生長速率最大的最適生長溫度。越遠離此最適生長溫度，對植物的逆境越大。許多植物物種，特別是來自熱帶或亞熱帶的植物物種，對寒冷很敏感。例如，已經估計如果全世界的平均溫度下降僅僅在0.5到1.0°C之間，全世界的水稻產量將減少40%(Salisbury禾口Ross，PlantPhysiology.4thed.WadsworthPublishingCompany，Belmont，CA，1992)。然而來自溫帶的植物在經歷適應低的但不凍結的溫度的過程后，具有使它們的新陳代謝適應并于凍結溫度存活的能力，該過程稱為寒冷順應。例如非順應黑麥一般無法存活于低于_5°C的溫度，但在寒冷順應之后，它可以經受低到_30°C的溫度。寒冷順應的過程涉及許多基因表達的改變。植物的經受寒冷的能力可能不同，這可導致周期性的但是并非顯著的植物生產力的損失。因此，通過評估低于任意給定植物的通常生長溫度的溫度的風險而確定農作物或園藝植物可以種植的區域。在寒冷順應期間最顯著的變化包括生長的縮減或停止、組織水含量的減少(Levitt；ResponsesofPlantstoEnvironmentalStresses,Vol.1.2ndedn.AcademicPress.NewYork,NY1980)，短暫的脫落酸(ABA)水平的增加(Chen等，PlantPhysiology71,362-365，1983)，膜脂組成的改變(Lynch和Steponkus,PlantPhysiology83，761-767，1987；Uemura和Steponkus，PlantPhysiology104,479-496,1994)，諸如脯氨酸、甜菜堿、多元醇和可溶性糖等相容滲透物的聚積以及抗氧化劑水平的增高(Koster和Lynch,PlantPhysiology98,108-113,1992；Kishitani等，Plant,CellandEnvironment17,89-95,1994；Murelliφ,PhysiologiaPlantarum94,87-931995；Nomura等，Euphytica83，247-250，1995;D0rffling等，PlantMolecularBiology23,221-225,1997；Tao等，Cryobiology37，38-45，1998)。已知鑒定和分離在寒冷逆境期間差異表達的基因或蛋白的多種方法。例如，作圖技術可以確定涉及寒冷耐受性的基因的染色體位點(Pan等，TheoreticalandAppliedGenetics89,900-910,1994；Galiba等，TheoreticalandAppliedGenetics90,1174-1179，1995)。另一種方法涉及突變分析，其中分離并表征具有改變的耐寒性反應的突變體。例如，eskimol，賦予順應的野生型植物提高的2°C冷凍耐受性，是從篩查了組成型冷凍耐受突變體的800000個乙基甲基磺酸酯(EMS)誘變的鼠耳芥屬株系的集合中分離出來的(Xin和Browse，PNAS95，7799-7804，1998)。相反，篩查了植物株系中在寒冷順應方面有缺陷的突變體(Warren等人，PlantPhysiology111，1011-1019，1996；Knight等，PlantCell8，489-503，1996)。采用誘變和報告基因活化的組合分離了cos-、Ios-和hos-突變體(分別為組成性、低和高表達滲透反應性基因)(Ishitani等，PlantCell9，1935-1949，1997;Ishitani等，PlantCell10，1151-1161，1998;Lee等，PlantJournal17，301-308，1999)。作圖和突變分析策略的一個缺點是它們并非直接導致編碼寒冷誘導基因的核酸的分離。另一種策略采用cDNA文庫的差異篩選和相關技術，在過去已經從不同的植物物種產生了若干寒冷誘導基因(綜述，Xin和Browse，Plant，Cellandenvironment23，893-902，2000)。許多這些基因具有已知的功能并可以分組為涉及干旱逆境、信號傳導通路、或與熱休克蛋白、分子伴侶、“抗冷凍蛋白”或調控蛋白相關。一些基因在寒冷逆境期間高度表達，通常稱為COR(COld調控)基因(Tomashow，AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology50，571-599，1999)。用于設計改造耐寒植物的策略包括諸如甘露醇(US6，416，985)、脯氨酸(US6，239，332)、海藻糖(US6，323，001)或甘氨酸-甜菜堿(Hayashi等，PlantJournal12，133-142，1997;US6，281，411)等滲透保護物質的聚積。其它的方法涉及對控制逆境反應的信號傳導通路的操作(W001/77355)，包括轉錄因子的應用(W001/77311，US6，417，428，WO02/44389，US5，891，859)。另外已經采用多種基因提高耐寒性。例子為COR組的成員(C0R15a:US5，296，462，US5,356，816)、細胞周期相關基因(W001/77354)、蛋白激酶相關蛋白(W001/77356)、LEA樣蛋白CAP85(US5，837，545)以及磷脂結合蛋白(W002/00697)的應用。然而植物中導致寒冷順應的信號傳導通路以及賦予對寒冷逆境抗性的基因的身份仍然在很大程度上不為人知。酵母已經被用來篩選賦予對鹽逆境抗性的植物基因。例如，鹽敏感的酵母菌株(JM26)先前已經用來自鹽逆境的甜菜的cDNA文庫轉化，并用于篩選具有提高的耐鹽性的克隆(W002/52012)。該轉化酵母細胞豐富培養基(YPD)上或在加入甲硫氨酸和亮氨酸的合成培養基(SD)上生長，補充了0.15MNaCl或20mMLiCl。與非轉化酵母菌株相比，在選擇培養基上顯示出更好生長的推定的陽性克隆被分離并作進一步表征。然而，以前沒有用過利用酵母來鑒定涉及寒冷逆境的植物基因。JesusFerreira等最近在單倍體酵母中的研究(2001)采用轉座子誘變鑒定了10個不同的對耐寒性有反應的酵母基因，其突變導致生長在15°C停止。所鑒定的基因包括編碼谷氨酸合酶(YDL171C)、GTP結合蛋白(YML121W)、GSK-3Ser/Thr蛋白激酶(YNL307C)以及TFIID組分(YLR399C)的基因。先前描述了其中3個基因對寒冷有反應(YLR399C，YML121W，YNL307C)，且其中4個分離的基因還涉及對鹽逆境的抗性。發明概述本發明提供了一種在植物中篩選涉及逆境反應的核酸的新方法，該方法涉及在二倍體酵母中篩選涉及改變對溫度逆境的耐受性/抗性的植物基因。本發明也提供了通過該篩選鑒定的新的植物基因和這些基因編碼的多肽。也提供了生產具有改變的對環境逆境狀況的耐受性或抗性的植物的方法，包括將上述的基因引入植物。也提供了對環境逆境狀況具有改變的耐受性或抗性的植物，該植物用本發明的基因轉化。發明詳述根據本發明的第一個具體實施方式，提供了一種鑒定能夠在植物或酵母中改變對寒冷逆境狀態的耐受性或抗性的核酸的篩選方法，該方法包括下列步驟(i)提供來自生物體的編碼序列的cDNA文庫；(ii)將這些編碼序列以可表達的形式引入野生型酵母細胞中；(iii)使(ii)的酵母細胞在寒冷逆境的條件下生長；(iv)識別轉基因的酵母細胞和野生型酵母細胞之間的差異，優選識別生長速率的差異；(ν)從與野生型酵母細胞不同的轉基因的酵母細胞分離核酸。野生型酵母細胞優選為野生型二倍體釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)酵母細胞，更優選野生型釀酒酵母W303酵母細胞。此外優選生物體是植物，該植物優選是鹽處理的植物，更優選鹽處理的鹽生植物或其一部分，最優選鹽處理的甜菜(Betavulgaris)或其一部分。利用酵母細胞鑒定涉及鹽或滲透逆境的基因在現有技術中是已知的。酵母是一種檢測賦予對滲透壓或鹽逆境的耐受性的基因的良好模型生物體，因為已知允許互補的合適的突變體。WO02/052012教導了一種篩選方法，其中用分離自鹽逆境甜菜的CDNA轉化突變的對鹽敏感的酵母菌株。該方法導致鑒定了可以有助于提高植物對鹽、干旱或滲透逆境的耐受性的基因。這里，第一次把酵母用于涉及寒冷逆境應用的植物cDNA文庫篩選。與WO02/052012中導致鹽敏感的突變由引入的植物cDNA互補相反，本發明中采用野生型酵母代替突變體；野生型酵母是二倍體，以避免會最終導致酵母宿主的耐寒性的隱性染色體突變的任何效應。本發明表明，由于沒有適宜的冷敏感突變體存在，用來自鹽逆境的植物的cDNA轉化的野生型酵母細胞可用于分離能夠賦予植物對寒冷逆境的耐受性的基因。術語〃耐受性〃和〃抗性〃這里可以互換使用。篩選方法的第一步涉及提供來自任何生物體的編碼序列的cDNA文庫，例如植物動物或真菌。根據本發明的優選特征，該cDNA文庫由植物制成，優選是鹽處理的植物，更優選鹽處理的鹽生植物或其一部分，更優選鹽處理的甜菜植物或其一部分，最優選鹽處理的甜菜植物的葉子。甜菜(sugarbeet,Betavulgaris)，一種相對鹽生的農作物，提供了耐寒性基因的潛在良好來源。盡管本發明通過利用甜菜cDNA文庫進行舉例說明，應當理解其它的鹽生植物可以同樣地為該目的服務。cDNA文庫的制備是現有技術中已知的常規技術，cDNA文庫優選包括該植物細胞的基本上全部mRNA的拷貝。有利的是，單單編碼序列就足夠。篩選方法的第二步涉及將編碼序列引入酵母細胞。酵母轉化方法，例如電穿孔或用醋酸鋰處理，以及在酵母中包括PYES等酵母載體中表達基因的方法是現有技術中已知的(例如參見CurrentProtocolsinMolecularBiology,Unit13(Ausubel等，1994)以及GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology(Guthrie和Fink，1991))。為了檢測對逆境條件的耐受性或抗性的目的，可以方便地采用一些已知方法的任意一種將編碼序列引入酵母細胞并在其中表達。根據本發明的一個優選特征，采用了一種基于λ噬菌體的載體，更優選用λPG15在酵母中引入和表達編碼序列。噬菌體λPG15包括可切除的表達質粒PYPGE15，其可以直接用于大腸桿菌和酵母互補(Brunelli和Pall，Yeast9，1309-1318，1993)。質粒cDNA文庫可以采用cre-lox重組酶系統從APG15中回收(Brunelli和Pall，Yeast9，1309-1318，1993)。酵母細胞優選為釀酒酵母，更優選為二倍體野生型株系W303，以及它的甘油磷酸脫氫酶缺陷的二倍體突變株(gpdl)。酵母株系W303具有MATa/MATa、ADE2/ade2、CANl/canl-100、CYH2/cyh2、his3_ll，15/his3_ll，15、LEUl/leul-c、LEU2/leu2-3,112、trpl-1:URA3:trpl_3'D/trpl-1、ura3-l/ura3-l基因型，并源自親本株系W303-1A和W303-lB(Primig等，Nat.Genet.26，415-423，2000)。W303gpdl突變株出乎意料地比W303野生型株系更加耐寒(參見圖1)。為了這一原因，在篩選中采用野生型株系，而gpdl突變株作為對比的標準。因此預期賦予耐寒性的核酸將提高野生型酵母細胞的生長至與gpdl突變株相當或更好的水平。有利的是，gpdl基因能夠用于提高酵母的耐寒性，例如面包酵母。已知酵母對寒冷逆境敏感。冷凍逆境特別對酵母作為酵素的質量具有負面影響。已經突變或改造使甘油磷酸脫氫酶(gpdl)基因滅活(使用本領域已知的技術)的酵母細胞驚人地比野生型酵母對寒冷和/或冷凍逆境更為耐受。這個特性可對例如烘焙或釀造工業有益。因而本發明也提供了一種提高酵母細胞的耐寒性的方法，包括在酵母中下調編碼甘油磷酸脫氫酶的核酸的表達和/或抑制甘油磷酸脫氫酶的活性。而且本發明通過下調其表達而提供了gpdl基因在改變酵母的逆境耐受性中的應用。這樣獲得的逆境耐受酵母細胞可以以純化形式(例如酵素)或以組合物(例如生面團)應用。該篩選的第三步涉及使酵母細胞在逆境條件下生長。將用鹽逆境甜菜的cDNA轉化的酵母細胞鋪于適宜的培養基上并在寒冷逆境下生長。選擇10°c的溫度，因為這個溫度仍然允許酵母菌株的最低限度生長，但所屬領域的技術人員可以選擇低于最適生長溫度的任何其它溫度。在特定一段時間后，選擇能在這些寒冷條件下生長的菌落，通過將該轉基因細胞再次在寒冷逆境條件下生長而重復測試它們的耐寒性。有利的是，來自鹽處理植物的cDNA也可以是尋找能賦予針對其它逆境的耐受性的基因的適宜基礎。這可以簡單地通過將在上述步驟(iii)中的酵母細胞在由尋找的基因類型確定的逆境條件下生長而實現。例如，為了鑒定賦予對熱逆境的耐受性的基因，使該酵母細胞在熱條件下生長。根據本發明的優選特征，逆境優選是寒冷逆境。然后確定是否逆境耐受性來源于該轉基因，而不是源自宿主基因組的突變。為此，從轉基因的耐寒酵母克隆去除包括該轉基因的質粒，并驗證耐寒性是否也隨之消失；第二，從轉基因耐寒酵母克隆中分離包括該轉基因的質粒，并再引入非轉基因的酵母菌株，然后將新轉化的酵母菌株的耐寒性與非轉化的酵母菌株對比。該篩選方法的第四步是識別生長快的酵母細胞。基于它們在逆境狀態下比未用這樣的核酸轉化的酵母細胞生長更快的能力識別用賦予逆境抗性的植物核酸轉化的酵母細胞，但是也可以用其它的選擇標準，這取決于施加的逆境的類型。最后，在篩選方法的最后步驟中，從酵母宿主中分離賦予逆境耐受性的核酸并進行表征。從酵母中分離核酸和對這些核酸測序的方法對本領域技術人員是已知的。本發明也包括上述的篩選方法用于鑒定編碼能夠賦予植物細胞或酵母細胞寒冷逆境耐受性的蛋白質的核酸的應用。如上所述的篩選方法獲得了若干編碼提高酵母菌株的寒冷逆境耐受性的蛋白質的核酸，這里命名為CRYO基因和CRYO蛋白。這些核酸編碼的蛋白質全部與液泡或質膜的小泡運輸有關。對逆境的反應需要新陳代謝的適應，包括蛋白及其他組分在不同的細胞器之間，特別在高爾基氏體和液泡之間，但也在質膜和液泡之間的運輸。植物液泡執行不同的功能，取決于它們所在的細胞類型。它們在細胞生長或功能中扮演重要角色，作為蛋白質、離子、次級代謝產物和新陳代謝的廢物的存儲細胞器。在這最后一方面，液泡也類似于溶酶體。它們含有降解損壞的或多余的細胞材料的水解酶。對環境條件變化或對逆境的適應不僅涉及新的細胞組分的合成而且涉及細胞材料的降解。這些降解過程需要經由內體等膜結合小泡廣泛運輸材料，同樣水解酶也經由內體傳遞給液泡。