專利名稱：產生o-乙酰高絲氨酸的微生物和利用所述微生物產生o-乙酰高絲氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及能夠以高產量產生O-乙酰高絲氨酸(L-蛋氨酸前體)的微生物株。另 外，本發明還涉及利用所述微生物株高產量地產生O-乙酰高絲氨酸的方法。
背景技術：
可以通過化學或生物學方式合成在動物飼料、食品和醫藥中使用的蛋氨酸。在化學合成中，蛋氨酸基本上是通過水解5_( β-甲基巰基乙基)乙內酰脲產生 的。然而，合成的蛋氨酸的不利之處在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，這需要困難 的額外方法將它們彼此分開。為了解決該問題，本發明的發明人開發了用于選擇性地合成 L-蛋氨酸的生物學方法，L-蛋氨酸是已有專利申請(W0 2008/103432)要求保護的化學物 質。該方法(簡稱為“兩步法”)包括發酵產生L-蛋氨酸前體和由L-蛋氨酸前體向L-蛋 氨酸的酶促轉化。所述蛋氨酸前體優選包括0-乙酰高絲氨酸和0-琥珀酰高絲氨酸。就對 常規方法存在的問題的克服對所述兩步法進行評價，所述常規方法存在的問題例如硫化物 的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反饋調控，以及胱硫醚Y -合酶、0-琥珀酰高絲 氨酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶對中間產物的降解。另外，與產生DL-蛋氨 酸的常規化學合成法相比，所述兩步法具有以下優點僅對L-蛋氨酸具有選擇性，并且伴 隨產生作為有用副產物的有機酸，例如琥珀酸和乙酸。作為蛋氨酸生物合成途徑中的中間產物，0-乙酰_高絲氨酸被用作產生蛋氨酸前 體(W0 2008/013432)。如下式所示，在0-乙酰轉移酶的協助下由L-高絲氨酸和乙酰-CoA 合成0-乙酰-高絲氨酸L-高絲氨酸+乙酰-CoA — 0-乙酰-高絲氨酸。在本申請的受讓人的美國專利公開第US 2009-0253186 Al號中公開了其中引入 了 thrA和metX基因以分別提高L-高絲氨酸和0-乙酰高絲氨酸的生物合成的微生物株， 以及利用所述微生物株高產量地產生0-乙酰高絲氨酸的方法。關于這一點，本發明的發明 人認為增加乙酰-CoA(0-乙酰高絲氨酸的生物合成中使用的兩種底物之一)可提高0-乙
酰高絲氨酸的產量。在大腸桿菌中，大部分乙酰-CoA是由丙酮酸合成的。然而，如果存在過量的葡萄 糖，可以由培養基中累積的乙酸產生乙酰-CoA。從乙酸合成乙酰-CoA可以利用兩種不同的 生物合成途徑。在一種乙酰-CoA生物合成途徑中，存在乙酰腺苷酸(AcAMP)中間產物，而乙 酰-CoA合酶(acetyl-CoA synthase,ACS)通過該中間產物將乙酸活化成乙酰_CoA。在另一 種途徑中，作為由乙酸激酶(ACK)和磷酸轉乙酰酶(PTA)催化的連續反應的結果，通過乙酰 磷酸將乙酸轉化為乙酰-CoA(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,May 1995，p. 2878-2886)。在由乙 酰-CoA合酶介導的生物合成途徑中發揮重要作用的乙酰-CoA合酶對乙酸具有高親和力， 其甚至可以將細胞內或細胞外的低水平乙酸活化成為乙酰-CoA。相比而言，ACK-PTA-介導 的乙酰-CoA生物合成途徑僅在可能由混合酸的發酵形成的高乙酸水平下進行，因為ACK和PTA酶對乙酸具有低的親和力(J. Gen. Microbiol. 102 :327_336)。對于乙酰-CoA合酶，由于位于啟動子上游的CRP-結合位點，其表達在指數生長前 在轉錄水平上受到代謝物阻遏控制的抑制，而此后當細胞進入靜止期時，其表達增高(Mol Microbiol. 2004 Jan ；51(1) :241_54·)。因此，可以通過ACK-PTA途徑將在發酵中期累積的乙酸活化成乙酰-CoA。然而，由 于ACK-PTA途徑是可逆的，如果乙酸的水平低，那么乙酰-CoA被轉化為乙酸。也就是說，在 ACK-PTA途徑中可能發生乙酰-CoA的消耗，顯示出對0-乙酰高絲氨酸合成的負作用。在乙酰-C0A的合成中與乙酸一起作為底物使用的輔酶A(CoA)是細胞內的代表性 酰基基團載體。輔酶A由泛酸經過一系列的步驟合成，每個步驟的酶促催化如下所示。首 先，泛酸激酶(CoaA)將泛酸(維生素B5)活化成4'-磷酸泛酸，然后向4'-磷酸泛酸上 加入半胱氨酸形成4'-磷酸泛酰-L-半胱氨酸(f-phosphopantothenoyl-L-cysteine)， 然后利用P-PanCys合酶/P-PanCys脫羧酶(coaBC)的組合通過脫羧作用形成4'-磷酸泛 酰巰基乙胺。然后，通過磷酸泛酰巰基乙胺(P-PanSH)腺苷酰基轉移酶(coaD)將4'-磷酸 泛酰巰基乙胺腺苷酰化，從而形成脫磷酸-CoA。最后，利用ATP通過脫磷酸輔酶A(deP-CoA) 激酶(coaE)將脫磷酸-CoA磷酸化為輔酶A。通常，CoA是細胞內多數代謝反應以及很多合成反應的輔助因子。為此，通過調節 機制將CoA庫保持在恒定水平。