可放大的細胞培養裝置的制作方法

專利名稱：可放大的細胞培養裝置的制作方法
技術領域：
本發明是關于一種可放大的填充床細胞培養裝置，特別是一種可放大的填充床細 胞培養裝置、接種方法及細胞培養方法。
背景技術：
培養細菌、酵母菌及霉菌的大規模細胞培養制程已經廣泛發展且行之有年，而上 述物種因為都具有強韌的細胞壁及/或細胞外材質，因此具有較佳的彈性。這些彈性的微 生物結構的正是這些微生物可快速進行高效細胞培養制程的重要因素。舉例而言，細菌細 胞可生長于利用激烈攪拌、培養翻動及打氣技術的超大容積培養液中，以在生長期間達到 良好的通氣效果同時可維持培養細胞的生命力。相反地，由于真核細胞、動物細胞、哺乳類 動物細胞及/或組織相較于微生物細胞為更加地細致及脆弱，因此培養這些細胞所需的技 術往往更加困難。在一般生物反應器中微生物培養所需的激烈曝氣及攪拌所造成的巨大剪 力(shear force)很容易讓這些細胞受損。細胞培養系統的一般使用范例之一為滾瓶(roller bottle)。每個滾瓶可提供 850-3000cm2的細胞培養面積。因此，在工廠之中需要同時處理數以千計的滾瓶，因此需要 許多的勞力。自動化的滾瓶細胞培養細胞可以節省勞動，但是相當昂貴。另一種細胞培養系統為攪拌槽(stir tank)。攪拌槽之中具有微型載體 (microcarrier)，以便讓細胞在其上生長。然而，在此范例之中，攪拌培養液以及對細胞通 氣顯然仍會影響細胞生長。再者，當需要加大攪拌槽的容積時，需要改變操作條件。而改變 操作條件會大大地延緩產品開發。另一種細胞培養系統為中空纖維(hollow fiber)，其細胞密度可達到108/ml。然 而，在此范例之中，培養細胞的反應器為推流式(Plug-flow type)。當細胞密度達到預定程 度，反應器后端的細胞無法得到足夠的養份，因而造成生長被抑制。為避免這種情形，反應 器通常不會造得太大，而這就是中空纖維反應器的主要缺點。填充床(Packed-bed)生物反應器包含可提供細胞生長及保護細胞避免剪力的多 孔性基材(porous matrix)。由于多孔性基材具有大量的表面積，因此相較于其它系統可達 到較高的細胞密度。通常每一毫升的基材可輕易地達到5 10X107的細胞密度。然而，大 部分的填充床生物反應器為沿著填充床進行單向的循環流，因而形成所謂的推流式模式。 由于推流式模式的緣故，養分和氧氣都會隨著流動路徑而減少，因此形成梯度(gradient)， 并因此限制系統放大的能力。人們稱此現象為「梯度效應(gradient effect) J0梯度效應 在所有的推流式設計的裝置(例如中空纖維生物反應器及填充床生物反應器)都會發生， 因此造成這些系統在制程規模 大方面的限制。
此外，沿著填充床截面流動的模式會造成不均勻的現象。培養液在流經較低填充 密度而具有較高滲透性的區域的時候流動較快且較平順，而在流經較高填充密度而具有較 低滲透性的區域的時候流動較慢或是停止流動。此稱為隧道效應(channeling effect) 0 隧道效應會阻礙細胞生長，并且造成在具有較高填充密度的區域之處的細胞死亡。現有的接種方法為將基材槽以培養液浸沒，接著將具有高密度接種物的接種液 注入基材槽之中。一驅動裝置驅動接種物以單向流過填充床。由于填充床的作用為深度過 濾器(depth filter)，接種物從填充床的頂部到底部被捉住，因此在接種的早期會造成填 充床內細胞的梯度分布(gradient distribution)。減輕這些問題的可能方式為藉由增加 培養液的流動速率，以減少細胞的梯度效率及不均勻分布。然而，較高的流動速率會對細胞 造成剪力，并且沿著填充床垂直深度所逐漸增加的壓力也會限制流速。由于梯度效應、隧道效率及細胞在接種時期的不均勻分布，因此填充床生物反應 器的大小相當受限。一般而言，填充床類型的生物反應器的大小限制在10到30公升之內。