CRY04(SEQIDNO8)是與Atlg72160具同源性的蛋白，后者是鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)中的胞質因子；且其另外與酵母SEC14(=YMR079W)具有顯著的同源性。該酵母蛋白是一種胞質磷脂酰肌醇/磷脂酰膽堿轉運蛋白，對于從高爾基復合體轉運分泌蛋白和蛋白分泌是需要的(Bankaitis等，(1990)Nature347，561-562)。在酵母中，它作為外周膜蛋白與高爾基復合體相關，在磷脂代謝和小泡運輸之間形成聯系(Li等，(2000)Mol.Biol.Cell11，1989-2005)。在體外它催化磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿在膜之間轉運，對生存和分泌是必需的(Tschopp等，(1984)J.Bacteriol160，966-970)。CRY05(SEQIDNO10)是一種有RING結構域的蛋白質。RING-結構域蛋白已知涉及諸如轉錄和翻譯調控的生物過程和靶向的蛋白水解。RING結構域介導蛋白質-蛋白質相互作用，是一種40到60個氨基酸長度的C3HC4型鋅指結構域。多種有RING指結構域的蛋白顯示與E2遍在蛋白-綴合酶結合(Ubc's)結合(Freemont(2000)CurrBiol.10，R84-87)。上述結構域Zf-RING指與在酵母CLASSE液泡分選蛋白質VPS27中發現的不同。然而，可能有一些保守功能，因為VPS27也與遍在蛋白化過程和蛋白質轉換相關聯，存在于CRI05中的Zf-RING指結構域通常發現于也涉及遍在蛋白化和蛋白酶體蛋白質降解的蛋白中。本發明的其它蛋白屬于E類液泡運輸突變體組。酵母中的某些突變體已知為‘類，，突變體(Jones等，In:YeastIII，ColdSpringHarborLaboratoryPress，p363_470，1997)，不能將蛋白正確分選到液泡。顯微分析揭示這些突變株含有大的異常內體結構(Raymond等，MolecularBiologyoftheCell3，1389，1992)，其中充滿了正常轉運到液泡的蛋白。CRY01、CRY02和CRY03都具有SNF7結構域(PfamPF03357/IPR005024；Pfam數據庫，Bateman等，(2004)NucleicAcidsResearchDatabaseIssue32，D138—D141)。這3種蛋白在結構上屬于CHMP蛋白家族(Howard等，(2001)J.CellSci.114，2395-2404)。CRY01(SEQIDNO2)和CRY02(SEQIDNO4)彼此是同種型。CRYOl和它的植物同源物尚未進行功能表征，但它們與酵母SNF7(=DIDl=VPS32=YLR025W)相關。SNF7突變體屬于E類液泡運輸突變體組(Jones等，In=YeastIII，ColdSpringHarborLaboratoryPress,p363-470,1997)。SNF7突變體聚積了與液泡截然不同的顯著細胞器，含有大量通常存在于液泡中的酶，例如水解酶CpY，PrA&PrB。該蛋白涉及對葡萄糖限制反應的SUC2的去阻抑。SNF7突變體表現出轉化酶去阻抑的降低，蜜三糖的生長缺陷，對葡萄糖的溫度敏感生長，以及純合子二倍體的孢子形成缺陷。SNF7糖相關表型可以是由于改變的葡萄糖傳感器的轉換。這些和其它數據表明從高爾基復合體和從質膜向液泡的蛋白轉運受到了干擾。SNF7與vps20和moslO形成了卷曲螺旋形成蛋白家族。所述蛋白涉及同一運輸步驟，內體到液泡的運輸，但可能參與不同的運輸物特異性事件(Kranz等，2001)。SEQIDNO6(CRY03)是酵母DID2(=FTll=YKR035W-A)的植物同源物，另一E類液泡運輸蛋白的成員。DID2與SNF7相關；它具有類似的結構特征，它可以具有相當的功能，可能屬于酵母中同樣的蛋白復合物(Amerik等，MolecularBiologyoftheCell，11，3365-3380,2000)。有報道說人的直向同源物CHMPl涉及膜運輸并定位于早期內體(Howard等，2001)。CHMPl也定位于核基質，因此影響染色質結構和細胞周期進程，并進一步與PcG蛋白Polycomblike(Pcl)相互作用(Stauffer等，2001JCellSci.114，2383—93)。除了改變對寒冷逆境的耐受性，這些蛋白還可涉及蛋白轉運和分選(CRY01[SEQIDNO1/2]、CRY02[SEQIDNO3/4]、CRY03[SEQIDNO5/6]和CRY04[SEQIDNO7/8])、液泡形成、發育或機能(CRY01，CRY02，CRY03)、涉及轉錄和翻譯(CRY03，CRY05)、涉及膜流動性(CRY04)和蛋白質轉換(CRY05)。由本發明的篩選方法鑒定的核酸編碼的蛋白迄今為止是未知的，因此，本發明也提供了分離的CRYO蛋白，(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有具有至少下列序列同一性的序列i.與SEQIDNO2給出的全長序列具有76%，或80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；ii.與SEQIDNO4給出的全長序列具有55%或60%、70%、80%，優選90%更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；iii.與SEQIDNO6給出的全長序列具有90.5%或90.6%、90.7%、90.8%、90.9%，優選91%、92%、93%、94%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；iv.與SEQIDNO8給出的全長序列具有50%，或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；v.與SEQIDNO10給出的全長序列具有50%或60%、70%、80%優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；本發明的CRYO基因是編碼上面定義的CRYO蛋白的任意核酸。蛋白的“同源物”包括相對于未修飾的目的蛋白具有氨基酸置換、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，且具有與它們衍生自的未修飾蛋白類似的生物學和功能活性。為生產這種同源物，蛋白質的氨基酸可以被其他具有類似性質(例如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破α-螺旋結構或β-折疊結構的傾向性)的氨基酸替換。現有技術中熟知保守置換表(例如參見Creighton(1984)Proteins，W.H.FreemanandCompany)。對于CRY04或CRY05，可用于本發明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少50%序列同一性或相似性(功能同一性)，或與未修飾蛋白具有至少60%序列同一性或相似性，或與未修飾蛋白具有至少70%序列同一性或相似性。通常CRY04或CRY05的同源物與未修飾蛋白具有至少80%序列同一性或相似性，優選至少85%序列同一性或相似性，進一步優選至少90%序列同一性或相似性，最優選與未修飾蛋白具有至少95%序列同一性或相似性。對CRY02，可用于本發明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少55%序列同一性或相似性(功能同一性)，或與未修飾蛋白具有至少60%序列同一性或相似性，或與未修飾蛋白具有至少70%序列同一性或相似性。通常CRY02的同源物與未修飾蛋白具有至少80%序列同一性或相似性，優選至少85%序列同一性或相似性，進一步優選至少90%序列同一性或相似性，最優選與未修飾蛋白具有至少95%序列同一性或相似性。對CRY01，可用于本發明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少76%序列同一性或相似性(功能同一性)，通常CRYOl的同源物與未修飾蛋白具有至少80%序列同一性或相似性，優選至少85%序列同一性或相似性，進一步優選至少90%序列同一性或相似性，最優選與未修飾蛋白具有至少95%序列同一性或相似性。對CRY03，可用于本發明的方法的同源物與未修飾蛋白具有至少90.5%序列同一性或相似性(功能同一性)，通常CRY03的同源物與未修飾蛋白具有至少91%序列同一性或相似性，優選至少92%序列同一性或相似性，進一步優選至少93%序列同一性或相似性，最優選與未修飾蛋白具有至少95%序列同一性或相似性。而且本發明的CRYO蛋白的同源物能夠在上述的測定中增加酵母的寒冷逆境耐受性。兩種特殊形式的同源-直向同源(orthologous)和共生同源(paralogous)是用來描述基因的祖先遺傳關系的進化概念。術語“共生同源”涉及物種的基因組內的基因重復復制，導致共生同源基因。術語“直向同源”涉及由祖先遺傳關系所致在不同生物體中的同源基因。這里采用的術語“同源物”也包括了可用于本發明方法的蛋白的共生同源物和直向同源物。其它植物物種中的直向同源物可以通過進行所謂的交互blast搜索而找到。這可以通過涉及用感興趣的序列(SEQIDNO1到10的任意一個)對任意的序列數據庫的第一輪blast進行，例如公眾可獲得的NCBI數據庫，可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov找至IJ。如果搜尋在水稻中的直向同源物，將目標序列對例如在NCBI中可獲得的OryzasativaNipponbare28，469全長cDNA克隆進行blast。當從核苷酸開始時可以采用BLASTn，當從蛋白開始時，可以采用TBLASTX，采用標準的缺省值。blast結果可以進行過濾。過濾結果或未過濾結果的全長序列再與目標序列進行反向blast(第二次blast)。然后對比第一次和第二次blast的結果。真正的直向同源物為那些與查詢序列再次匹配的序列。在大家族的情形下，采用ClustalW和鄰近結合方法構建種系發生樹狀結構，以有助于顯示分類。同源蛋白可以被分組為“蛋白家族”，一個蛋白家族可通過功能和序列相似性分析而定義，例如ClustalW。ClustalW程序可以產生感興趣蛋白的同源性蛋白的鄰近關系樹并給出了它們的結構和遺傳關系的良好的概括。CRY01、CRY02或CRY3蛋白含有SNF7結構域且可以認為是與人CHMPl和酵母SNF7同樣的蛋白家族的成員。SNF7結構域(PfamPF03357)發生于真核細胞中涉及蛋白分選和從內體到液泡/溶酶體轉運的一組蛋白質。在Interpro數據庫中，SNF7家族描述為真核蛋白的一個家族，其被不同地描述為假設蛋白、發育蛋白或與酵母SNF7相關。該家族含有人CHMP1。CHMPl(染色質修飾蛋白(CHromatinModifyingProtein)；帶電荷多泡體蛋白(CHargedMultivesicularbodyProtein))由PRSMl基因的可變(alternative)可讀框編碼，在復雜和簡單真核生物中都是保守的。CHMPl含有預測的雙向核定位信號，以獨特的形式分布于所有檢測的細胞系的細胞質和細胞核基質中。人CHMPl強烈參與多泡體形成。多泡體是充滿小泡的內體，將蛋白靶向到溶酶體內。免疫細胞化學和生物化學分級分離將CHMPl定位至早期內體，且CHMPl與SKD1/VPS4發生物理相互作用，后者是一種高度保守的直接與在酵母中多泡體分選關聯的蛋白。與突變SKDl蛋白的作用類似，人CHMPl融合衍生物的過表達擴張了內體區室，并破壞了一些內體標記的正常分布。在釀酒酵母中的遺傳研究進一步支持CHMPl在小泡運輸中的保守作用。刪除CHMPl的出芽酵母同源物CHMl，導致羧肽酶S和Y分選缺陷，且產生異常的、多層片的小泡前區室。該表型將CHMl分類為E類小泡蛋白分選基因的成員。在該CHMP家族中，可以發現其它的CHMP蛋白，例如酵母蛋白Chmlp、Chm2p、Vps24p、Chm5p和Chm6p，或人蛋白AF281064、AF042384、AF151842、AF19226、AF161483、AF132968和AW965590(Howard等，2001)。所有這些蛋白組成了具有類似的大小和電荷分布(堿性N末端和酸性C末端)和遍及完整蛋白序列的序列保守的結構相關蛋白家族(Howard等，2001)。該結構保守也表明了功能保守CHM基因產物涉及羧肽酶Y的正確分選，且可在如Howard等人(2001)所描述的脈沖追蹤試驗中測定。CRY04屬于與酵母SEC14同樣的家族。CRY04含有一個SMART數據庫定義的SEC14結構域(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letunic等(2004)NucleicAcidsRes32，D142-D144):SEC14結構域發現于釀酒酵母磷脂酰膽堿轉移蛋白(Secl4p)的同源物和RhoGAPs、RhoGEFs和RasGAP、神經纖維瘤蛋白(NFl)中。也有報道說它是一種脂結合結構域。Dbl的SEC14結構域已知與G蛋白β/γ亞單位結合。在Interpro數據庫中也描述了該結構域(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)(IPR001251)，其中含有該結構域的蛋白被分組為多種視黃醛/視網膜結合蛋白的家族，可以是動物中視覺周期的功能組分。細胞視黃醛-結合蛋白(CRALBP)攜帶11-順式視黃醇或11-順式-視黃醛作為內源性配體，并可以作為底物攜帶蛋白調節這些類維生素A與視覺循環酶的相互作用。多結構域蛋白Trio與LAR跨膜酪氨酸磷酸酶結合，含有一個蛋白激酶結構域，且具有單獨分開的rac-特異性和rho-特異性鳥嘌呤核苷交換因子結構域。Trio是一種多功能蛋白，整合和擴增涉及協同肌動蛋白重塑的信號，對細胞遷移和生長是必需的。該家族的其它成員為轉移蛋白，包括可以作為RACl效應器而發揮功能的鳥嘌呤核苷酸交換因子，從高爾基復合體轉運分泌蛋白所需的磷脂酰肌醇/磷脂酰膽堿轉移蛋白以及提高分離的膜之間的配體轉移的α維生素E轉移蛋白。