專利名稱：產生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及產生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制備方 法與應用。更具體的說是一種微生物發酵生產抗真菌脂肽的菌種，該菌種是本發明發現的 一株能有效生產抗真菌脂肽的新菌株，用該菌株發酵生產抗真菌脂肽可以有效的用于治療 皮膚癬病。
背景技術：
脂肽是革蘭氏陽性芽孢桿菌產生的一種次生代謝產物。脂肽的分子是由親水的肽 鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學組成和兩親型分子結構，具有生物表 面活性劑的特性，在醫藥、農業、食品及化妝品、石油開采和環境治理等領域有重要的應用 前景，已引起廣泛的關注。另外，大多脂肽數具有抗微生物作用，也被稱為抗生素。目前發現 的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬薺素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和 桿菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷月旨菌素(plipstatin)等。抗菌肽是通過在細胞膜上形成離子通道造成內容物大量外泄而致細胞死亡。 Christeson等認為，抗菌肽首先通過靜電作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入細胞膜 中的疏水區域，通過改變膜構象，多個抗菌肽聚合在膜上形成離子通道，造成細胞內容物 泄露致細胞死亡。Fink等認為只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的雙親螺旋只結合 在膜表面。JuVVadi(1997)推測抗菌作用的第1步是抗菌肽的陽離子與膜上磷脂基團的 陰離子之間相互作用，再與膜上碳氫化合物互作，然后疏水螺旋插入膜上，聚合形成孔道。 Park(1997)發現蛙的1種抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌機理，它不裂解細胞膜，而 是穿過膜后與DNA、RNA結合，快速導致細胞死亡。此外，人們還發現抗菌肽可通過抑制細胞 呼吸、抑制細胞外膜蛋白的合成或抑制細胞壁的形成等機制來殺死細菌。目前對抗菌肽抗 真菌的機理研究較少，CaVallarin(1998)發現位于Cecropins衍生物N末端螺旋區域的11 個氨基酸順序與抗真菌活力有關；Lee等(1989)則觀察到真菌受抗菌肽作用后，細胞膜上 有空洞形成，推測其與抑殺細菌的機理類同。本發明的抗真菌脂肽的殺菌機理主要是使細 胞膜形成離子通道破壞膜結構導致細胞死亡。皮膚癬病皮膚癬屬于致病真菌感染的皮膚疾病，癥狀是皮膚非常痕瘁，出現紅疹 或小紅斑塊，越搔皮膚越發紅瘁，患處范圍會進一步擴大。癬患處經常出現在出汗較多的地 方，如腳部、大腿內側等。皮膚癬病和甲癬是常見的淺部真菌病，其中包括足癬、體癬、股 癬、手癬和花斑癬等；甲癬俗稱“灰指(趾)甲”，以上疾病都是由真菌感染引起的，主要是白 色念球菌、紅毛癬菌和須毛癬菌。在我們生活的環境中和我們的皮膚上都有包括真菌在內的數百萬計的微生物的 存在，一旦天氣轉暖，有適于真菌生長的條件時，真菌便會乘虛而入，侵害我們的皮膚，引起 皮膚癬病。據統計，世界上約有1/4的人受到皮膚癬病的困擾。皮膚癬病還會在人與人之 間相互傳染，甚至可以在同一人的不同身體部位間傳染。目前對皮膚癬病的治療藥物是含 酮康唑或克霉唑的軟膏劑，屬于化學合成類藥物，長期使用導致致病真菌的耐藥性。
3
1968年Arima等首次發現枯草芽孢桿菌(B. subtilis)能夠產生抗菌脂肽 surfactin以來，抗菌脂肽產生菌的篩選主要集中在枯草芽孢桿菌的不同菌株之間。近 年來，進一步的研究表明，除枯草芽孢桿菌外，淀粉液化桿菌(B.amyloliquefaciens)、短 小芽孢桿菌(B. pumilus)、地衣芽孢桿菌(B. lichemformis)、蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)、 Bacillusthruingiensis、類芽f包桿菌(Paenibacillus)禾口環#芽f包桿菌(B. circulan)等 也能產生抗菌脂肽。不同種的菌株可以產生不同或相同的抗菌脂肽，同一種細菌的不同菌 株也能產生幾種不同的抗菌脂肽，如枯草芽孢桿菌的某些菌株只能產生surfactin，而有些 菌株去口會邑同時產生 surfactin、fengycin 禾口 iturin 或 bacillomycin 禾口 plipastatin。