然而，至少需要增加十倍才能使得填充床生物反應器在工業規模用途方面具有實 用性。(參考資料‘‘Packed-bed bioreactors for mammalian cell culture :Bioprocess and biomedical applications, F. Meuwly et.al. Biotechnology AdvancesVol. 25, Issue 1，January-February 2007，Pages 45-56)。因此，大小限制成為填充床型生物反應器發展的主要瓶頸。因此，在合理的流速之 下，減少養分/氧氣梯度、隧道效應、及改善接種分布是解除填充床式生物反應器的大小限 制的重要因素。現有設計的填充床細胞培養裝置，例如Freedman等人的5，501，971號美國 I禾1J，名禾爾為「Method and apparatus foranchorage and suspension cell culture」的 專利，揭示一種反應器，其包括籃架式(basket-type)填充床及包括一攪拌器的一內部液 體細胞生長液回流裝置。這種現有設計會具有所有的上述缺點，例如梯度、隧道效應及細胞 的梯度分布，因此使得填充床的大小限制在小于10L。目前亦有其它部分方法試圖解決填充床系統之中的氧氣提供問題。舉例來說， Liau 等人的 5，766，949 號美國專利，名稱為「Method and Apparatus forCultivating Anchorage Dependent Monolayer Cells」，敘述一種細胞培養系統，其中相對于生長基材上 下振蕩培養液，以試著增加細胞的含氧量。然而，Liau的發明具有許多缺點。此系統所具 有缺點之一為相當復雜。Liau的系統需要兩個外部的儲存槽及一個具有數個直立基板的分 離生長槽。需要具有數個蠕動泵將培養液由一儲存槽經由生長槽，接著循環到另一儲存槽， 然到回到第一儲存槽。由于Liau的裝置相當復雜并且組件是位于培養槽之外(例如外部 管線、儲存槽及泵，因此很容易發生污染。另外，很難以及很費力才能進行滅菌，因為裝置具 有相對大量的零件及裝置的大小。另外Liau的系統所具有的另一項問題為，流經系統的培 養液會造成流動動力的剪力，因此很容易細胞從基板脫離及移位，因而減少細胞的生命力。 此外，直立的基板也會使得細胞不易附著，因為無法立即附著到基板的細胞會因而掉落并 累積在基板的底部，因此最后這些細胞大部分都無法存活。因此，培養細胞的存活率較低， 因此蛋白質產生也隨之減少，而這個系統會需要持續的重新開始，因此非常地沒有效率及 不具生產力。再者，因為此系統較復雜，收集任何的分泌蛋白質及細胞產物都會相當費事及 費時。最后，當生長液降到相對于生長基板之下，細胞接觸到空氣，也就是直接接觸到大氣 環境，因此造成細胞死亡。
Chang等人的6，323，022號美國專禾丨』，名稱為“Highly efficient cell-cultivatingdevice”，敘述一種細胞培養系統，包括多個培養槽及一驅動裝置。培養 槽彼此相通，并且在其內具有培養液。驅動裝置使得培養液在培養槽之間流動，使得培養槽 內的培養液的水位垂直振蕩。Chang的系統的主要問題為填充床完全依靠在培養液流經時 所自我形成的靜態混合器而達到功效。這樣會造成許多的問題，例如細胞在附著到培養基 材之前即產生沉降現象，由于在培養槽內缺乏混合，因此會缺乏不均勻的養分條件因此可 能影響細胞生長，難以藉由加入堿性溶液以調整PH值，難以量測培養液內的pH值及溶氧。 由于培養液槽內缺乏混合及打氣裝置，因此造成有限的氧氣供應，是此發明的另一問題。King-Ming Chang 的 7, 033, 823 B2 號美國專禾lj，名稱為 “Cell-cultivatingdevice”，敘述一種細胞培養裝置及方法。此裝置包括一個中空的圓柱 體，其中多孔性纖維基材位于一上籃及一下籃之間，用以作為細胞的墊層。