可用于本發明的同源物包括SEC14結構域，且表現出脂質轉移活性(Jouannic等，Eur.J.Biochem.258,402-410(1998)描述了一種合適的測定分析)，包括例如鼠耳芥蛋白Atlg72160、At4g09160、Atlg22530、Atlg72150、At3g51670、Atlg30690、水稻蛋白BAB86220和AY107978編碼的玉米蛋白。CRY05在蛋白的羧基末端部分包括RING型鋅指結構域，另外還有一個跨越SEQIDNO10的氨基酸(AA)15到305的保守序列，對應于Pfam_B_23829結構域(該結構域推測與C3HC4型Zn-指結構域相結合)，以及從AA425到473的序列，對應于Pfam_B_2377。與該Pfam-B_2377結構域相應的CRY05序列含有在其它同源植物蛋白中也發現的保守氨基酸序列，且包括序列HDQHRDMRLDID匪SYEELLALEERIG，其中各種不同的同源物之間可以發生少于7處錯配。CRY05的植物同源物組成了一類新的蛋白(CRY05樣蛋白)，其特征在于在蛋白的N末端一半存在富含絲氨酸的區域，包括上述的保守序列特征(signature)的酸性區域以及RING指結構域。例示性同源物包括序列NP_196626、NP_974832、NP_568462.2禾口AK066069編碼的蛋白。屬于這些家族和/或含有一個或多個這些結構域的同源蛋白可以有利地用于本發明的方法中，以賦予植物細胞或酵母非生物逆境耐受性，特別是耐寒性。當最佳地對比時，如果兩個序列中的氨基酸殘基或核苷酸的序列分別是一樣的，兩個多肽或核酸被稱為是“同一的”。在兩個(或多個)多肽或核酸之間的序列對比通常通過在“對比窗口”中進行2個序列的對比來識別和對比局部區域的序列相似性。這里所采用的“對比窗口”指至少約20個連續位點的片段，通常為大約50到大約200，更通常為大約100到大約150，在將兩個序列最佳排列后，可以將序列與同樣數目的連續位點的參考序列進行對比。用于對比的序列的最佳排列可以通過Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2，482，1981)，Needleman和Wunsch的同源性對比算法(J.Mol.Biol.48443，1970)，Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Nat.Acad.Sci.85，2444，1988)，這些算法的計算機化實施方案(Wisconsin遺傳學軟件包中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA，GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.，Madison，WI)或通過觀察來進行。當采用Needleman-Wunsch算法時，采用10或11的缺口開放罰分，0.5或1的缺口延伸罰分，如果可能，將全長序列相互對比。術語“衍生物”指與SEQIDNO2、4、6、8或10所示的天然存在形式的蛋白的氨基酸相比，可以含有天然或非天然存在的氨基酸殘基的置換、缺失或添加的肽，寡肽，多肽，蛋白和酶。蛋白的“衍生物”包括其中氨基酸殘基被相應的天然或非天然改變的氨基酸置換的蛋白。蛋白的“衍生物”包括與天然存在形式多肽的氨基酸相比，可以含有天然存在的改變的(諸如糖基化、酰基化、肉豆蔻酰化或磷酸化的)或非天然存在的氨基酸殘基(例如生物素化氨基酸，或CNBr處理后改變的氨基酸)的肽、寡肽，多肽，蛋白和酶。蛋白的“衍生物”也包括攜帶翻譯后修飾的蛋白。與其來源的氨基酸相比，衍生物也可以包括一個或多個非氨基酸取代基，例如，與氨基酸共價或非共價結合的報道分子或其它配體，例如結合的促進其檢測的報道分子，以及相對于天然存在蛋白的氨基酸而言非天然存在的氨基酸殘基。蛋白質的“置換變異體”指那些氨基酸序列中至少一個殘基被去除且一個不同的殘基插入其位置的變異體。氨基酸置換通常為單個殘基，但可以根據位干多肽的功能限制而成簇；插入通常以大約1-10個氨基酸殘基的數量級，而缺失在大約1-20個殘基的范圍。氨基酸置換優選包括保守氨基酸置換。蛋白質的“插入變異體”為那些所述蛋白質的預先確定的位置引入了一個或多個氨基酸殘基的蛋白質。插入可以包括氨基末端和/或羧基末端的融合以及序列內單個或多個氨基酸的插入。通常在氨基酸序列內的插入比氨基_或羧基_末端融合小，為大約1到10個殘基的數量級。氨基-或羧基-末端融合蛋白或肽的例子包括在酵母雙雜交系統中采用的轉錄活化劑的結合結構域或活化結構域、噬菌體外殼蛋白，(組氨酸)6-標簽，谷胱甘肽S轉移酶標簽，蛋白A，麥芽糖結合蛋白，雙氫葉酸還原酶，標簽·100表位，c-myc表位，FLAG"表位，IacZ,CMP(鈣調蛋白結合肽)，HA表位，蛋白C表位和VSV表位。蛋白的“功能片段”或“缺失變異體”的特征在于從蛋白質中除去一個或多個氨基酸，而剩余的片段仍然保留了未修飾蛋白的生物活性，例如在實施例2和3中詳述的分析中賦予酵母對寒冷逆境的能力。這種蛋白的“功能片段”包括蛋白的至少15個連續的氨基酸殘基，對于功能片段最小的大小為提供該序列與被截短的原始序列至少可比的功能和/或活性的足夠長度的序列，而最大的大小不是關鍵。通常截短的氨基酸在大約5到大約60個氨基酸的長度。“免疫學活性”指分子或其特異性片段，如特異性表位或半抗原，其由抗體識別(即，結合)。可以采用Geysen等人描述的肽掃描技術(ChemBiol.3，679-688，1996)確定特異性表位。功能片段也可以包括含有對本發明的蛋白特異性的表位的那些片段。CRYO蛋白的衍生物、功能片段、置換、缺失或插入變異體優選具有與未修飾蛋白至少同樣或更好的功能活性，如增加酵母的耐寒性的能力。可以用例如上述的篩選方法或對相關蛋白描述的方法來檢測功能活性。蛋白的氨基酸變異體可以容易地用現有技術中已知的肽合成技術制成，例如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作。現有技術中熟知操作DNA序列來產生蛋白的置換、插入或缺失變異體的方法。例如，在DNA中預先確定的位點產生置換突變的技術為本領域技術人員熟知，包括M13誘變，T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland,OH)，QuickChange定點誘變(Stratagene,SanDiego,CA)，PCR-介導的定點誘變或其它定點誘變方案。本發明的另一實施方式提供了可通過本發明的篩選方法獲得的核酸，該核酸可以用于改變植物和/或酵母中的逆境耐受性或抗性。根據本發明的篩選方法鑒定了迄今未知的幾種核酸。因此本發明也提供了編碼上述蛋白的分離的核酸，其互補序列或一部分。術語“核酸”、“核苷酸序列”、“基因”、“多核苷酸”和“核酸分子”這里可互換使用，指以任意長度的多聚形式的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或兩者的組合。該術語也包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。也包括已知的核苷酸修飾例如甲基化、環化和“加帽”以及用諸如肌苷的類似物置換一個或多個天然存在的核苷酸。該術語也包括肽核酸(PNA)。本發明的核酸可以有利地用重組或合成方法制成，如PCR克隆機制。通常這里定義的這類技術在現有技術中是已知的，如Sambrook等人所描述的(MolecularCloning:aLaboratoryManual，2001)。也可以通過技術文獻中描述的已知技術合成多核苷酸，例如參BCaruthersφ,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.47,411-418(1982),L^l^Adams等，J.Am.Chem.Soc.105,661(1983)。然后可以通過合成互補鏈和在合適的條件下將鏈一起退火，或通過用合適的引物序列采用DNA聚合酶加入互補鏈，而獲得雙鏈DNA片段。編碼蛋白的核苷酸序列(基因、編碼序列、可讀框或0RF)是以可表達形式存在時(即當編碼序列或ORF位于合適的控制序列或調控序列的控制下時)可以轉錄為mRNA和/或翻譯為多肽的核苷酸序列。編碼序列或ORF由5'翻譯起始密碼子和3'翻譯終止密碼子為界。編碼序列或ORF可以包括但是并不限于RNA、mRNA、cDNA、重組核苷酸序列，合成制造的核苷酸序列或基因組DNA。編碼序列或ORF可以被間插核酸中斷。“可表達形式”表示分離的核酸分子為適于轉錄為mRNA和/或翻譯而產生蛋白的形式，無論組成性地或在細胞內或細胞外信號誘導之后，例如環境刺激或逆境(有絲分裂原、缺氧、低氧、溫度、鹽、光、脫水等)或化合物，如IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，或例如抗生素(四環素、氨芐西林、利福平、卡那霉素)、激素(例如赤霉素、植物激素、細胞分裂素、糖皮質激素、油菜素類固醇、乙烯、脫落酸等)，激素類似物(吲哚乙酸(IAA)，2，4-D等)、金屬(鋅、銅、鐵等)，或地塞米松等。如本領域技術人員所知的，功能蛋白的表達還可能需要一種或多種翻譯后修飾，例如糖基化、磷酸化、去磷酸化，或一種或多種蛋白-蛋白相互作用，等等。所有這些過程都包括在術語“可表達形式”的范圍內。基本上編碼同一蛋白但分離自不同來源的基因和編碼序列可以由實質上不同的核酸組成。相反地，實質上不同的核酸可以設計實現基本上相同蛋白的表達。這些核酸是例如給定基因的不同等位基因的存在或遺傳密碼子的簡并性或密碼子使用的差異的結果。優選密碼子使用的不同在http://www.kazusa.or.jp/codon中給予說明。等位基因變異體進一步定義為包括單核苷酸多態性(SNP)以及小插入/缺失多態性(INDEL，具有通常小于IOObp的大小)。在多數有機體的自然發生的多態種系中，SNP和INDEL組成了最大一組的序列變異體。另外或可選地，在特定常規育種程序中，例如在標志物輔助育種中，有時要求通過對植物進行誘變處理向植物中引入等位基因變異。一種合適的誘導突變的方法為EMS誘變。接著通過例如PCR的方法來鑒定等位基因變異體，之后為選擇步驟，來選擇討論序列的優異等位基因變異體，該變異體可以產生生長特性的改變。選擇通常通過監測含有目的序列的不同等位基因變異體(例如SEQIDNO1，3，5，7或9)的植物的生長性能來進行。監測生長表現可以在溫室或田野中進行。另外任選的步驟包括將其中識別了優異等位基因變異體的植物與另一植物雜交，這可以被用于例如將感興趣表型特征組合起來。根據本發明的另一方面，在育種程序中可以利用能夠調節編碼CRYO蛋白(例如SEQIDNO2，4，6，8或10)的核酸的表達的核苷酸序列。例如，在該程序中，識別一種DNA標志物，該標志物可以與能調節植物中感興趣蛋白(例如SEQIDNO2，4，6，8或10)的活性的基因(該基因可以為編碼感興趣蛋白的基因或其它能夠影響感興趣蛋白的活性的基因)遺傳連鎖。接著，該DNA標志物可用于育種程序來選擇具有改變的生長特性的植物。現在可利用許多技術識別SNP禾口/或INDEL0作為SEQIDNO1，3，5，7或9的任一個編碼的CRYO蛋白的核酸的可變剪接變異體的核酸也在本發明的范圍內。這里應用的術語“可變剪接變異體”包括編碼CRYO蛋白的核酸的變異體，其中任選地對特定信號起反應，選擇的內含子和/或外顯子被切除、替代或加入。現有技術中已知確定基因的基因組序列中的內含子和外顯子位置的方法。剪接變異體均源自一個同樣的前體-mRNA，剪接發生在基因轉錄后但在mRNA翻譯前，且通常以組織特異性或瞬時的方式調節(例如，使得mRNA具有組織特異性表達，例如參見Burge等，(1999).SplicingofprecursorstomRNAsbythespliceosomes.TheRNAWorldII,Gesteland,Cech禾口Atkins,eds.(ColdSpringHarbor,NY,ColdSpringHarborLaboratoryPress),pp.525-560)。優選的變異體為其中蛋白的生物活性保持不受影響的變異體，可以通過選擇性地保留蛋白的功能片段而實現。制造這種剪接變異體的方法在現有技術中是已知的，例如通過RNAi(Celotto和Graveley(2002)RNA8，718-724)，用核酶，通過在基因中弓I入突變，通過改變剪接體或改變信號轉導通路誘導可變剪接。本發明也包括能夠與編碼SEQIDNO2，4，6，8或10所示蛋白的核酸雜交的核酸。這里采用的術語“雜交”是實質上同源的互補核苷酸序列彼此相互退火的過程。雜交過程可以完全在溶液中進行，即，互補核酸都在溶液中。依賴于這一過程的分子生物學工具包括聚合酶鏈式反應(PCR；以及所有以此為基礎的方法)、差減雜交、隨機引物延伸、核酸酶Sl作圖、引物延伸、反轉錄、cDNA合成、RNA差異顯示、以及DNA序列確定。雜交過程的發生也可以其中一個互補核酸固定于基質例如磁珠、瓊脂糖凝膠珠或任何其它樹脂。依賴于這一過程的分子生物學工具包括分離多聚(A+)mRNA。此外，雜交過程的發生可以其中一個互補核酸固定于固體支持物，例如硝酸纖維素或尼龍膜，或者通過如光能無機照相固定于例如硅玻璃支持物(后者已知為核酸陣列或微陣列或核酸芯片)。依賴于這一過程的分子生物學工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交、噬菌斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了允許雜交的發生，核酸分子通常被加熱或用化學方法變性從而由雙鏈熔解為兩條單鏈和/或從單鏈核酸中去除發卡結構或其它二級結構。例如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成的條件影響著雜交的嚴格性。雜交的高度嚴格性條件包括高溫和/或低鹽濃度(包括NaCl和檸檬酸三鈉的鹽)和/或雜交緩沖液中甲酰胺的存在和/或降低雜交緩沖液中例如SDS(去污劑)的化合物的濃度和/或從雜交緩沖液中排除諸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇等化合物(提高分子擁擠度)。如Sambrook等人(2001)分子克隆實驗室手冊(3rdEditionColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH,NewYork)中描述了常規的雜交條件，但是熟練技術人員理解可以根據已知的或預期的核酸同源性和/或長度來設計多種不同的雜交條件。