而 且，即使同一種菌株產生的同一種抗菌脂肽也不是純的單一化合物，而是由幾個或許多結 構類似的同系物組成。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種微生物發酵生產抗真菌脂肽的菌種，其分類屬枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BIl，保藏號為 CGMCCNo. 3412。本發明的另一個目的是公開了采用CGMCC No. 3412菌種制備抗真菌脂肽的方法。本發明還一個目的是公開了的采用CGMCC No. 3412菌種發酵生產的抗真菌脂肽在 抗真菌藥物方面的應用。為實現上述目的，本發明公開的技術內容如下一種抗真菌脂肽微生物發酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) BI1，保藏號為 CGMCC No. 3412。本發明提供的CGMCC No. 3412菌株是一株能生產抗真菌脂肽的新菌株，用該菌株 發酵糖質原料生產抗真菌脂肽。抗真菌脂肽微生物發酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(BaCillUSSUbtiliS)BIl，保 藏號為CGMCC No. 3412，保藏日期2009年11月6日。保藏地點中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心。該菌細胞為桿狀，革蘭染色均勻，且為陽性，產生芽孢。在肉湯培 養基平板上菌落呈圓形或不規則狀，表面褶皺，不透明，干燥，菌落呈淺黃色。在液體靜止培 養時有菌膜形成。本發明公開的采用CGMCC No. 3412菌株制備抗真菌脂肽的方法，其特征在于(1)采用的發酵菌株為CGMCC No. 3412，發酵培養基組成為(g/L)糖質原料5 50g，氮源 2 20g，檸檬酸鈉 1 3g，MgS04 7H200. 1 0. 2g，K2HP042 6g，KH2P043 9g， pH 7. 0 7. 2 ;(2)發酵培養按-10% (v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培 養溫度30 40°C，發酵通氣量為5 13m7h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150轉 /分鐘，發酵時間30 60小時，發酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發酵液pH在 6. 5 7. 5，發酵液中抗真菌脂肽產量為1 2g/L。本發明所述的制備方法，其中糖質原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性 淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麩皮糖化液。本發明所述的制備方法，其中氮源原料包括硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胰 蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。本發明進一步公開了抗真菌脂肽微生物發酵菌株在發酵生產抗真菌脂肽用于制備治療皮膚癬病方面的應用。本發明更加詳細的描述如下(1)微生物菌株的篩選與鑒定本發明中，建立了一個快速有效的篩選高產抗真菌脂肽菌株的方法，根據產抗真 菌脂肽菌株的細胞產物特點，設計以白色念球菌為指示菌的YEPD平板，挑選抑菌圈直徑大 的菌株，即為產抗真菌脂肽較好的菌株。本發明從青貯秸稈飼料中取樣，采用肉湯培養基30°C富集培養2-3次，再涂布于 白色念球菌為指示菌的YEPD選擇性平板，挑選抑菌圈直徑大的菌株，經過對多個青貯秸稈 飼料樣品的大量菌株篩選工作，從分離出來的近數百株細菌中初步篩選出近30株具有抗 白色念球菌的菌株，最后復篩得到抑菌圈直徑達2cm以上，經15次傳代后遺傳穩定性好的 菌株BI1菌株。本發明篩選得到的能抑制白色念球菌的菌株BI1，經16S rDNA基因序列測定與以 公布的枯草芽孢桿菌16S rDNA基因序列相似性達99.7%。BI1菌株能氧化葡萄糖產酸，需 氧，V-P反應呈陽性，能還原硝酸鹽和水解淀粉(表1)。BI1菌株的生理生化特征均與布坎 南和吉本斯等(1984)編著的《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和東秀珠、蔡妙英(2001)編著的 《常見細菌鑒定手冊》中描述的枯草芽孢桿菌相同。認為屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)， 芽孢桿菌屬(Bacillus)的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BIl專利保存號CGMCC3412。 該菌細胞為桿狀，革蘭染色均勻，且為陽性，產生芽孢。在肉湯培養基平板上菌落呈圓形或 不規則狀，表面褶皺，不透明，干燥，菌落呈淺黃色。在液體靜止培養時有菌膜形成。表1芽孢桿菌BI1和標準枯草芽孢桿菌生理生化特征比較 注“ + ”代表陽性，“ _ ”代表陰性