調節細胞內CoA庫的首要關鍵因子是泛酸激酶，其催化第 一關鍵步驟并且是CoA生物合成中的限速酶。通過反饋抑制調節泛酸激酶是控制細胞內 CoA濃度的主要因素(J Biol Chem. 19940ct 28 ；269 (43) :27051_8)。然而，細胞內保持的 恒定CoA水平可能是通過乙酰-CoA有效產生O-乙酰高絲氨酸的障礙。據報道，用丙氨酸 A取代第106位的精氨酸R使泛酸激酶由對CoA的反饋抑制敏感轉變為對反饋抑制具有抗 性(Journal Of Bacteriology, 185, June 2003，p. 3410-3415)。發現在存在 40mM CoA 時， 野生型蛋白僅保留約20%的催化活性，而在相同濃度的CoA下卻沒有檢測到R106A突變蛋 白的催化活性降低。另外，發現，與野生型相比，表達突變蛋白的突變株具有顯著高的細胞 內CoA水平。為完成本發明，本發明的發明人進行了廣泛而深入的研究，發現引入并增強(a) 對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因，和(b)0-乙酰CoA合酶基因中的任一個或兩 個都導致O-乙酰高絲氨酸產量顯著提高，如圖1所示。
發明內容
因此，本發明的目的是提供能夠以高產量產生O-乙酰高絲氨酸的微生物株，所述 微生物株經過設計通過過表達acs基因和對CoA的反饋抑制具有抗性的coaA基因而增強 乙酰-CoA的生物合成途徑。本發明的另一個目的是提供利用所述微生物株以高產量產生O-乙酰高絲氨酸的 方法。根據本發明的一個方面，提供能夠產生O-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株，其 中，向所述菌株中引入并增強了 (a)乙酰-CoA 合酶基因(acs)；(b)編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或
(c) (a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)兩者。根據本發明的另一方面，提供在培養基中產生0-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法 包括在培養基中發酵所述株。根據本發明的再一方面，提供產生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括(a)發 酵埃希氏菌屬的菌株從而產生O-乙酰高絲氨酸；(b)分離0-乙酰高絲氨酸；和(c)在選自 由胱硫醚Y -合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶組成的 組的酶存在下，將0-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一起轉化為L-蛋氨酸和乙酸(acetate)。因此，根據本發明可以通過生物學方式高產量地產生0-乙酰高絲氨酸，這種方法 的環境友好度高于化學方法。此外，可以酶促地，例如通過0-乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶 將本發明的微生物株產生的O-乙酰-L-高絲氨酸酶促地轉化為L-蛋氨酸和乙酸。L-蛋氨 酸可以用作食品或動物飼料的添加劑。
參考以下詳細說明并結合附圖，可以更清楚地理解本發明的上述和其它目的、特 點和優點，在附圖中圖1為顯示能夠高產量地產生0-乙酰高絲氨酸的0-乙酰高絲氨酸生物合成途徑 的示意圖；圖2為顯示攜帶乙酰-CoA合酶基因(acs)的表達載體pCL-P (pro) -acs的遺傳圖 和構建的示意圖；和圖3為顯示均攜帶編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶(coaA (R106A))的 基因的表達載體pCL-P(pro)-coaA(R106A)和pACYC-coaA(R106A)的遺傳圖和構建的示意圖。
具體實施例方式根據本發明一個方面，本發明提供能夠產生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌 株，其中，向所述菌株中引入并增強了 (a)乙酰-CoA合酶基因(acs) ； (b)編碼對CoA的 反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或(c) (a)的乙酰-CoA合酶基因 (acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)兩者。本文使用的術語“L-蛋氨酸前體”旨在指在蛋氨酸生物合成途徑中存在的代謝物 或其衍生物，并且尤其指0-乙酰高絲氨酸。本文使用的術語“產0-乙酰高絲氨酸株”旨在表示能夠在細胞內或細胞外產生 0-乙酰高絲氨酸的原核或真核微生物，并且尤其表示經遺傳修飾能夠在其中累積0-乙酰 高絲氨酸的微生物。