“嚴格雜交”的典型條件為例如在60°C雜交，然后在2XSSC，0.IXSDS以及IXSSC,0.IXSDS中洗滌。本發明的方法也可以有利地采用DNA或核酸的部分來實施，所述部分編碼保留了CRYO活性的多肽，即與編碼SEQIDNO:2、4、6、8或10所示的蛋白的核酸相似的生物學功能。DNA序列的部分指從原始(較大的)DNA分子來源或制備的DNA片段，當在植物中表達時，該DNA部分產生具有改變的生長特性的植物。該部分可以包括許多基因，含有或不含另外的調控元件，或可以只包括間隔序列等。術語“序列的一部分”表示所指的原始序列的截短序列。截短的核酸序列在長度上可以非常不同；最小的大小為提供與所指的原始序列至少相當的功能和/或活性的足夠大小的序列，而最大的大小并不關鍵。在一些應用中，最大的大小通常不比提供原始序列的期望活性和/或功能所需的大很多。通常，截短的核苷酸序列在大約15到大約180個核苷酸的長度范圍內。然而更有代表性的是，該序列的長度大約150個核苷酸為最大，優選最大為大約180個核苷酸。通常期望選擇至少大約30，36或45個核苷酸的序列，直至最大為大約60或75個核苷酸。本發明定義的DNA序列也可以被間插序列中斷，“間插序列”表示破壞打斷感興趣DNA序列中的編碼序列或破壞打斷含有感興趣DNA序列的DNA序列的表達形式的任意核酸。去除間插序列可恢復編碼序列或所述的表達形式。間插序列的例子包括內含子和可動DNA序列，例如轉座子。“可動DNA序列”表示可以作為重組事件的結果而移動的任意DNA序列。本發明也涉及包括本發明的核酸的重組遺傳構建體。遺傳構建體有助于將上述的核苷酸序列在植物細胞、組織或器官中引入和/或表達和/或維持。該遺傳構建體優選包括(i)分離的編碼植物蛋白的核酸，所述植物蛋白(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQIDNO2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50%或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任意一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(ii)與(i)的核酸可操作性地連接的調控元件，該調控元件為植物和/或酵母可表達啟動子；以及任選地(iii)轉錄終止序列。該核酸構建體可以為表達載體，其中核酸可操作性地與一個或多個允許在原核和/或真核宿主細胞中表達的調控序列連接。該載體可以購買得到，適合于轉化入植物并適合感興趣基因在轉化細胞中的表達。有利的是，任何可通過本發明的篩選方法獲得的核酸均可以用于該構建體；優選采用以上(a)到(d)的任一項定義的核酸。這里采用的術語“可操作性地連接”指在調控元件和感興趣基因之間的功能性連接，從而使調控元件能夠起始感興趣基因的轉錄。這里采用的術語“植物可表達啟動子”指能夠在植物細胞中驅動轉錄的啟動子。這不僅包括植物來源的任意啟動子，例如轉錄的DNA序列的天然啟動子，也包括能夠在植物中指導轉錄的非植物來源的任意啟動子。該啟動子也可以是人工或合成啟動子。術語“植物可表達啟動子”包括但不僅限于組成型、誘導型、器官_、組織_或細胞_特異性和/或發育調控的啟動子。術語“調控元件”、“調控序列”、“控制序列”和“啟動子”這里可互換使用，在廣義上下文的情形下，指能夠實現它們所連接的序列的表達的調控核酸。方便地，可以采用任意類型的啟動子驅動植物中編碼CRYO蛋白的核酸的表達。更具體地說，組成型啟動子可以是但并不僅限于以下之一35S啟動子(Odell等，Nature313,482-493，1985)，35S，3啟動子(Hull和Howell，Virology86，482-493，1987)，Ti質粒的胭脂氨酸合酶基因的啟動子(“PNOS”)(Herrera-Estrella,Nature303，209-213，1983)或章魚氨酸合酶基因的啟動子(“P0CS”，DeGreve等，J.Mol.Appl.Genet.1,499-511,1982)。很清楚可以采用其它的組成型啟動子獲得類似的效果。可以采用分生組織特異性啟動子，例如rnr(核糖核苷酸還原酶)、cdc2a啟動子和cyc07啟動子實現在植物所有生長部分中的表達，由此增加細胞增殖，從而提高產量或生物量。如果需要的結果為影響種子的特性，例如儲藏能力、種子大小、種子數目、生物量等，那么可以選擇種子特異性啟動子，例如p2S2、pPROLAMIN、pOLEOSIN。為了增加萌芽時的生長可以選擇糊粉特異性啟動子，從而增加糖轉運到胚芽。如果預期的結果是改變開花器官的數目，可以采用花序特異性啟動子，例如pLEAFY。為生產雄性不結果植物，需要花粉囊特異性啟動子。為了影響例如花瓣大小等花的結構，可以選擇花瓣特異性啟動子。如果需要的結果是改變特定器官的生長和/或發育特征，則對啟動子的選擇取決于要改變的器官。例如，采用根特異性啟動子將導致根部增加的生長和/或增加的生物量或產量和/或根部的表型改變。當根本身是需要的最終產品時(這類作物包括甜菜、蘿卜、胡蘿卜和馬鈴薯)，這會特別重要。可以采用果實特異性啟動子改變例如果實的外皮強度或增加果實的大小。可以采用綠色組織特異性啟動子增加葉子大小。可以采用細胞壁特異性啟動子增加細胞壁的硬度，從而提高對病原微生物的抗性。可以采用花粉囊特異性的啟動子生產雄性不結果植物。可以采用脈管特異性啟動子增加從葉子到種子的轉運。可以采用結節特異性啟動子增加植物的固氮能力，從而增加植物的營養水平。可以采用逆境誘導型啟動子在逆境條件期間驅動核酸表達以增加膜完整性。逆境誘導型啟動子，例如水逆境誘導的啟動子WSI18，干旱逆境誘導的Trg-31啟動子，ABA相關啟動子rab21或在特定逆境條件下如溫度逆境(寒冷、冰凍、熱)或滲透逆境或干旱逆境或氧化逆境或生物逆境下誘導的任意其它啟動子均可以用于驅動CRYO基因的表達。如果需要的結果是影響植物在不利條件下的耐寒性，那么可以選擇寒冷誘導型啟動子，例如prd29、pwsl8或pcorl5。類似地，術語“酵母可表達啟動子”指能夠在酵母細胞中驅動轉錄的啟動子，包括天然酵母啟動子以及其它能在酵母細胞中驅動表達的啟動子序列。在酵母中表達的合適的啟動子為現有技術中己知例如參見CurrentProtocolsinMolecularBiology，13單元(Ausubel等，1994)以及GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology(Guthrie禾口Fink,1991)。本發明的重組基因構建體可以包括來自其它基因的另外調控序列或其它序列。其中包括來自經典真核基因組基因的轉錄調控序列(包括精確轉錄起始所需要的TATA框，具有或不具有CCAAT框序列)以及另外的調控元件(即，上游活化序列，增強子和靜默子)，其對發育和/或外部刺激起反應或以組織特異性的方式改變基因的表達。一種經典的原核基因的轉錄調控序列也包括在內，在該情形下它可以包括一個-35框序列和/或-10框轉錄調控序列。調控元件也包含賦予、活化或增強細胞、組織或器官中核酸分子表達的合成融合分子或衍生物。在引入植物的構建體中可以任選地采用一個或多個終止子序列。術語“終止子”包括一個在轉錄單位末端的控制序列，其為DNA序列，它發出初級轉錄本的3’端加工處理和聚腺苷酸化和轉錄終止的信號。其它調控元件可以包括轉錄和翻譯增強子。本領域技術人員已知適合用于本發明的終止子和增強子序列。另外，可以構建和采用重組核酸，以將本發明的核酸的基因產物靶向到植物細胞內特定的細胞內區室，或將蛋白定向到細胞外環境。這通常可以通過將編碼轉運或信號肽的DNA序列與重組核酸可操作性連接起來而得到。本發明的遺傳構建體可以進一步包括復制起點序列，它是在特定細胞類型中保持和/或復制所需的，例如細菌細胞，當遺傳構建體需要在細胞中作為游離型遺傳元件(如，質粒或粘粒分子)保持的時候。優選的復制起點包括但并不限于Π-ori和colEl復制起點ο該遺傳構建體可以任選地包括選擇標志基因，這里采用的術語“選擇標志基因”包括賦予細胞一種表型的任意基因，它在該細胞中表達以協助識別和/或選擇用本發明的遺傳構建體或其衍生物轉染或轉化的細胞。合適的標志物可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標志物，含有重組DNA的細胞因此能夠在可殺死未轉化細胞的抗生素或除草劑濃度存在下存活。選擇標志基因的例子包括bar基因，其提供對除草劑Basta的抗性；氨芐西林抗性基因(Amp1O,四環素抗性基因(IV)，細菌卡那霉素抗性基因(KarO，膦絲菌素抗性基因，新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)，潮霉素抗性基因，以及氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)基因。視覺標志物，如綠色熒光蛋白(GFP，Haseloff等，Nature334，585-591，1997)，β-葡糖醛酸酶(GUS)以及熒光素酶也可以用作選擇標記。根據另一具體實施方式，本發明涉及編碼本發明的蛋白的核酸或這種蛋白作為選擇標志基因在植物或其它生物體中的應用。本發明更優選涉及編碼上述的CRYO蛋白的基因作為選擇標志基因的應用，通過用諸如亞適生長溫度等逆境條件處理進行選擇。可通過這里描述的篩選方法獲得的核酸編碼相對于野生型酵母在逆境條件下支持酵母更快生長的蛋白，由于這些核酸來源于植物，因此很可能在引入植物中后這些核酸表達的調節也可以支持植物在逆境條件下相較于野生型植物更快的生長。因此本發明提供了一種增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在這些植物中引入遺傳修飾以及在這些植物中選擇編碼下列蛋白的核酸序列的經調節的表達的步驟(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQIDN02、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50%或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項的功能片段。該蛋白優選增加酵母的寒冷逆境耐受性。同樣，本發明提供了一種增加酵母的逆境耐受性優選對寒冷逆境的耐受性的方法，包括調節植物中編碼CRYO蛋白的核酸序列的表達和/或調節CRYO蛋白的活性。CRYO蛋白的同源蛋白也可以方便地用于本發明的方法，因此本發明提供了一種增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在這些植物中引入遺傳修飾以及在這些植物中選擇編碼選自以下組的蛋白的核酸序列的經調節的表達的步驟(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換。這里采用的“增加的逆境耐受性”包括對于任何給定的逆境，植物或酵母對該特定逆境的耐受性增加，無論這些植物或酵母是否對該特定的逆境已經具有一定程度的耐受性，或無論該植物或酵母是否對該逆境新賦予了耐受性。該增加的耐受性優選是對溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，更優選寒冷逆境。這里采用的術語“耐受性”和“抗性”包括對抗逆境的保護作用，從由環境逆境條件導致的細胞代謝改變、降低的細胞生長和/或細胞死亡的延遲到實質上完全抑制。有利的是，通過本發明的方法獲得的轉基因植物或酵母對環境逆境條件具有耐受性或抗性。這里采用的術語“環境逆境”包括諸如干旱逆境(水、脫水)、滲透逆境、鹽逆境、溫度逆境(由于例如熱或霜凍等)的逆境因素。包括“寒冷逆境”、“急劇冷卻逆境”、“冷凍逆境”或“熱逆境”的“溫度逆境”是由低于或高于特定生物體的最適生長溫度而誘發的逆境。最適生長溫度范圍可以容易地確定或為本領域技術人員已知。“滲透逆境”為細胞、組織、器官或整株植物的失水、縮減的細胞膨脹或縮減的水含量相關或誘導的任意逆境。“干旱逆境”指細胞、組織、器官或生物體的剝奪水份或縮減水份供應誘導或相關的任意逆境。術語“鹽逆境”指通常與鹽或離子濃度升高相關或尤其誘導的任意逆境，導致細胞的細胞內或細胞外環境的滲透勢的紊亂。“氧化逆境”發生在寒冷逆境與強光結合的情況，臭氧逆境的情況，病原體感染或受傷后壞死的情況，衰老和由于應用某些除草劑(如莠去津或百草枯)的情況。根據本發明的一個優選特征，逆境為寒冷逆境。方便地，檢測酵母細胞中對環境條件的耐受性或抗性的結果給與了對插入的編碼序列或基因誘導植物對環境逆境的耐受性或抗性的能力的可靠的衡量指標。分離的核酸賦予植物對環境逆境的耐受性或抗性的能力可以根據現有技術中已知的方法檢測，例如，參見PhysicalStressesinPlmtsGenesandTheirProductsforTolerance，S.Grillo(編者)，A.Leone(編者)(1996年6月)，SpringerVerlag；ISBN3540613471；HandbookofPlantandCropStress，MohammadPeassarakli(Editor),MarcelDekker,ISBN0824789873；ThePhysiologyofPlantsUnderStress；AbioticFactors，ErikT.Nilsen,DavidM.Orcutt(Contributor)，EricT.Nilsen.2nd版(1996年10月)，JohnWiley&Sons,ISBN047131526；Drought,Salt，ColdandHeatStress:MolecularResponsesinHigherPlants(BiotechnologylntelligenceUnit))，KazuoShinozaki(編者)，KazukoYamaguchi-Shinozaki(編#)(1999)。RGLandesCo，ISBN1570595631；PlantsUnderStress:Biochemistry,PhysiologyandEcologyandTheirApplicationtoPlantImprovement(SocietyforExperimentalBiologySeminarSerie)，HamlynG.Jones,T.J.Flowers,M.B.Jones(編者)·(1989年9月)·CambridgeUniv.Pr.