本發明菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BIl的抑菌圖譜見表2。表2BI1的抑菌譜 芽孢桿菌BI1對絲狀真菌均有拮抗作用，而對細菌及非絲狀的酵母菌沒有作用。 表明BI1對絲狀真菌有專一性的抑制作用。(2)微生物菌株的培養與生產抗真菌脂肽的發酵肉湯培養基(g/L)蛋白胨10. 0，牛肉膏5. 0，NaCl 5. 0，pH7. 2 7. 4 ；固體培養基
7需加20. 0瓊脂。YEPD培養基(g/L)蛋白胨20. 0，酵母粉10. 0，葡萄糖20. 0 ；固體培養基需20. 0瓊脂。斜面和種子培養基的組成(g/L):葡萄糖1 3，胰蛋白胨5 10，酵母粉3 6， NaCl 6 12，去離子水配制，pH 7. 2 7. 5 ；固體培養基需加15g瓊脂粉。發酵培養基的組成(g/L)糖質原料5 50g，氮源2 20g，檸檬酸鈉1 3g， MgS04 7H20 0. 1 0. 2g, K2HP042 6g，KH2P043 9g，pH 7. 0 7. 2。種子培養基和發酵 培養基的滅菌溫度為113 121°C，20min。將該菌株BI1自斜面接種于裝有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，30 40°C、 140r/min搖床培養12 16h。按(v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養 基，培養溫度30 40°C，發酵通氣量為5 13m3/h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150 轉/分鐘，發酵時間30 60小時。本發明用于發酵的糖質原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉、麩皮 糖化液。本發明用于發酵的氮源可以是硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋 白胨、酵母粉、牛肉膏、大豆粉。發酵過程通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發酵液的PH在 6. 5 7. 5，發酵液中抗真菌脂肽產量為1 2g/L。本發明進一步公開了采用CGMCC No. 3412菌種發酵生產的抗真菌脂肽在抗真菌方 面的應用以及不同原料糖化液發酵產脂肽的情況。1.將正常的白色念珠菌和經過BI1發酵提取的抗真菌脂肽處理的白色念珠菌，用 原子力顯微鏡掃描成像，見圖1和圖2。由圖1可以看出，未被處理的白色念珠菌表面非常 光滑。而被脂肽處理過的白色念珠菌(見圖2)，在原子力顯微鏡下觀察，表面有明顯的凹 陷及穿孔。有研究表明，脂肽是作用于菌體細胞膜，使細胞膜的通透性改變而發揮抗菌活性 的。因此推測，脂肽可能改變白色念珠菌細胞膜的通透性，使細胞內物質外泄，導致菌體死 亡。 2.以裸皮小白鼠于皮膚表面接種白念球菌純培養稀釋液，連續接種三天，每天接 種一次。觀察裸皮小白鼠皮膚接種處表面出現紅斑或鱗屑狀損害，用含有本發明的真菌脂 肽涂抹劑與2%克霉唑軟膏作病例治療對比試驗，早中晚3次/天涂于患處皮膚。本發明的涂抹劑治愈率達到100%，平均治愈時間7天。2%克霉唑軟膏治愈率達 到90%，平均治愈時間10天。 結論采用2%克霉唑軟膏和含2%真菌脂肽涂抹劑治療皮膚癬病，平均治愈時間7天。 試驗結果統計本發明的涂抹劑治愈率達到100%，2%克霉唑軟膏治愈率達到90%。說明本發明的真菌脂肽涂抹劑可以殺滅致病真菌，治愈率達100%。3.將3g/L蔗糖、麥芽糖、果糖代替3g/L葡萄糖，接入培養好的枯草芽孢桿菌BI1 種子，發酵60h，提取發酵液中抗真菌脂肽。結果如表3。表3枯草芽孢桿菌以不同糖發酵產脂肽結果 4.將20g/L可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液、麩皮糖化液代替3g/L葡萄糖，接入 培養好的枯草芽孢桿菌BI1種子，發酵60h，提取發酵液中抗真菌脂肽，結果如表4。表4枯草芽孢桿菌以不同原料糖化液發酵產脂肽結果 本發明公開的技術內容與現有技術相比所具有的積極效果表現在以下方面1、發現了一株產抗真菌脂肽的新菌枯草芽孢桿菌BI1，其代謝產物抗真菌脂肽只 對絲狀真菌有抗性，對細菌和乳酸菌沒有抑菌活性，因此作為皮膚擦劑既可以殺滅致病真 菌，又不破壞皮膚表面存在的益生細菌。2、枯草芽孢桿菌BI1，其代謝產物抗真菌脂肽產量較高達到l_2g/L。3、枯草芽孢桿菌BI1，發酵產抗真菌脂肽所需碳源和氮源較廣泛，其中多數為農產 品加工副產物，因此生產原料成本低。更適合大規模的工業化生產。