在其上有一個上 槽，在墊層基材之下有一下槽。下槽主要是由可壓縮的風箱型(bellows-type)袋子，藉此 可將液體細胞培養液回流到上槽。Chang的系統的主要問題是下槽具有很少的混合功能，因 此會在接種期間造成細胞沉降的問題。由于沒有混合的緣故，因此難以測量PH值以及調整 培養槽的PH值。此外，可壓縮的風箱型袋子設計可能會造成外漏，因而限制系統的可放大 性。有鑒于細胞及組織培養技術在生技研究、制藥研究、學術研究及生技制藥制造等 領域的重要性，并以考慮到上述的現有技術所具有的缺陷、困難及限制，本發明試著解決現 有技術的困難并減少現有技術的缺陷，本發明要提供一種細胞及組織培養設備，其可達成 長久以來所需的新穎方法及設備，以達到更具可靠度、更低復雜性、更高效率、減少繁瑣步 驟，而可放大生產規模，并生產高產率的細胞產生的細胞副產品。

發明內容
本發明的一個目的為提供一種可放大的細胞培養裝置、接種方法及培養方法，其 易于放大制程并達成高細胞密度及高產率。本發明的另一目的為提供一種可放大的細胞培養裝置、接種方法及培養方法，其 可減少一般填充床生物反應器所具有的細胞培養時曝氣及含氧的限制、可以減少梯度效應 及減少隧道效應。依據另一實施例，本發明提供一種可放大的細胞培養裝置，包括一基材槽、一混合 槽、一連通裝置、一驅動裝置及一控制裝置。基材槽具有多個多孔性基材設置于其內。混合 槽具有一混合裝置，用以混合一培養液。連通裝置用以連通基材槽及混合槽。驅動裝置用 以驅動培養液在基材槽及混合槽之間流動。控制裝置用以控制培養液在一高液面時浸沒多 孔性基材及在一低液面時露出多孔性基材。依據另一實施例，本發明提供一種可放大的細胞培養裝置的接種方法，其包括提 供一基材槽，其具有多個多孔性基材填充于其內，其中孔洞性基材之間形成多個孔隙；注入 具有一接種物的一接種液于基材槽，其中接種液滲入孔隙，并浸沒孔隙，使接種物散布于孔 洞性基材的表面。本發明的新穎接種方法與現有的接種方法之間最大的差異在于，在接種期間，現 有接種方法為將基材槽填滿培養液，而將高濃度的接種物從充滿培養液的頂部注入；而新
6穎的接種方法則是一開始基材槽并未以培養液浸沒，而直接將均勻的接種液注入到基材槽。依據再一實施例，本發明提供一種可放大的細胞培養裝置的接種方法，包括提供 一可放大的細胞培養裝置；注入具有一接種物的一接種液于基材槽，其中接種液滲入孔隙， 并浸沒孔隙，使接種物散布于孔洞性基材的表面；以及于基材槽及混合槽進行雙向的培養 液流動及補充氧氣。本發明上述及其它方式、特性及優勢可由附圖及實施例的說明而可更加了解。


圖1至圖4為示意圖，顯示依據本發明較佳實施方式的細胞培養裝置。圖5a至5e為示意圖顯示本發明之細胞接種方法及其使用裝置。圖6為柱狀圖，顯示使用本發明的新穎接種方法所得到的細胞分布結果。圖7為柱狀圖，顯示使用現有接種方法所得到的細胞分布結果。圖8為折線圖，顯示使用本發明的可放大細胞培養裝置的葡萄糖消耗。圖9為圖形，顯示使用本發明的可放大細胞培養裝置的pH值分布。圖10為圖形，顯示使用本發明的可放大細胞培養裝置的溶氧量分布。圖11為散點圖，顯示10L填充床基材槽在病毒感染之前，在垂直方向由上到下的 細胞分布。圖12為折線圖，顯示使用本發明的可放大細胞培養裝置的病毒生產分布。
具體實施例方式下列藉由實施例方式的詳細說明，并非要用以將本發明限制為任何特定的敘述實 施方式。這些詳細說明可藉由結合附圖的方式而更加容易了解，在此以參考資料方式納入。 為避免造成對先前敘述的非必要限制，下列敘述是以特定較佳實施方式討論本發明。本發明的實施方式可用以培養任何細胞，例如真核細胞及原核細胞，特別是動物 細胞及/或哺乳類細胞。本發明的實施方式可用以生產由細胞所產生的任何產品，例如重 組蛋白質、酶及/或病毒。在一本發明的較佳實施例之中，一種細胞培養裝置包含兩個腔室一混合槽及一 基材槽。混合槽包含多個開口，其可用以引入或是移除培養液或可作為其它用途。