(Short)，ISBN0521344239；PlantAdaptationtoEnvironmentalStress，LeslieFowden,TerryMansfield，JohnStoddart(編者)(1993年10月)Chapman&Hall；ISBN0412490005；或附加的例子。對酵母也存在類似的方法，例如，參見ThemolecularandcellularbiologyoftheyeastSaccharomycescerevisiaw,Pringle,Jones,BroachandStrathern,ColsSpringHarborlaboratorypress，1992(NewYork)；GuidetoyeastGeneticsandMollecularandCellBiology(Methodsinenzymology的350禾口351卷)(Guthrie禾口Finf編)，AcademicPress(2002)SanDiego；YeastGeneAnalysis(Brown和Tuite)(微生物學方法26卷)Academicpress(SanDiego)；YeastStressResponses(編者Hohmann禾口Mager)SpringerVerlag，Heidelberg1997。本發明的方法包括植物或植物細胞的遺傳修飾。術語“遺傳修飾”指與野生型細胞相比通過人工干預在細胞的遺傳內容方面的改變，包括遺傳工程、育種或誘變等技術。遺傳內容的改變包括基因組的修飾，并包括植物細胞染色體以及游離體中遺傳材料的添加、缺失和置換。該術語也包括向植物細胞中加入染色體外信息。遺傳修飾優選導致核酸的經調節的表達。本發明的方法也包括后繼的選擇步驟，這期間選擇具有需要的特性的植物。選擇步驟可以基于檢測改變的生長特性的存在或缺乏，或基于檢測與引入的感興趣核酸相關聯的選擇或篩選標志基因的存在或缺乏。調節(增強或降低)編碼CRYO蛋白的核酸的表達或調節CRYO蛋白本身包括特定的細胞或組織中基因表達改變或基因產物即多肽水平改變，所述基因或基因產物影響CRYO基因表達或蛋白活性。通過本發明的篩選方法獲得的核酸具有改變植物或酵母對寒冷逆境的耐受性的能力。也可以通過直接向植物或酵母施用上述核酸編碼的蛋白而獲得該效果。調節編碼CRYO蛋白的核酸的表達和/或調節CRYO蛋白本身的水平和/或活性優選通過重組方法實現。這種重組方法可以包括直接或間接途徑來調節核酸的表達和/或調節蛋白的活性。例如，間接的方法可以包括向植物中引入能夠調節目的蛋白(CRY0蛋白)的活性和/或目的基因(編碼CRYO的基因)表達的核酸。CRYO基因或CRYO蛋白可以是野生型，即天然的或內源性的核酸或多肽。或者，它可以是來自相同或其它物種的核酸，該基因作為轉基因引入，例如通過轉化。通過精密的人工操作，該轉基因在組成和/或基因組環境方面可以從其天然形式被充分地改變。調節CRYO蛋白的活性和/或CRYO基因表達的間接方法還包括抑制或刺激驅動天然基因或轉基因表達的調控序列，可以將這類調控序列引入植物。一個直接和更優選的方法包括向植物或酵母中引入編碼上述的蛋白或其功能片段的核酸。該核酸可以通過例如轉化引入。該核酸可以來自(無論直接或間接(如果隨后改變))任何來源，只要該序列在植物或酵母中表達時導致CRYO核酸/基因表達的調節或CRYO蛋白活性的調節。核酸優選分離自鹽生植物，更優選來自甜菜。最優選能夠調節植物中CRYO基因的表達或CRYO蛋白的活性的核酸為SEQIDNO1，3，5，7，9所示的核酸或其同源物、衍生物或功能片段，或為編碼SEQIDNO2，4，6，8或10所示的蛋白或其同源物、衍生物或功能片段的核酸。然而，應當清楚本發明的應用并非僅限于SEQIDNO1，3，5，7，9所示的核酸的應用，也不僅限于編碼SEQIDNO2，4，6，8或10的蛋白的核酸，而其它編碼SEDIDNO1到10的同源物、衍生物或功能片段的核酸均可應用于本發明的方法中。本發明的方法可以方便地用于賦予植物或其部分或酵母對環境逆境條件的耐受性或抗性。調節核酸/基因的活性可以通過抑制或刺激驅動天然基因或轉基因表達的控制序列來達到，例如，可以將調控序列引入植物或酵母。“核酸”或“蛋白”可以是野生型，即天然的或內源性的核酸或多肽。或者，它可以是來自相同或其它物種的異源核酸，該基因作為轉基因引入，例如通過轉化。通過精密的人工操作，該轉基因的組成和/或基因組環境可以由其天然形式被充分地改變。調節基因表達也包括基因的轉錄物水平的改變，其能夠足夠誘導一定的表型效應。根據本發明的一個優選特征，設想核酸的表達增強或提高。現有技術中已經有許多文件記載了獲得提高或增加的基因表達或基因產物的方法，包括例如強啟動子驅動的過表達，轉錄增強子或翻譯增強子的應用。然而，下調核酸的表達也可以在植物或酵母中產生改變的逆境耐受性。方便地，具有改變的逆境耐受性的植物可以通過以有義或反義方向表達編碼CRYO蛋白的核酸而獲得。下調技術在現有技術中是已知的，在酵母中下調表達的類似或其它方法在現有技術中也是已知的(例如，用彌補宿主菌株的代謝缺陷的基因或用來自細菌的賦予對抗生素卡那霉素或遺傳霉素的抗性的基因來中斷0RF)。本發明的另一具體實施方式提供了含有編碼CRYO蛋白的核酸分子的宿主細胞，優選的宿主細胞為植物細胞或酵母。除了植物細胞，本發明的多肽也可以在原核或真核生物工程細胞中通過重組表達來生產，例如細菌、真菌或動物細胞。合適的表達體系為本領域技術人員已知。本發明延伸至對非生物逆境優選寒冷逆境有耐受性的植物或酵母，該植物或酵母具有與相應的野生型植物或酵母相比升高水平的上述蛋白。因此本發明還包括可通過本發明的方法獲得的植物。本發明因此提供可通過本發明的方法獲得的植物，該植物具有增加的逆境耐受性，且該植物具有改變的CRYO蛋白活性和/或改變的編碼CRYO蛋白的核酸的表達。特別是本發明提供了對非生物逆境優選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，該植物具有編碼選自下組的蛋白或其功能片段的核酸的增加表達(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換；該增加的耐受性為相對于相應的野生型植物而言。另外本發明提供了對非生物逆境優選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當與相應的野生型植物相比時，該植物具有核酸的增加表達，所述核酸編碼以下蛋白(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQIDNO2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50%或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項的功能片段。本發明也涉及一種生產轉基因植物、植物細胞或植物組織的方法，包括向植物、植物細胞或植物組織中引入可表達形式的本發明的核酸分子或以上定義的遺傳構建體。因此，根據本發明的另一具體實施方式，提供了一種生產相對于相應的野生型植物具有改變的逆境耐受性的轉基因植物的方法，該方法包括(i)向植物細胞中引入編碼CRYO蛋白或CRYO蛋白家族成員或其功能片段的核酸；以及(ii)從所述的植物細胞再生和/或培植成熟植物。優選逆境為寒冷逆境、鹽逆境、滲透逆境、干旱逆境或氧化逆境的至少一種，逆境更優選為寒冷逆境。本發明延伸至通過這里描述的任意方法所獲得的任意植物細胞、植物或植物部分或者酵母細胞，和所有的植物部分，包括植物的可收獲部分、種子和繁殖體。本發明也包括含有用本發明的核酸轉化的植物細胞的植物或其一部分。本發明進一步延伸至包括由任意的前述方法產生的初級轉化或轉染細胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一的要求為后代表現出與通過本發明的方法在親本中所產生的同樣的基因型和/或表型特征。這里采用的術語“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代、植物部分、植物細胞、組織和器官。術語“植物”因此也包括懸浮培養物、胚芽、分生組織區域、愈傷組織、葉子、花、果實、種子、根莖、鱗莖、根(包括塊莖)、莖干枝條(包括莖培養)、配偶體、孢子體、花粉以及小孢子。本發明的方法中特別有用的植物包括所有屬于Viridiplantae超家族的植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括，飼料或草料豆類、裝飾植物、食品農作物、樹木、或灌木，從包括下列植物的列表中選擇爵床科(Acanthaceae)、槭樹科(Aceraceae)、菖蒲禾斗(Acoraceae)、鐵線蔽禾斗(Adiantaceae)、龍舌蘭禾斗(Agavaceae)、番杏科(Aizoaceae)、澤瀉科(Alismataceae)、蔥科(Alliaceae)、蘆薈科(Aloeaceae)、六出花禾斗(Alstroemeriaceae)、覓禾斗(Amaranthaceae)、石蒜禾斗(Amaryllidaceae)、漆樹禾斗(Anacardiaceae)、密穗蕨禾斗(Anemiaceae)、觀音座蓮禾斗(Angiopteridaceae)、番蒸枝禾斗(Annonaceae)、夾竹桃禾斗(Apocynaceae)、水蕹禾斗(Aponogetonaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、天南星科(Araceae)、五加科(Araliaceae)、南洋杉禾斗(Araucariaceae)、模榔禾斗(Arecaceae)、馬鹿鈴禾斗(Aristolochiaceae)、天門#禾斗(Asparagaceae)Λ失；^M禾斗(Aspleniaceae)Λ胃#胃禾斗(Asteliaceae)Λ%禾斗(Asteraceae)、鳳仙花禾斗(Balsaminaceae)、落奏禾斗(Basellaceae)、Bataceae、秋海棠科(Begoniaceae)、小檗科(Berberidaceae)、樺木科(Betulaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、紅木禾斗(Bixaceae)、烏毛蔽禾斗(Blechnaceae)、木棉禾斗(Bombacaceae)、紫草禾斗(Boraginaceae)、十字花禾斗(Brassicaceae)蔥芥(Alliariapetiolata)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、Arabispetiolaris、Arabispumila、南芥屬(Arabissp.)、__胃(Berteroaincana)、Biscutellalaevigata、Brassicajunceae、甘藍類型(Brassicanapus)λMM^(Brassicanapusvar.Napus)、■^f(Brassicanigra)、M(Brassicaoleracea)ΛBrassicaoleraceagongylo、^^(Capsellabursa-pastoris)(Cardaminepratensis)、胃胃(Cochleariaofficinalis)、Dentarialaciniata、Descurainiapinnata、Drabaasprella、Drabaverna、^葡(Draba)、Erysimumasperum、Erysimumasperum、Erysimumcapitatum、Lepidiumflavum、北美獨行菜(Lepidiumvirginicum)、Lesquerellaargyraea、Lesquerelladensiflora、Lesquerellarubicundula、Lesquerellasp.、香雪球(Lobulariamaritima)、鍛花(Lunariaannua)、Lunariarediviva、Neobeckiaaquatica、Nerisyreniacamporum、Physariachambersii、蘿卜(Raphanussativus)、白芥子(Sinapisalba)、Stanleyapinnata、Streptanthuscordatus、^胃(Thlaspiarvense)Λ0PfMM^(Thlaspirotundifolium)、鳳梨科(Bromeliaceae)、醉魚草科(Buddlejaceae)、橄欖科(Burseraceae)、黃楊禾斗(Buxaceae)、藥菜禾斗(Cabombaceae)、仙人掌禾斗(Cactaceae)、蘇(Caesalpiniaceae)λ/K5；(Callitrichaceae)Λ^^(Calochortaceae)Λ3^；^(Calyceraceae)λto^(Campanulaceae)λ(Cannabaceae)、_人蕉禾斗(Cannaceae)、山柑禾斗(Capparaceae)、忍冬禾斗(Caprifoliaceae)、番木瓜(Caricaceae)、^*tt禾4*(Caryophy1laceae)、0胃禾4*(Casuarinaceae)、！