可用于本發明的菌株的實例包括埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、歐 文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬(Providencia sp·)、棒桿菌屬(Corynebacteria sp·)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp·)、鉤端螺旋體 屬(Leptospira sp·)、沙門氏菌屬(Salmonellarsp.)、短桿菌屬(Brevibacteria sp.)、 Hypomononas sp.、色桿菌屬(Chromobacterium sp.)、諾卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌禾口 酵母，優選埃希氏菌屬、棒桿菌屬和鉤端螺旋體屬以及酵母。更優選埃希氏菌屬。更優選大 腸桿菌(Escherichia coli.)。更優選能夠產生賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或蛋氨酸的大腸桿菌菌株。最優選大腸桿菌菌株(保藏號KCCM 10921P)，其源自US12/062835(即，美國專 利公開第2009-0253186 Al號)中所述的產生蘇氨酸的菌株，并向其中引入了 thrA和metX 基因從而改善0-乙酰-L-高絲氨酸的生物合成途徑。在本發明的優選實施方式中，提供通過增強乙酰-CoA生物合成途徑而提高0-乙 酰高絲氨酸產量的產0-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強了乙酰-CoA生物合成 途徑中涉及的乙酰-CoA合酶基因。在本發明的另一個優選實施方式中，提供通過增強乙酰-CoA生物合成途徑而提 高0-乙酰高絲氨酸產量的產0-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強了對累積CoA 的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因。在本發明的另一個優選實施方式中，提供通過增強乙酰-CoA生物合成途徑而提 高0-乙酰高絲氨酸產量的產0-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強了乙酰-C0A生 物合成途徑中涉及的乙酰-CoA合酶和對累積CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因。本文使用的術語“引入并增強”旨在表示提高由相應基因編碼的酶的細胞內活性， 這通常能夠通過所述基因的過表達實現。過表達目標基因的方法有很多。例如，可以通過 修飾目標基因的啟動子區內和/或5’ -UTR內的堿基；通過在染色體上引入目標基因的額 外拷貝；或者通過將目標基因與自體同源啟動子或異源啟動子相組合引入到載體上，然后 將所述載體轉化到微生物株中實現過表達。另外，目標基因ORF(開放閱讀框)內的突變可 以引起其過表達。用數字表示，當發生過表達時，與天然狀態的表達相比，相應蛋白的活性 或濃度提高了 10%、25%、50 %、75%、100%、150%,200%、300%、400%或 500%、1000% 或者高達2000%。為了引入并增強基因，可以對相應的啟動子進行突變或者增加基因的拷貝數。優 選使用強啟動子。只要其是組成型的啟動子，任何啟動子均可在本發明中使用而不受限制。 可以使用pTac、pTrc、pPro、pR和pL，其中最優選SEQ ID NO. 9的pPro。目標基因可以全 部或部分地包含SEQ ID NO. 9的pPro啟動子。所述乙酰-CoA合酶和泛酸激酶可以來自多種不同的微生物，且可以分別由本發 明中稱為“acs”和“coaA”的基因編碼。在本發明中，提供了通過修飾而增強乙酰-CoA合酶活性、具有高的產生0-乙酰高 絲氨酸的能力的菌株，和利用所述菌株產生0-乙酰高絲氨酸的方法。在本發明的實施方式中，產0-乙酰高絲氨酸株的制備如下所示。為了提高0-乙酰-L-高絲氨酸的產生，用SEQ ID N0. 9的組成型啟動子P (pro) 取代菌株中編碼乙酰-CoA合酶基因的啟動子，然后構建組成型表達質粒從而誘導不受代 謝物阻遏的目標基因過表達。編碼乙酰-CoA合酶的基因通常表示為acs。它可以從之前 公開的大腸桿菌基因組序列(gi 89110790)獲得(Mol Syst Biol. 2006 ；2 =2006. 0007. Epub 2006 Feb 21)。另外，也可以從公用數據庫，例如美國國立生物技術信息中心(the National Center for Biotechnologylnformation, NCBI)禾口曰本 DNA 數據庫(DNA Data Bank of Japan, DDBJ)構建的公用數據庫中獲得所述基因序列。乙酰-CoA合酶具有催化以下反應的活性。如果編碼所述酶的基因的表達被增強， 則會誘導乙酰-CoA在細胞內累積。乙酸+CoA< = > 乙酰-CoA