圖1為正常的白色念珠菌表面形態；圖2經脂肽處理過的白色念珠菌形態。
具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當的省略了公知技術的描述，以免那些不必要的 細節影響對本技術方案的描述。以下結合較佳實施例，對本發明做進一步的描述。實施例1(1)微生物菌株的培養與產抗真菌脂肽的發酵[肉湯培養基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏5. 0,NaCl 5. 0，pH7. 2 ；固體培養基需加 20. 0瓊脂。YEPD培養基(g/L)蛋白胨20. 0，酵母粉10. 0，葡萄糖20. 0 ；固體培養基需加20. 0 瓊脂。]此處為公知內容可刪去。斜面和種子培養基的組成(g/L):葡萄糖3，胰蛋白胨5，酵母浸出粉6，NaC16，去 離子水配制，PH 7. 5 ；固體培養基需加15g瓊脂粉。
發酵培養基的組成(g/L)糖質原料(葡萄糖)5g，氮源(硝酸銨)15g，檸檬酸鈉 lg，MgS04. 7H20，0. 5g，K2HP042 6g，KH2P045g, pH 7. 0 7. 2。種子培養基和發酵培養基的 滅菌溫度為115°C，20min。將該菌株BI1自斜面接菌于裝有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，40°C、140r/ min搖床培養16h。按2% (v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫度40°C， 發酵通氣量為8m3/h，罐壓0. 05MPa,攪拌速度100 150轉/分鐘，發酵時間60小時。酵過 程通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發酵液的PH在7，發酵液中抗真菌脂肽產量為1. 5L。實施例2(1)采用的發酵菌株為CGMCC No. 3412，發酵培養基組成為(g/L):葡萄糖10g，氮 源 20g，檸檬酸鈉 3g，MgS04 7H20，0. 2g，K2HP042g，KH2P043g，pH 7. 0 ；(2)發酵培養按2% (v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫度 30°C，發酵通氣量為5m3/h，罐壓0. 03MPa，攪拌速度80轉/分鐘，發酵時間30小時，發酵過 程中通入無菌空氣，用氨水維持發酵液pH在7. 5，種子培養基和發酵培養基的滅菌溫度為 12rC，20min。發酵液中抗真菌脂肽產量為1. 5g/L。實施例3(1)采用的發酵菌株為CGMCC No. 3412，發酵培養基組成為(g/L):玉米粉35，氮源 蛋白胨 15，檬酸鈉 1，MgS04 7H20，0. 8，K2HP044，KH2P046，pH 1.2。(2)發酵培養按2% (v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫度 30°C，發酵通氣量為5m3/h，罐壓0. 05Pa,攪拌速度60轉/分鐘，發酵時間45h，發酵過程中 通入無菌空氣，用氨水維持發酵液pH在7. 2，發酵液中抗真菌脂肽產量為1. 4g/L。實施例4(1)采用的發酵菌株為CGMCC No. 3412，發酵培養基組成為(g/L)糖質原料40g， 氮源(牛肉膏)20g，檸檬酸鈉 3g，MgS04 7H20. lg, K2HP045g，KH2P047g，pH 7. 2 ；(2)發酵培養按8% (v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫度 35°C，發酵通氣量為8m3/h，罐壓0. 09MPa,攪拌速度100轉/分鐘，發酵時間50小時，發酵 過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發酵液pH在6. 5 7. 5，種子培養基和發酵培養基 的滅菌溫度為125°C，20min，發酵液中抗真菌脂肽產量為2g/L。