&#禾4*(Celastraceae)、薬禾斗(Chenopodiaceae)、半日花禾斗(Cistaceae)、藤黃禾斗(Clusiaceae)、葉柄花禾斗(Cneoraceae)、彎子木禾斗(Cochlospermaceae)、使君子禾斗(Combretaceae)、甲鳥妬草禾斗(Commelinaceae)、鈴蘭禾斗(Convallariaceae)、方寵花禾斗(Convolvulaceae)、山茱萸禾斗(Comaceae)、榛禾斗(Corylaceae)、景天禾斗(Crassulaceae)、燧體木禾斗(Crossosomataceae)、葫戸禾斗(Cucurbitaceae)、火把樹禾斗(Cunoniaceae)、桕禾斗(Cupressaceae)(Cuscutaceae)(Cyatheaceae)(Cycadaceae)Λ胃禾斗(Cyperaceae)ΛM萼W禾斗(Cyrillaceae)ΛfaM禾斗(Dennstaedtiaceae)Λ蟲豐殼蕨科(Dicksoniaceae)、剌戟科(Didiereaceae)、五椏果科(Dilleniaceae)、薯蔬禾斗(Dioscoreaceae)、川續斷禾斗(Dipsacaceae)、龍腦香禾斗(Dipterocarpaceae)、茅膏菜禾斗(Droseraceae)、麟毛蔽禾斗(Dryopteridaceae)、棉樹禾斗(Ebenaceae)、厚^M(Ehretiaceae)、古月_〒禾4*(Elaeagnaceae)、^i胃禾4*(Elaeocarpaceae)、狗繁縷禾斗(Elatinaceae)、巖高蘭禾斗(Empetraceae)、尖茍樹禾斗(Epacridaceae)、麻黃禾斗(Ephedraceae)、木賊禾斗(Equisetaceae)、杜轉花禾斗(Ericaceae)、谷精草禾斗(Eriocaulaceae)、赤茍藤禾斗(Erythroxylaceae)、鼠剌禾斗(Escalloniaceae)、大卓戈禾斗(Euphorbiaceae)、澳番蒸枝禾斗(Eupomatiaceae)、豆禾斗(Fabaceae)、殼斗禾斗(Fagaceae)、大風子禾斗(Flacourtiaceae)、剌樹禾斗(Fouquieriaceae)、瓣麟花禾斗(Frankeniaceae)、紫堇禾斗(Fumariaceae)、龍膽禾斗(Gentianaceae)、貓牛兒苗禾斗(Geraniaceae)、苦苣苔禾斗(Gesneriaceae)、銀杏禾斗(Ginkgoaceae)、球花禾斗(Globulariaceae)、草海桐禾斗(Goodeniaceae)、荼薦子禾斗(Grossulariaceae)、洋二仙草禾斗(Gunneraceae)、血皮草禾斗(Haemodoraceae)、喜鹽草禾斗(Haloragaceae)、金縷梅禾斗(Hamamelidaceae)、蝎尾蕉禾斗(Heliconiaceae)、七葉樹禾斗(Hippocastanaceae)、風信子禾斗(Hyacinthaceae)、繡球花禾斗(Hydrangeaceae)、田基麻禾斗(Hydrophy1laceae)、金絲桃禾斗(Hypericaceae)、鳶尾科(Iridaceae)、水韭科(Isoetaceae)、胡桃科(Juglmdaceae)、燈心草科(Juncaceae)、旱白花菜禾斗(Koeberliniaceae)、剌球果禾斗(Krameriaceae)、唇形禾斗(Lamiaceae)、棒禾斗(Lauraceae)、玉藍禾斗(Lecythidaceae)、浮萍禾斗(Lemnaceae)、涯藻禾斗(Lentibulariaceae)、百合禾斗(Liliaceae)、沼花禾斗(Limnanthaceae)、沼鱉禾斗(Limnocharitaceae)、亞麻禾斗(Linaceae)、剌蓮花禾斗剌蓮花禾斗(Loasaceae)、山梗菜禾斗(Lobeliaceae)、馬錢禾斗(Loganiaceae)、LomandraceaeΛ藤蔽禾斗(Lomariopsidaceae)、桑寄生禾斗(Loranthaceae)、石松禾斗(Lycopodiaceae)、千屈菜禾斗(Lythraceae)、木蘭科(Magnoliaceae)、金虎尾科(Malpighiaceae)、錦葵科(Malvaceae)、竹芋禾斗(Marantaceae)、蜜囊花禾斗(Marcgraviaceae)、蘋禾斗(Marsileaceae)、角古月麻禾斗(Martyniaceae)Λ#^KP禾斗(Mayacaceae)Λ■胃#禾斗(Melanthiaceae)Λ里予牛土禾斗(Melastomataceae)ΛW禾斗(Meliaceae)Λ■#禾斗(Melianthaceae)Λ吣己禾斗(Menispermaceae)、睡菜禾斗(Menyanthaceae)、含羞草禾斗(Mimosaceae)、樣立木禾斗(Monimiaceae)、水晶蘭禾斗(Monotropaceae)、桑禾斗(Moraceae)、色蕉禾斗(Musaceae)、胃ffii禾斗(Myoporaceae)Λ^_禾斗(Myricaceae)ΛI^I1■禾斗(Myristicaceae)Λ^金牛科(Myrsinaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、蓮科(Nelumbonaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、睡蓮科(Nymphaeaceae)、藍果樹科(Nyssaceae)、金蓮木科(Ochnaceae)、柳葉菜科(Oenotheraceae)、木犀科(Oleaceae)、方枝樹科(Oliniaceae)、柳葉菜禾斗(Onagraceae)、瓶爾小草禾斗(Ophioglossaceae)、蘭禾斗(Orchidaceae)、列當科(Orobanchaceae)、紫萁科(Osmundaceae)、酢漿草科(Oxalidaceae)、芍(Paeoniaceae)λM^W(Pandanaceae)λS(Papaveraceae)、胃■胃科(Passifloraceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、田蔥科(Philydraceae)、新西蘭麻科(Phormiaceae)、商陸禾斗(Phytolaccaceae)、松禾斗(Pinaceae)、古月椒禾斗(Piperaceae)、海桐花禾斗(Pittosporaceae)、車前禾斗(plantaginaceae)、懸鈴木禾斗(Platanaceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、禾本科(Poaceae)、羅漢松科(Podocarpaceae)、桃兒七禾斗(Podophyllaceae)、花葸禾斗(Polemoniaceae)、遠志禾斗(Polygalaceae)、蓼禾斗(Polygonaceae)、水龍骨禾斗(Polypodiaceae)、雨久花禾斗(Pontederiaceae)、馬齒覓禾斗(Portulacaceae)、才艮春花禾斗(Primulaceae)、山龍目艮禾斗(Proteaceae)、鳳尾蕨科(Pteridaceae)、安石榴科(Punicaceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、大花草科(Rafflesiaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、木樨草科(Resedaceae)、帚燈草科(Restionaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、假葉樹禾斗(Ruscaceae)、蕓香禾斗(Rutaceae)、楊柳禾斗(Salicaceae)、剌茉莉禾斗(Salviniaceae)、擅香禾斗(Santalaceae)、無患子禾斗(Sapindaceae)、山攬禾斗(Sapotaceae)、瓶子草禾斗(Sarraceniaceae)、三白草禾斗(Saururaceae)、虎耳草禾斗(Saxifragaceae)、玄參禾斗(Scrophulariaceae)、卷柏禾斗(Selaginellaceae)、苦木禾斗(Simaroubaceae)、菝葜禾斗(Smilacaceae)、前禾斗(Solanaceae)、漂三棱禾斗(Sparganiaceae)、梧桐禾斗(Sterculiaceae)、旅人蕉禾斗(Strelitziaceae)、安息香禾斗(Styracaceae)、箭根薯禾斗(Taccaceae)、徑柳禾斗(Tamaricaceae)、紅顯杉禾斗(Taxaceae)、杉禾斗(Taxodiaceae)、山荼禾斗(Theaceae)、金星蔽禾斗(Thelypteridaceae)、瑞香禾斗(Thymelaeaceae)、般樹禾斗(Tiliaceae)、菱禾斗(Trapaceae)、孑L藥花禾斗(Tremandraceae)、延齡草禾斗(Trilliaceae)、昆欄樹禾斗(Trochodendraceae)、旱金蓮禾斗(Tropaeolaceae)、有葉花禾斗(Tumeraceae)、香蒲禾斗(Typhaceae)、榆科(Ulmaceae)、蕁麻科(Urticaceae)、敗醬科(Valerianaceae)、馬鞭草禾斗(Verbenaceae)、綠菊禾斗(Veronicaceae)、堇菜禾斗(Violaceae)、搬寄生禾斗(Viscaceae)、葡萄科(Vitaceae)、百歲葉科(Welwitschiaceae)、林仙科(Winteraceae)、剌葉樹科(Xanthorrhoeaceae)、Xerophyllaceae、黃目艮草禾斗(Xyridaceae)、澤米禾斗(Zamiaceae)、姜科(Zingiberacea)和蒺藜科(Zygophyllaceae)。根據本發明的一個優選特征，植物為單子葉或雙子葉植物，例如選自水稻、玉米、小麥、大麥、大豆、向日葵、油菜、苜蓿、粟、油菜籽和棉花的農作物。也不排除另外的物種，例如莧屬(amaranth)，朝鮮薊、蘆筍、椰菜、芽甘藍、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍、綠葉菜、亞麻、散葉甘藍、小扁豆、含油種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、甜菜、甘蔗、番茄、南瓜和茶、樹木和藻類等。更有利的是，通過本發明的方法獲得的植物使農作物在逆境條件下，優選在寒冷逆境條件下以提高的產量、生長、發育和繁殖力生長。本發明也使作物能夠在原本不可能生長的地區生長。感興趣基因優選通過轉化引入植物。這里涉及的術語“轉化”包括將外源性多核苷酸轉移到宿主細胞中，而不考慮用來轉移的方法。多核苷酸可以被瞬時或穩定引入宿主細胞并可以保持非整合，例如，作為質粒，或可選地，它可以整合入宿主基因組。獲得的轉化植物細胞可以用于以本領域技術人員已知的方式再生轉化植物。目前植物物種的轉化是一種相當常規的技術，可以方便地采用幾種轉化方法中的任意一種來將感興趣基因引入合適的祖先細胞。轉化方法包括運用脂質體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學物質、直接向植物中注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉化和顯微注射。方法可以選自鈣/聚乙二醇方法用于原生質體(Krens等，Nature296,72-74,1982；NegrutiuI.等，PlantMol.Biol.8,363-373，1987)；原生質體的電穿孔(Shillito等，Bio/Technol.3，1099-1102，1985)；向植物材料微注射(Crossway等，Mol.Gen.Genet.202,179-185,1986)；DNA或RNA-包被粒子轟擊(Klein等，Nature327,701987)用(非整合)病毒等感染等等，農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化(Cheng等，1997-W097/48814；Hansen1998-ffO98/54961；Hiei等，1994-W094/00977；Hiei等，1998-W098/17813;Rikiishi等，1999-W099/04618；Saito等，1995-W095/06722)，包括“flowerdip”轉化法(Bechtold和Pelletier，MethodsMol.Biol.82，259-266，1998；Trieu等，PlantJ.22，531-541，2000)。通常轉化后，選擇植物細胞或細胞組中一個或多個標志物的存在，該標志物由與感興趣基因共轉移的植物可表達基因編碼，接著轉化材料再生為完整的植株。采用現有技術已知的方法，整個生物體可以從單個轉化或轉染細胞再生。可以采用本發明的遺傳構建體轉化能夠后繼克隆繁殖(通過器官發生或胚胎形成)的植物組織，且由其再生整株植物。選擇的特定組織取決于對于要轉化的特定物種可利用且最適的克隆繁殖體系而不同。例示性的組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、胚軸、雌配子體、愈傷組織、現有分生組織(例如，頂點分生組織、葉腋芽和根部分生組織)和誘導的分生組織(例如，子葉分生組織和胚軸分生組織)。DNA轉移和再生后，可以運用例如Southern分析等評估推定轉化植物中感興趣基因的存在、拷貝數和/或基因組結構構成，可選地或附加地，新引入的DNA的表達水平可以用Northern和/或Western分析采取，兩種技術都為本領域普通技術人員所熟知。產生的轉化植物可以通過多種方式繁殖，如通過無性繁殖或傳統育種技術。例如，第一代(或Tl)轉化植物可以自花受精產生純合子的第二代(或T2)轉化體，T2植物進一步通過經典培育技術繁殖。產生的轉化生物體可以采取多種形式，例如它們可以是轉化細胞和非轉化細胞的嵌合體；克隆轉化體(例如，所有細胞都被轉化含有表達盒)；轉化和非轉化組織的嫁接體(例如，在植物中，將轉化的根莖嫁接到未轉化的幼芽上)。本發明也提供了生產與相應的野生型酵母細胞相比具有對非生物逆境改變的耐受性的轉基因酵母細胞的方法，該方法包括向酵母細胞中引入上述的編碼CRYO蛋白的核酸。本發明特別提供了一種生產相對于相應的野生型酵母對非生物逆境優選寒冷逆境具有增加的耐受性的轉基因酵母的方法，該方法包括向酵母細胞中引入編碼選自下組的蛋白或其功能片段的核酸(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換。另外，本發明提供了一種生產與相應的野生型酵母相比具有對非生物逆境優選對寒冷逆境增加的耐受性的轉基因酵母的方法，該方法包括向酵母細胞中引入編碼以下蛋白或其功能片段的核酸(a)含有SEQIDNO2，4，6，8或10給出的序列；(b)含有與SEQIDN02，4，6，8或10給出的全長序列具有至少50%或60%，70%，80%，優選90%，更優選95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(c)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項的功能片段。另外本發明提供了通過本發明的方法獲得的轉基因酵母細胞。優選地，具有編碼上述蛋白或其功能片段的核酸的增加表達的該轉基因酵母細胞，當與相應的野生型酵母細胞相比時，對非生物逆境優選寒冷逆境具有耐受性。本發明也涉及編碼上述CRYO蛋白的核酸或CRYO蛋白本身在改變植物或其部分或植物細胞的逆境耐受性中的應用。