接著，對具有組成型表達質粒的微生物株進行操作，從而進一步提高乙酰-CoA的 合成。本發明中采取的方法是使針對CoA合成的反饋抑制失效。關于這一點，催化第一關 鍵步驟并作為CoA生物合成中的限速酶的泛酸激酶被突變，從而對CoA的反饋抑制產生抗 性。為此，向編碼泛酸激酶的基因中引入突變，即CoaA(R106A)。該基因可以從之前公開的 大腸桿菌基因組序列(gi :89110060)獲得(Mol Syst Biol. 2006 ；2 2006. 0007. Epub 2006 Feb 21.)。另外，也可以從公用數據庫，例如美國國立生物技術信息中心(NCBI)和日本DNA 數據庫(DDBJ)構建的公用數據庫中獲得所述基因序列。除了具有催化如下反應所示的從泛酸至4’ -磷酸泛酸的磷酸化的活性外，所述突 變的泛酸激酶對CoA反饋抑制不敏感。因此，增強編碼突變的泛酸激酶的基因提高細胞內 CoA庫的水平。泛酸+ATP< = >4，-磷酸泛酸 +ADP由此獲得的突變株在其中累積了大量作為底物的CoA和乙酰-CoA以及高絲氨酸， 用于通過metX編碼的酶產生0-乙酰-L-高絲氨酸。因此，所述突變株能夠高產量地產生 0-乙酰-L-高絲氨酸。由此，將三株產0-乙酰高絲氨酸株CJM-X/(pCL-P (pro)-Acs)、CJM-X/ (pCL-P (pro) -coaA (R106A))和 CJM-X/(pCL_P (pro)-acs，pACYC-coaA (R106A))分別命名為 “大腸桿菌CA05-0565”、“大腸桿菌CA05-0564”和“大腸桿菌CA05-0566”，制備并于2009年 8 月 11 日保藏在 KCCM(Korean Culture of Microorganism, Eulim build, Hongje-l-Dong, Seodaemun-ku, Seoul，361-221，Korea),保藏號分別為 KCCM11023P、KCCMl 1022P 和 KCCMl1024P。在本發明的優選實施方式中，提供產0-乙酰高絲氨酸株，在該株中，在組成型啟 動子Pro的控制下過表達參與乙酰-CoA生物合成的基因acs。更具體地，pPro啟動子由 SEQ ID N0. 9的全長序列或其部分構成。在本發明的另一個優選的實施方式中，提供產0-乙酰高絲氨酸株，在所述株中負 責CoA生物合成的關鍵步驟的泛酸激酶對CoA的反饋抑制具有抗性。另外，本發明還提供 高產量地產生0-乙酰高絲氨酸的方法。優選地，對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶在 第106位氨基酸發生突變。更優選地，通過用丙氨酸取代精氨酸使泛酸激酶在第106位氨 基酸發生突變，由此對CoA的反饋抑制具有抗性。最優選地，對CoA的反饋抑制具有抗性的 泛酸激酶具有SEQ ID N0. 8的氨基酸序列。在本發明的再一個優選實施方式中，提供產生0-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌菌株， 其中在所述菌株中同時采取兩種方法以增強乙酰-CoA合酶的活性和泛酸激酶的活性。優選地，用于制備產0-乙酰高絲氨酸株的大腸桿菌菌株是能夠產生賴氨酸、蘇氨 酸、異亮氨酸或蛋氨酸的大腸桿菌菌株。更優選地，所述大腸桿菌菌株的特征在于引入并增 強了(a)高絲氨酸乙酰轉移酶；(b)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性；或(c) (a)和(b) 兩者。最優選的是源自CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏號KCCM 10921P)的大腸桿菌。在本發明的具體實施例中，克隆acs基因并用于構建在SEQ ID N0. 9的組成型啟 動子PPro控制下的acs表達載體pCL-P (pro)-acs (圖2)。將coaA基因的第106位氨基 酸從精氨酸突變為丙氨酸，從而產生SEQ ID N0. 8的突變coaA基因，其編碼對CoA的反饋 抑制具有抗性的所述酶。將該突變基因克隆至攜帶SEQ ID而.9的組成型啟動子？ 1~0的質粒中，從而產生在組成型啟動子PPro控制下的重組表達質粒pCL-P(pro)-coaA(R106A) 和pACYC-coaA(R106A)(圖3)。向CJM-X中單獨或組合轉化入重組質粒pCL_P (pro)-acs 和pCL-P (pro)-coaA(R106A)或pACYC_coaA(R106A)，從而制備特征在于引入并增強了(a) 編碼乙酰-CoA合酶(acs)的基因，(b)編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的基 因(coaA)，和(c) (a)和(b)兩種基因的產0_乙酰高絲氨酸株(實施例1_3)，其中所述 CJM-X是通過從在US12/062835(即美國專利公開第US 2009-0253186 Al號)中公開的增 加 了 thrA 和 metX 的菌株 CJM-X/pthrA (M) -CL (保藏號 KCCM 10921P)中除去 pthrA (M) -CL 質粒而構建的。