作為入 氣口或是出氣口的開口會包含空氣濾凈器。在混合槽之內或之外設置有混合裝置。混合槽 內的混合裝置較佳為螺旋槳或是攪拌葉片(stir blade)。混合槽外的混合裝置較佳為搖動 器(shaker)或是搖臂(rocker)。混合槽較佳為具有彈性及可拋棄式的；然而其也可以是 硬質的金屬、玻璃或是塑料容器。可選擇性地設置打氣裝置，以提供額外的溶氧能力。打氣 裝置可藉由攪動方式進行表面曝氣及/或額外地以氣泡進行打氣，藉以增加混合槽之中的 溶氧量。此外，基材槽也可進行間歇曝氣或曝露于氧氣以增加基材槽的溶氧量。混合槽及 基材槽之間具有至少一管子(連通裝置)以進行通連。混合槽可以一平臺支撐，平臺提供 溫度控制及混合功能以均勻化混合槽中的培養液。混合槽亦可設置PH、溶氧及溫度探針以 進行監控及制程控制。
基材槽具有作為入氣口及出氣口的開口，基材槽的上方具有開口，用以注入細胞、 培養液及緩沖液。作為入氣口及出氣口的開口設置空氣濾凈器。基材槽內設置有多孔性基 材。基材槽及/或混合槽可以一平臺支撐，平臺具有驅動裝置以在垂直方向上下移動基材 槽及/或混合槽，以調整基材槽及混合槽之間的相對高度。基材槽也可固定于穩定平臺之 上，而利用其它的驅動裝置驅動培養液流動，例如空氣壓縮器、空氣泵及壓力/真空泵。可 藉由一外部裝置控制基材槽的溫度。基材槽之中的多孔性基材可形成寬松填充的基材，以作為培養液移動時捕捉細胞 的深度過濾器，藉以盡可能地捕捉、固定及/或包埋細胞。藉由當多孔性基材由培養液浮出 時，提供很薄的氣體/培養液界面，多孔性基材也可盡可能地增加氣體及培養液之間的接 觸。多孔性基材可具有任何大小及形狀的多孔性基板，例如板狀、顆粒狀或條狀，并可以任 何架構方式建構。多孔性基材在基材槽內為隨機地設置，并形成寬松填充的深度過濾器。 每個多孔性基材都作為一個用以捕捉細胞的小型過濾器，或是作為細胞貼附的基板。然而， 每個多孔性基材之間具有夠大的孔隙空間以避免在培養液流動的過程之中造成細胞的堵 塞及纏結。多孔性基材可包括織物載體、無紡布載體、板材、多孔陶瓷載體、其它高分子材質 的多孔體、或是組織工程支架。更加特定而言，多孔性基材的較佳材料為無紡布纖維基材， 因為其可作為捕捉細胞的過濾器。更加特定而言，多孔性基材具有巨大孔洞，其孔徑大小為 50um到200um，其孔洞性大于70%。更加特定而言，依據本發明較佳實施方式的多孔性基材 可提供最大的表面積，以使捕捉細胞、進行貼附、生長及獲得氧氣。依據本發明較佳實施方 式的系統可提供簡單的方式進行收集具有細胞產回的培養液，而無需損失細胞，因為大部 分的細胞都已經被多孔性基材所捕捉。依據本發明較佳實施方式的細胞培養裝置也可保護 細胞免于直接曝露到任何空氣、氣泡或是由于空氣注入所產生的剪力，因此避免對細胞造 成傷害的方式。接著請參照圖式以作為本發明的范例，這些圖式并非用以限制本發明的范圍。請 參照圖1及圖2，其為側視圖，顯示本發明較佳實施例的一細胞培養設備。請參照圖式。基 材槽1001包含具有空氣濾凈器的開口 1003，以及在基材槽1001底部的開口 1009，以藉由 一管子或水管1010連接到混合槽1002。在管子1010之上設置開關閥1002以控制基材槽 1001及混合槽1002之間的流動。于基材槽1001之中填充多孔性基材1005。將基材槽1001 固定于由加熱板1004所環繞的支撐物1023，將基材槽1001裝設于驅動裝置1007。圖中的 驅動裝置1007是油缸或是氣缸，雙層感應器1008為設置于缸體之上，以控制缸體移動上限 及下限。混合槽1002為彈性袋，其具有一個開口 1011，并且由管子或水管1010連接到基材 槽1001。二個開口連接空氣濾凈器1016、1019以作為進氣口及出氣口，并且用以在混合時 進行培養液的曝氣。管子1021連接混合槽1002及一儲存槽或進料容器1038。于連接儲 存槽1038及混合槽1002的管子1021設置蠕動泵1039以便將培養液輸送到混合槽1002。 