本發明揭示了SEQIDNO1到SEQIDNO10所示序列涉及導致逆境耐受性的重要過程，如具有改變的逆境耐受性的植物所例證的，該植物已經用編碼上述的CRYO蛋白的核酸序列轉化。類似地，本發明也涉及編碼CRYO蛋白的核酸或CRYO蛋白本身在改變酵母的逆境耐受性中的應用。該逆境優選為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種。本發明也包括了CRYO蛋白的同源物的應用，因此本發明涉及一種蛋白或其活性片段，或編碼該蛋白或其活性片段的核酸在改變植物或其部分或植物細胞的逆境耐受性中的應用，該蛋白選自(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換。該逆境優選為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種。本發明也包括了CRYO蛋白的同源物的應用，因此本發明涉及一種蛋白或編碼該蛋白的核酸的應用，該蛋白(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQIDNO2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50%或60%、70%、80%優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項的功能片段。而且，本發明的轉基因植物表現出對寒冷逆境條件的耐受性的特征可以與賦予植物寒冷逆境耐受性的其它方法結合，例如，甘露醇、脯氨酸、甘氨酸-甜菜堿、水-通道蛋白等滲透保護劑的應用。因此，本發明的賦予植物對環境逆境條件的耐受性的方法可以與已知的包括引入多種逆境耐受性基因的方法結合。這些方法的結合在增強對環境逆境的耐受性或抗性方面可以具有加合和/或協同效應。本發明的生產對逆境具有增強的耐受性的植物的方法也可以與其它感興趣特性相結合，例如⑴除草劑耐性(DE-A3701623；Stalker,Science242(1988)，419)，(ii)昆蟲抗性(Vaek,PlantCell5(1987)，159-169)，(iii)病毒抗性(Powell,Science232(1986)，738-743；Pappu,WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology11(1995),426-437；Lawson,Phytopathology86(1996)56suppl.)，(iv)臭氧抗性(VanCamp,Biotechnol.12(1994)，165-168)，(ν)改善水果的保藏性能(Oeller,Science254(1991)，437-439)，(vi)改進淀粉組成和/或產量(Stark,Science242(1992)，419；Visser,Mol.Gen.Genet.225(1991)，289-296)，(vii)改變脂質組成(Voelker,Science257(1992)，72-74)，(viii)(生物)聚合物的生產(Poirer,Science256(1992)，520-523)，(ix)花顏色的改變，例如，通過操縱花青素和類黃酮的生物合成途徑(Meyer，Nature330(1987)，667-678，W090/12084)，(χ)對細菌、昆蟲和真菌的抗性(Duering，MolecularBreeding2(1996)，297-305；Strittmatter,Bio/Technology13(1995),1085-1089；Estruch,NatureBiotechnology15(1997)，137-141)，(xi)生物堿和/或強心苷組成的改變，(xii)誘導維持雄性和/或雌性生育力(EP-A10412006；EP-A10223399；W093/25695)；(xiii)花序/花的更長的壽命，以及(xiv)除溫度逆境以外的非生物逆境抗性。本發明將參考下列附圖進行例示說明圖1野生型(wt)酵母菌株與gpdl突變體對比的寒冷敏感性。酵母細胞在YPD(上行)或在SD培養基(下行)上于30°C(對照，左欄)、10°C(中欄)或15°C(右上)生長。與gpdl株系相比，WT株系表現出降低的生長。圖2用CRY01、CRY02、CRY03、CRY04或CRY05基因轉化的野生型酵母菌株與用空載體(pYPGEO)轉化的wt酵母菌株相比的耐寒性。(a)用CRY01、CRY02或CRY03基因轉化的酵母細胞在10°C生長10天或用CRY04基因轉化的酵母細胞生長14天后增加的生長。(b)用CRY05基因轉化的酵母細胞與用空載體(pYPGE)轉化的野生型酵母相比增加的生長。左側兩圖為在YPD培養基或SD培養基上在30°C生長的對照。右側兩圖表示在YPD培養基或SD培養基上于10°C生長的同樣的酵母菌株的生長。圖3來自甜菜的CRY01和CRY02序列以及它們在鼠耳芥和酵母中的同源物之間的序列比對。At=鼠耳芥(Arabidopsisthaliana),Bv=甜菜(Betavulgaris)以及Sc=酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。圖4:CRY03序列以及來自多種生物體的同源蛋白之間的序列比對，表現出不同物種之間的高度保守。At=鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)；Bv=甜菜(Betavulgaris)；Mm=小鼠(Musmusculus)；Hs=智人(Homosapiens)；Sp=粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)。圖5用CRY01和CRY02探針對甜菜基因組DNA進行Southern印跡。采用的酶為BamHI，HindIII和EcoRI。圖6:a)用CRY02探針的Northern印跡。顯示了用250mMNaCl處理甜菜植物后的不同時間點(以小時計)。采用Q3-微管蛋白作為對照。b)用CRY02探針的Northern印跡。顯示了用ΙΟΟμΜABA處理甜菜植物后的不同時間點(以小時計)。采用α3-微管蛋白作為對照。圖7野生型酵母(上行)和用CRY05基因轉化的酵母(下行)在YPD(左圖)和補充了ImM叔丁基過氧化氫的YPD(右圖)上的生長。實施例除非在實施例中另外說明，所有的重組DNA技術根據Sambrook等人在(2001)分子克隆實驗室手冊，第三版，冷泉港實驗室出版社，NY或第1和2卷的Ausubel等人(1994),CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA中所描述的標準操作程序進行。植物分子工作的標準材料和方法在PlantMolecularBiologyLabfase(1993)中描述，作者R.D.D.Croy，BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications,UK聯合出版。實施例1鹽逆境誘導的甜菜cDNA文庫的構建將甜菜種子(Betavulgariscv.Dita)播種在含有沙子和蛭石(1lw/w)的混合物的罐中。將植物在溫室條件下生長(8h20°C，16h25°C，采用輔助光照以保證最小12h的光周期)。將植物周期性地用營養液(2.4g/lCa(N03)2-4H20,lg/lKNO3,lg/1MgSO4·7Η20，0.3g/IKH2PO4,5.6mg/lFequelate(Kelantren,Bayer),1.lmg/1ZnSO4·7H20,3.3mg/lMnO4·H20,0.3mg/lCuSO4·5H20，3.8mg/lH3BO3,0.18mg/l(NH4)6Mo7·4H20)灌溉。為構建cDNA文庫，在收獲前將3周大小的植物用200mMNaCl灌溉24h。以從鹽處理的甜菜植物的葉子制備的poly(A)+RNA合成定向cDNA(cDNA合成試劑盒，Stratagene)。將cDNA連接到噬菌體λPG15載體中，并用GigapackIIIgoldpackagingextract(Stratagene)包裝。采用cre-lox重組酶系統從λPG15中回收質粒cDNA文庫(Brunelli和Pal1，1993)。實施例2篩選測定的建立本工作中采用的酵母菌株為野生型二倍體菌株W303/W303(Canl-100，his3-11，15，leu2-3，112，trpl-1，ura3-1,CAL+)(WT)以及甘油磷酸脫氫酶缺陷的突變體(gpdl)。構建了來自2個gpdl突變菌株(YRA111(W303-1Amatagpdl::TRP1)以及YRAl14(W303-lAgpdl::TRPlmatα))的二倍體菌株。采用了二倍體菌株，因為這些菌株防止可能導致對寒冷逆境的耐受性的隱性染色體突變的分離。菌株生長在YPD培養基(2%葡萄糖、2%蛋白胨以及的酵母提取物)上或在SD培養基(2%葡萄糖、不含氨基酸的0.7%酵母氮基(Difco)，50mMMES[2-(N-嗎啉代)-乙磺酸]，用Tris調至pH5.5，以及需要的氨基酸、嘌呤和嘧啶)上。在第一步中，將WT二倍體菌株對寒冷的敏感性與gpdl突變菌株相比較。假定甘油的產生可能是對寒冷逆境的反應。在寒冷逆境條件下監測生長。使酵母菌株生長直至穩定期，將20μ1的1/10，1/100和1/1000稀釋的培養物點在YPD和SD培養基上，在15或10°C的溫度下保持10到14天，在30°C下2天作為對照。10°C為測定的允許WT菌株生長的最低溫度。令人驚訝的是，gpdl株系表現出耐寒，而野生型對寒冷敏感(圖1)。這使得可以采用WT株系篩選可以賦予耐寒性的基因，而gpdl株系可以作為對比研究的標準耐寒酵母株系。在第二步中，確定了轉化的最佳條件。最后最佳的方案為用30μ1飽和的WT細胞預培養物接種300mlYPD培養基。使培養物過夜生長，直到OD66GO.8,并以2000rpm離心。隨后將細胞用水和AcLiTE溶液(0.IM醋酸鋰，IOmMTris-HClpH7.6以及ImMEDTA(乙二胺四乙酸，二鈉鹽))洗滌。然后，將細胞沉淀重懸在2ml的AcLiTE溶液中，邊搖動邊在30°C孵育15分鐘，之后加入200μ1的ssDNA(10mg/ml)。將細胞懸浮液在Eppendorf管中分為110μ1等份，并加入200ng的cDNA文庫。采用Gietz等的熱休克轉化(NucleicAcidsRes.20，1425，1992)簡要地說，向每一等份試樣加入500μ1的PEG-AcLiTE溶液(含有40%w/w的PEG(聚乙二醇)4000的AcLiTE溶液)。混合后，將等份試樣在30°C下孵育30分鐘，之后在42°C孵育20分鐘，然后收獲細胞并在200μ1的IM山梨醇中重懸。將兩個等份試樣鋪在含SD瓊脂和除色氨酸(gpdl突變的標記物)和尿嘧啶(質粒的標記物)外所有必需的添加劑的14cmPetri培養皿中。為了定量轉化的效率，4個55μ1等份試樣與原始的細胞沉淀分開，并用0，10，50和IOOngcDNA文庫接種。然后采用同樣的轉化方案，最后細胞在100μ1山梨醇中重懸，并鋪于含有同樣的SD培養基的7cmPetri培養皿中。平均產率為每ngcDNA大約60個菌落。另外觀察到用經冷凍的感受態細胞轉化或以一次大規模反應而不是多次小規模反應轉化顯著降低了轉化的產率。實施例3分離CRYO基因采用在pYPGE15中構建的cDNA文庫用LiCl法轉化酵母WT株系W303(NucleicAcidsRes.20，1425，1992)。通過尿嘧啶原養型在含亮氨酸和腺嘌呤的SD平板上選擇轉化體。轉化后3天Petri培養皿中出現了菌落。在無菌水中收獲菌落并通過鋪板不同的稀釋度而定量細胞的數目。平均而言將比從轉化平板回收的細胞濃度高10倍的細胞鋪于YPD和SD培養基。接著將平板置于10°C的培養箱中，選擇8天后能夠生長的菌落。然后再次檢查在第一輪中分離的菌落的耐受性，棄除那些不呈現顯著耐受性的菌落。從剩余的菌落，通過在極限培養基中選擇而除去質粒，以分析該耐受性是否取決于該質粒。作為最后的確認，從能通過先前的控制的菌落中回收質粒，將其轉化入野生型株系，再次進行具有耐受性的克隆的選擇。獲得的結果列于表1表1在YPD或SD培養基上耐寒酵母轉化體選擇的篩選操作概述。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>將再次確認的陽性克隆測序，顯示它們編碼不同的基因，其中有命名為CRY01，CRY02CRY03,CRY04和CRY05(對于冷-耐受)的基因，表2中給出了概括表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>克隆獨立的分離具有最高程度的同源性的蛋白CRY03~未知功能的At蛋白。來自酵母的DID2。CRY04~I酵母SEC14CRY05環指結構域蛋白當轉移到酵母中時，編碼CRYOl到CRY05蛋白的基因賦予寒冷逆境耐受性(圖2)。發現CRYOl與酵母DIDl蛋白具有同源性，且經對同源性數據的進一步分析，顯示其與鼠耳芥推定蛋白gi/15233464和gi/15224854具有顯著的同源性(<90%)(如圖3所示)。根據本發明，這些推定的鼠耳芥蛋白被分別命名為AtCRYOl和AtCRY02。CRY03在鼠耳芥中也是保守的，具有3種推定的蛋白，在數據庫中標注為Atlg73030，Atlgl7730和At4gl7680，享有大于90%的同源性。根據本發明，這些推定的鼠耳芥蛋白被分別命名為AtCRY03，AtCRY03.2和AtCRY03.3。CRY03在人和小鼠中也是保守的，如在圖4堆積中所示。實施例4=Southern印跡揭示了甜菜中多于一種同種型為了確定甜菜基因組中CRYOl和CRY02的存在并估計該植物物種中編碼血紅蛋白的基因的數目，進行了Southern印跡分析。從3周大小的甜菜葉子中制備基因組DNA(RogersSO禾口BendichAJ,ExtractionoftotalcellularDNAfromplants,algaeandfungi(Eds)Plantmolecularbiologymanual,KluwerAcademicPub1ishers,Dordrecht,Netherlands,1994)。用BamHI，HindIII或EcoRI消化5mg的DNA，在0·8%瓊脂糖凝膠中電泳，并印跡到尼龍膜濾器上(HybondN+,AmershamLifeScience)0將膜濾器與對CRY01和CRY02的32P標記探針雜交。