培養瓶培養表明，與對照CJM-X相比，在用攜帶(a)的乙酰-CoA合酶基 因(acs)的pCL-P(pr0)-acS轉化的菌株中，0-乙酰高絲氨酸的生產能力在產量上提高 了 2.8g/L，產率上提高了 4.7% ；在用攜帶(b)的對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶 的pCL-P(Pro)-CoaA(R106A)轉化的菌株中，O-乙酰高絲氨酸的生產能力在產量上提高了 2. lg/L，產率上提高了 3. 5%;在用(b)和(c) ^ pCL-P (pro) -acs ^P pACYC-coaA (R106A)轉 化的菌株中，O-乙酰高絲氨酸生產能力在產量上提高了 6. 8g/L，產率上提高了 11.4% (參 見實施例2，表2)。根據本發明的另一個方面，本發明涉及產生0-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法包 括在培養基中發酵產生0-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌菌株，從而在培養基中累積0-乙酰高 絲氨酸。根據本發明的再一方面，本發明涉及產生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括
(a)通過發酵本發明的產生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株產生0-乙酰高絲氨酸；
(b)分離0-乙酰高絲氨酸；和(c)在選自胱硫醚Y-合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和 0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的轉化酶存在下，將分離的0-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一 起轉化為L-蛋氨酸和乙酸。當與本發明的微生物株組合使用時，本發明的發明人的WO 2008/013432中公開 的基于使用轉化酶(胱硫醚Y -合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶或0-琥珀酰高絲氨酸 硫化氫解酶)的L-蛋氨酸生產方法能夠產生更高產量的L-蛋氨酸。以上制備的產生0-乙酰高絲氨酸的微生物株可以在本領域已知的培養基和培養 條件下培養。本領域技術人員完全理解，可以根據所用微生物株對培養方法進行調整。發 酵可以以分批、連續培養或分批補料的形式進行，但并不限于此。以下參考文獻公開了多種 發酵方法“BiochemicalEngineering，，by James Μ. Lee, Prentice-Hall International Editions，pp 138-176。培養基必須滿足特定微生物株的培養條件。以下參考文獻中公開了多種微生物培 養基"Manual of Methods for General Bacteriology"by the AmericanSociety for Bacteriology, Washington D. C.，USA，1981。通常，培養基包括多種碳源、氮源和微量元 素。碳源的實例包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；脂 肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇類，例 如甘油和乙醇；和有機酸，例如乙酸。這些碳源可以單獨或組合使用。氮源的實例包括有機 氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽膏、玉米漿(CSL)和豆粉；無機氮源，例如尿素、 硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨，這些氮源可以單獨或組合使用。另外，所述培養 基還可以包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和/或其相應的含鈉鹽。另外，所述培養基中還可以以鹽的形式包含金屬，例如磷酸鎂或硫酸鐵。此外，還可以加入氨基酸、維生素和適當的前 體。可以分批或連續的方式將所述培養基或前體加入到培養物(culture)中。可以利用合適的化合物，例如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸和硫酸，調整培養物 的PH。為了防止在培養物中產生泡沫，可以使用消泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了產生 有氧條件，可以向培養基中充入氧或含氧氣體(例如空氣)。培養基保持在20 45°C，優 選25 40°C。將微生物株培養至L-蛋氨酸前體的期望水平，優選培養10 160小時。通過以下實施例可以更好地理解本發明，但以下實施例僅用于說明而非限制本發 明的范圍。實施例1 制備產0-乙酰高絲氨酸株<1-1> 克隆 acs 基因對于acs基因的克隆，利用大腸桿菌W3110(ATCC 27325)的基因組DNA作為模板， 通過PCR擴增編碼乙酰-CoA合酶的acs基因。