實施例5(1)采用的發酵菌株為CGMCC No. 3412，發酵培養基組成為(g/L):麥芽糖35g，氮 源(胰蛋白胨)15g，檸檬酸鈉 3g，MgS04 7H20，0. 15g，K2HP044. 5g，KH2P046. 5g，pH 7. 2 ；(2)發酵培養按4. 5% (v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫 度35°C，發酵通氣量為10m3/h，罐壓0. 06MPa,攪拌速度80轉/分鐘，發酵時間40小時，發 酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發酵液pH在6. 5，發酵液中抗真菌脂肽產量為 1. 2g/L。本發明在詳細說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術人士可清楚地了解，在不脫 離上述申請專利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據本發明的技術實質對以上實 施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案的范圍。且本發明亦不 受限于說明書中所舉實例的實施方式。
權利要求
一種抗真菌脂肽微生物發酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏號為CGMCC No.3412。
2.一種采用權利要求1所述CGMCC No. 3412菌株制備抗真菌脂肽的方法，其特征在于(1)采用的發酵菌株為CGMCCNo. 3412，發酵培養基組成為(g/L)糖質原料5 50g， 氮源 2 20g，檸檬酸鈉 1 3g，MgSO4 · 7Η200· 1 0. 2g，K2HP042 6g，KH2P043 9g，pH 7· 0 7· 2 ；(2)發酵培養按-10%(ν/ν)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫 度30 40°C，發酵通氣量為5 13m7h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150轉/分鐘， 發酵時間30 60小時，發酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發酵液pH在6. 5 7. 5，發酵液中抗真菌脂肽產量為1 2g/L。
3 權利要求2所述的制備方法，其中糖質原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶 性淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麩皮糖化液。
4.權利要求2所述的制備方法，其中氮源原料包括硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、 胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。
5.采用權利要求2所述方法制備的抗真菌脂肽在制備治療皮膚癬病藥物方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種產生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制備方法與應用。其中微生物發酵生產抗真菌脂肽的菌種分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BI1，保藏號為CGMCC No.3412。本發明還涉及發酵抗真菌脂肽的制備方法，它是采用發酵菌株BI1，按1％-10％(v/v)的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫度30～40℃，發酵通氣量為5～13m3/h，罐壓0.02～0.09MPa，攪拌速度100-150轉/分鐘，發酵時間30～60小時，發酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發酵液pH在6.5～7.5，發酵液中抗真菌脂肽產量為1～2g/L。本發明還公開了抗真菌脂肽在制備治療皮膚癬病方面的應用。
文檔編號C12P21/00GK101892176SQ20101012980
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月23日 優先權日2010年3月23日
發明者徐進, 王德培 申請人:天津科技大學