在高度嚴格條件下進行雜交和洗滌(65°C)(ChurchGM和GilbertW.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA81,1991-1995，1984)。在所有泳道中一些雜交片段的存在，與用于消化基因組DNA的限制性內切酶無關，表明基因組中有一些同種型，特別是對于CRY02(圖5)。實施例5在甜菜中CRY02未被NaCl和ABA誘導為了研究CRY02是否也參與甜菜植物對鹽逆境的反應，采用northern印跡分析分析了對暴露于NaCl不同時間起反應的CRY02mRNA的聚積。按照Davis等的描述(BasicmethodsinMolecularBiology.Elsevier.Amsterdampp.143-1461986),從對照、250mMNa+或IOOmMABA處理的甜菜葉子中分離總RNA，在含有2.2%甲醛的瓊脂糖凝膠中分離30mg的總RNA，并印跡到尼龍膜濾器上(HybondN,AmershamLifeScience)。采用上述的探針進行雜交。CRY02特異性探針顯示了相應于CRY02cDNA大小的僅一個條帶。在65°C，將濾器用4XSSC緩沖液(0.6MNaCl,0.06M檸檬酸三鈉，用HCl調至pH7),0.1%SDS洗滌兩次，5分鐘，用0.4XSSC,0.1%SDS洗滌2次，5分鐘。將同樣的濾器與含有鼠耳芥α3微管蛋白基因(Ludwig等，PNAS84，5833-5837，1987)的1.9kbEcoRI片段再次雜交。如圖6a所示，經NaCl處理CRY02mRNA并沒有隨時間而聚積，同樣，也沒有觀察到在ABA處理3小時后CRY02的誘導(圖6b)。實施例6:CRY05也給與對氧化逆境的耐受性將W303pYPGECRY05和wt酵母(對照)的稀釋系列鋪于含有ImM叔丁基過氧化氫(t-ΒΟΟΗ)的YPD培養基上，并在2和4天后檢測對氧化逆境的耐受性。具有CRY05的酵母克隆有強t-ΒΟΟΗ耐受表型，且該表型具有很高的可重復性在ImMt-ΒΟΟΗ的濃度下，對照酵母細胞根本不生長，而過表達CRY05的酵母細胞生長(圖7)。強表型的定義基于drop測試實驗。制備不同稀釋度的飽和培養物(110，1100,11000)，使其在選擇培養基(含ImMt-B00H的YPD)上生長。“強表型”為那些以所有測定的稀釋度都生長良好的克隆。“無強表型”表示該克隆以所有稀釋度均不生長。表達空質粒的對照細胞在選擇培養基中完全不生長。實施例7耐寒植物的構建采用標準技術，用在組成型或誘導型啟動子控制下的可表達形式的至少一種CRYO基因轉化植物。實施例8檢測耐寒植物使植物經受寒冷逆境足夠長的時間段來檢測轉化植物。當與同樣的未轉化植物株系相比時，轉化株系表現出在逆境條件期間更好的生長和/或在逆境條件后更好的恢復和/或更高的產量(生物量和/或可收獲部分)。簡言之，本申請還涉及如下26個項目1.一種增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在所述的植物中引入遺傳修飾以及選擇所述植物中編碼選自以下組的蛋白的核酸序列經調節的表達的步驟(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換。2.一種增加植物或酵母的非生物逆境耐受性的方法，包括在所述的植物或酵母中引入遺傳修飾以及選擇編碼蛋白的核酸在所述植物或酵母中經調節的表達和/或蛋白在植物或酵母中經調節的活性的步驟，該蛋白(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQIDNO2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50%或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(e)含有(a)到(d)任一項的功能片段。3.項目1或2的方法，其中所述的遺傳修飾包括向植物或酵母中引入分離的編碼所述的蛋白或其功能片段的核酸。4.項目1到3任一項所述的方法，其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的逆境優選為寒冷逆境。5.一種生產相對于野生型植物具有增加的非生物逆境耐受性的轉基因植物的方法，該方法包括下列步驟(i)向植物細胞中引入編碼項目1或2中所列的蛋白或其功能片段的核酸；以及(ii)從所述的植物細胞再生和/或培植成熟植物。6.項目1到5任一項的方法所獲得的植物、植物部分或植物細胞。7.對非生物逆境，優選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當與相應的野生型植物相比時，該植物具有編碼選自以下組的蛋白或其功能片段的核酸的增加的表達(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換。8.對非生物逆境，優選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當與相應的野生型植物相比時，該植物具有編碼項目2中所列的蛋白的核酸的增加的表達。9.項目6到8任一項的植物的可收獲部分、器官、組織、繁殖材料、種子以及祖先或后代。10.一種生產相對于相應的野生型酵母細胞具有增加的非生物逆境耐受性的轉基因酵母細胞的方法，該方法包括向酵母細胞中引入編碼項目1或2中所列的蛋白或其功能片段的核酸。11.項目10的方法所獲得的轉基因酵母細胞。12.對非生物逆境，優選寒冷逆境具有增加的耐受性的轉基因酵母細胞，當與相應的野生型酵母細胞相比時，該酵母細胞具有編碼項目1或2中所列的蛋白或其功能片段的核酸的增加的表達。13.編碼項目2中所列蛋白的核酸在改變酵母、植物、植物部分或植物細胞的非生物逆境耐受性中的應用，其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優選為寒冷逆境。14.編碼選自以下組的蛋白或其功能片段的核酸在改變酵母、植物、植物部分或植物細胞的非生物逆境耐受性中的應用(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換；其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優選為寒冷逆境。15.項目2的蛋白在改變酵母、植物、植物部分或植物細胞的非生物逆境耐受性中的應用，其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優選為寒冷逆境。16.選自以下組的蛋白或其功能片段在改變酵母、植物、植物部分或植物細胞的非生物逆境耐受性中的應用(i)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(ii)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(iii)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換；其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的非生物逆境優選為溫度逆境，所述的非生物逆境更優選為寒冷逆境。17.編碼項目1或2中所列的蛋白的核酸或項目1或2中所列的蛋白在植物或其它生物體中作為選擇標記的應用。18.一種分離的蛋白(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有具有至少下列序列同一性的序列i.與SEQIDNO2給出的全長序列具有76%，或80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；ii.與SEQIDNO4給出的全長序列具有55%，或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；iii.與SEQIDNO6給出的全長序列具有90.5%，或90.6%、90.7%、90.8%、90.9%，優選91%、92%、93%、94%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；iv.與SEQIDNO8給出的全長序列具有50%，或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；v.與SEQIDNO10給出的全長序列具有50%，或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；19.分離的編碼項目19的蛋白的核酸，其互補序列或一部分。20.—種遺傳構建體，包括(i)分離的編碼植物蛋白的核酸，所述植物蛋白(a)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(b)含有與SEQIDNO2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50%，或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列；(c)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(d)根據(a)到(C)的任意一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(ii)與(i)的核酸可操作性地連接的調控元件，該調控元件為植物和/或酵母可表達的啟動子；以及任選地(iii)轉錄終止序列。21.含有編碼項目18的蛋白的分離的核酸的宿主細胞，其中所述的宿主細胞為細菌、酵母、真菌、植物或動物細胞。22.一種鑒定能夠改變植物或酵母對寒冷逆境狀態的耐受性或抗性的核酸的篩選方法，所述的方法包括下列步驟(i)提供來自生物體的編碼序列的cDNA文庫；(ii)將這些編碼序列以可表達的形式引入野生型酵母細胞；(iii)使(ii)的酵母細胞在寒冷逆境的條件下生長；(iv)識別轉基因的酵母細胞和野生型酵母細胞之間的差異，優選識別生長速率的差異；(ν)從與野生型酵母細胞不同的轉基因的酵母細胞中分離核酸。23.項目22的方法，其中所述的野生型酵母細胞為野生型釀酒酵母酵母細胞，優選野生型釀酒酵母W303酵母細胞。24.項目22的方法，其中所述的生物體為植物，優選為鹽處理的植物，更優選為鹽處理的鹽生植物或其一部分，最優選為鹽處理的甜菜或其一部分。25.項目22到24任一項的篩選方法在鑒定編碼能夠賦予植物細胞或酵母細胞對寒冷逆境耐受性的蛋白的核酸中的應用。26.增加酵母細胞耐寒性的方法，包括在酵母中下調編碼甘油磷酸脫氫酶的核酸的表達和/或抑制甘油磷酸脫氫酶的活性。權利要求一種增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在所述的植物中引入遺傳修飾以及選擇所述植物中編碼選自以下組的蛋白的核酸序列經調節的表達的步驟(iv)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(v)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(vi)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRYO5樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換。2.一種增加植物或酵母的非生物逆境耐受性的方法，包括在所述的植物或酵母中引入遺傳修飾以及選擇編碼蛋白的核酸在所述植物或酵母中經調節的表達和/或蛋白在植物或酵母中經調節的活性的步驟，該蛋白(f)含有SEQIDNO2、4、6、8或10給出的序列；(g)含有與SEQIDNO2、4、6、8或10給出的全長序列具有至少50%或60%、70%、80%，優選90%，更優選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列；(h)含有(a)的置換變異體或插入變異體；(i)根據(a)到(c)的任一項，含有以相應的天然或非天然改變的氨基酸進行的置換；(j)含有(a)到(d)任一項的功能片段。3.權利要求1或2的方法，其中所述的遺傳修飾包括向植物或酵母中引入分離的編碼所述的蛋白或其功能片段的核酸。4.權利要求1到3任一項所述的方法，其中所述的非生物逆境為溫度逆境、滲透逆境、干旱逆境、鹽逆境或氧化逆境的至少一種，所述的逆境優選為寒冷逆境。5.一種生產相對于野生型植物具有增加的非生物逆境耐受性的轉基因植物的方法，該方法包括下列步驟(i)向植物細胞中引入編碼權利要求1或2中所列的蛋白或其功能片段的核酸；以及(ii)從所述的植物細胞再生和/或培植成熟植物。6.權利要求1到5任一項的方法所獲得的植物、植物部分或植物細胞。7.對非生物逆境，優選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當與相應的野生型植物相比時，該植物具有編碼選自以下組的蛋白或其功能片段的核酸的增加的表達(iv)屬于CHMP蛋白家族的蛋白；(v)含有SEC14結構域和表現出脂質轉移活性的蛋白；(vi)含有RING指結構域、富含絲氨酸的結構域以及含有特征“HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性結構域的CRY05樣植物蛋白，其中可以發生不多于6處置換。8.對非生物逆境，優選寒冷逆境具有增加的耐受性的植物，當與相應的野生型植物相比時，該植物具有編碼權利要求2中所列的蛋白的核酸的增加的表達。9.權利要求6到8任一項的植物的可收獲部分、器官、組織、繁殖材料、種子以及祖先或后代。全文摘要本發明涉及逆境耐受性，并提供了一種選擇和分離能夠賦予植物或酵母對環境逆境的耐受性或抗性的核酸的方法，另外還公開了核酸、其編碼的蛋白以及它們在生產具有提高的環境逆境抗性的植物或酵母中的應用。文檔編號C12N15/29GK101831437SQ20101012983公開日2010年9月15日申請日期2004年4月13日優先權日2003年4月11日發明者J·M·米萊薩洛爾特,R·塞拉諾薩洛姆申請人:作物培植股份有限公司