從NIH的GenBank數據庫獲得acs基因的 堿基序列(NCBI-gi :89110790)，并表示為SEQ ID NO. 7。在所述堿基序列的基礎上，利用含 有選擇性酶切位點EcoRV和HindIII的引物對(SEQ ID N0S. 1和2)，以大腸桿菌W3110的 基因組DNA為模板，在高保真DNA聚合酶PfuUltra (Stratagene)存在下，通過PCR擴增從 ATG至TAA的0RF。所述PCR包括96°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸2分鐘的30 個循環，從而合成含有EcoRV和HindIII位點的約2. Okb的acs基因。用限制性酶EcoRV和HindIII消化后，將所擴增的acs基因連接到此前用相同酶 進行處理的pPro-GFP載體上，從而構建攜帶acs基因并包含組成型啟動子Pro的重組組成 型表達載體，稱為pCL-P(pro)-acS。圖2顯示了所述表達載體pCL_P (pro)-acs的遺傳圖和 構建。<1-2>克隆反饋抗性coaA基因為了克隆反饋抗性coaA基因，利用大腸桿菌W3110(ATCC 27325)的基因組DNA作 為模板，通過PCR擴增編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的coaA基因。為此，首先 從NIH的GenBank數據庫獲得coaA基因的堿基序列(NCBI-gi =89110060)。在所述堿基序 列的基礎上，設計用于PCR擴增從ATG至TAA的coaA片段的引物對(SEQ ID N0S. 3和4)， 使其包含限制性酶切位點EcoRV，并且在第316 318位的核苷酸為密碼子GCC而非CGT， 從而產生對CoA的反饋抑制的抗性。另外，單獨設計用于PCR擴增coaA片段的引物對(SEQ ID N0S. 5和6)，使其包含限制性酶切位點Hindlll，并且出于與上述相同的原因而使其第 316 318位的核苷酸為密碼子GCC而非CGT。當以大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板時，在高保真DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)存在下，分別利用合成引物對SEQ ID N0S. 3和4，以及SEQ ID N0S. 5和6進行PCR，包括在96°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸2分鐘，共30個 循環。結果，獲得兩個基因片段一個片段從coaA的起始ATG密碼子開始延伸，并且在第 316 318位核苷酸具有從CGT密碼子至GCC密碼子的突變的大小約344bp的片段；另一 個片段是包含終止密碼子TAA，并且在第316 318位核苷酸具有從CGT密碼子至GCC密碼 子的突變的大小約642bp的片段。利用所述兩種片段作為模板進行PCR，所述PCR包括96°C變性60秒、50°C退火60 秒和72°C延伸2分鐘的10個循環，隨后利用引物對SEQ ID N0S. 3和6在相同的熱條件進行20個循環。結果，獲得第316 318位的CGT密碼子被取代為GCC密碼子的963bp的基 因(coaA(R106A))。用限制性酶EcoRV和HindiII消化后，通過連接將突變的coaA基因克隆至 PPro-GFP載體上，從而構建稱為pCL-P (pro) -coaA (R106A)的重組表達載體，該載體受組成 型啟動子Pro(SEQ ID NO. 9)的控制，并攜帶第106位氨基酸殘基的密碼子由CGT突變為 GCC的突變coaA基因。所述突變coaA的氨基酸序列表示為SEQ ID N0. 8。接著，將突變coaA的基因克隆到pACYC177載體中。用限制性酶處理重組質 粒 pCL-P (pro) -coaA (R106A)，以從其中切出含有 Pro 啟動子的 1. 45kb 的 coaA (R106A) 片段。將所述coaA(R106A)片段插入到此前用BamHI和HindIII處理的pACYC177載 體中，由此構建重組載體pACYC-cOaA(R106A)。在圖3中，圖示說明了重組表達載體 pCL-P (pro)-coaA (R106A)和 pACYC-coaA (R106A)的構建。<1-3>制備產0-乙酰高絲氨酸株將實施例<1_1>和<1_2>中構建的質粒pCL-P (pro)-acs和 pCL-P (pro)-coaA(R106A)轉化到菌株 CJM-X 中，然后在 LB-Sp (酵母提取物 10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壯觀霉素25 μ g/L)上培養從而針對每個轉化體選出10個壯觀霉素 抗性菌落，其中，所述CJM-X是通過從US12/062835(即，美國專利公開第US 2009-0253186 Al號)中公開的(^1^/ 讓^^)-(^中除去？讓^^)-(^質粒而構建的。另外，用實施 例<1_2>中構建的重組表達質粒pACYC-CoaA(R106A)轉化攜帶pCL_P(pro)-acs載體的 CJM-X,并在LB-Sp-Ap (酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壯觀霉素25 μ g/L、 氨芐青霉素50 μ g/L)上培養，從而選出10個具有壯觀霉素和氨芐青霉素抗性的菌落。對 其產生0-乙酰高絲氨酸的能力進行相互比較。為了檢測實施例1中制備的菌株產生蛋氨酸前體0-乙酰高絲氨酸的能力，在錐形 瓶中培養這些菌株。對于該培養，使用表1中所示的0-乙酰高絲氨酸滴定培養基(titermedium)。表1用于生產0-乙酰高絲氨酸的培養基的組成
組成濃度(幾)葡萄糖60g硫酸銨17gKH2PO4l.OgMgSO4 · 7H200. 5gFeSO4 · 7H205mg
權利要求
1. 一種能夠產生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株，其中在所述菌株中引入并增 強了 (a)乙酰-CoA合酶基因(acs)；(b)編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或(c)(a)中的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)中的泛酸激酶基因(coaA)兩者。
2.如權利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中通過利用新的啟動子或突變的啟動子 或者通過增加所述基因的拷貝數來引入并增強所述基因。
3.如權利要求2所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述新的啟動子選自由pTrC、pPro、pR 和PL組成的組。
4.如權利要求3所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述啟動子為pPro啟動子，所述pPro 啟動子具有SEQ ID NO. 9的堿基序列或其部分序列。
5.如權利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述由基因coaA編碼、對CoA的 反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的氨基酸序列在第106位不同于野生型酶(NCBI-Gene ID 948479)。
6.如權利要求5所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述氨基酸序列在第106位為丙氨酸 殘基，而不是所述野生型酶的精氨酸。
7.如權利要求6所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述氨基酸序列具有SEQID N0. 8的氨基酸序列。
8.如權利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其源自能夠產生賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸 或蛋氨酸的菌株。
9.如權利要求8所述的埃希氏菌屬的菌株，其源自的菌株中引入并增強了(a)高絲氨酸乙酰轉移酶活性；(b)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性；或(c)(a)和(b)兩者。
10.如權利要求9所述的埃希氏菌屬的菌株，其源自保藏號為KCCM10921P的菌株。
11.如權利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述(a)的菌株為大腸桿菌 CA05-0565 (保藏號 KCCMl 1023P)。
12.如權利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述(b)的菌株為大腸桿菌 CA05-0564(保藏號 KCCMl 1022P)。
13.如權利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述(c)的菌株為大腸桿菌 CA05-0566 (保藏號 KCCMl 1024P)。
14.如權利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其屬于大腸桿菌。
全文摘要
本發明公開了能夠以高產量產生L-蛋氨酸前體O-乙酰高絲氨酸的微生物株和利用所述微生物株產生O-乙酰高絲氨酸的方法。所述微生物株是埃希氏菌屬的菌株，其中，向所述菌株中引入并表達了乙酰-CoA合酶基因(acs)和/或編碼對CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)。
文檔編號C12R1/19GK102002472SQ20101014487
公開日2011年4月6日 申請日期2010年3月22日 優先權日2009年8月28日
發明者全成后, 孫晟光, 徐昌一, 李漢珍, 李相穆, 申容旭, 羅光鎬, 許仁庚, 金朱恩, 金素影, 金賢雅 申請人:Cj第一制糖株式會社