另一條管子1020連接到儲存槽或是收集容器1037。于連接儲存槽1037及混合槽1002的 管子1020設置蠕動泵1040以便自混合槽1002收集培養液。將混合槽1002固定于具有容 器1013、加熱板1014、搖動器1015的平臺上，加熱板1014為用以提供正確的溫度環境，搖 動器1015為用以繞著軌道旋轉或是振蕩容器1013以將混合槽1002內的培養液進行混合。 此外，可設置接種裝置以將接種液注入多孔性基材1005。在圖1之中，基材槽1001是位于相對于混合槽1002之中液面1012的下限液面，因此培養液可自混合槽1002經由管子1010流到基材槽1001，并且浸沒基材槽1001之中的 多孔性基材1005，并且將基材槽1001之中的液面1006提高到上限。請參照圖2，其顯示圖1相同的本發明較佳實施方式的細胞培養裝置，除了基材槽 1001是位于相對于混合槽1002之中液面1012的上限液面，如此使得培養液可自基材槽 1001經由管子1010流到混合槽1002，并且露出基材槽1001之中的多孔性基材1005。請參照圖3，其為本發明一較佳實施方式的細胞培養裝置，其中混合槽1002具有 設置于槽內的螺旋槳1017。基材槽1001為固定，而用以驅動混合槽及基材槽之間培養液流 動的驅動裝置是氣動裝置1034，氣動裝置1034為一氣體/真空泵，其具有設置于連接空氣 濾凈器的管子1003上的電磁閥或是時間控制器，藉以利用壓力及真空控制混合槽1002與 基材槽1001之間的培養液流動。可利用測壓組件1035更加控制基材槽1001的培養液液 面，其中測壓組件1035亦可為液面傳感器。混合槽1002于槽內設置磁性攪拌葉片或是電 磁攪棒1017，并由混合槽1002外的電磁攪拌器1033所驅動。請參照圖4，其顯示圖3相同的本發明較佳實施方式的細胞培養裝置，除了用以驅 動基材槽及混合槽之間培養基流動的驅動裝置為氣動裝置，其為氣體泵，具有電磁閥及時 間控制器1034設置于連接基材槽1001上的空氣濾凈器1003及混合槽1002上的空氣濾凈 器1003’的管子，以藉由利用壓力控制基材槽1001及混合槽1002之間的培養液流動。可 利用測壓組件1035更加控制基材槽1001的培養液液面，其中測壓組件1035亦可為液面傳 感器。混合槽1002于槽內設置磁性攪拌葉片或是電磁攪棒1017，并由混合槽1002外的電 磁攪拌器1033所驅動。請參照圖5a及圖5b，其分別為接種裝置1050的側視圖及上視圖，接種裝置1050 具有多個接種孔1051以進行接種。較佳者，接種裝置1050為環型，而接種裝置1050的接 種孔1051為對稱，但不以此為限。請參照圖5a及圖5c，在一較佳實施例之中，本發明的細胞接種及細胞培養方法包 括下列步驟對混合槽(未顯示)及包含多孔性基材1005的基材槽1001進行預先滅菌；將 混合槽固定于具有溫度控制及混合裝置的平臺，混合裝置可均勻化包含的培養液；無菌填 充培養液到混合槽，將基材槽1001固定于具有溫度控制的另一平臺；將基材槽1001以一控 制器連接空氣及二氧化碳；無菌地連接基材槽1001及混合槽；以具有細胞的培養液作為接 種液注入基材槽1001中，較佳為從多孔性基材1005上方的孔隙空間注入，直到接種液流經 多孔性基材之間的孔隙空間(通常大于1mm)并浸沒孔隙空間；間歇地以短的垂直距離上下 移動培養液，較佳為小于或是等于多孔性基材1005的平均高度，以散布細胞并使細胞平均 貼附到多孔性基材1005上；經過一段時間，在細胞固定于多孔性基材1005之后，起動驅動 裝置(未顯示)使得培養液在混合槽及基材槽1001之間間歇及交替流動，使得多孔性基材 1005可以以任何期望周期的循環浸沒或露出。藉此使得當浸沒基材1005的時候，需要的二 氧化碳及養分可以被傳送及混合，而細胞所得到的養分濃度可被控制，并且使得當露出基 材1005的時候，氧氣可藉由培養液薄膜接收而不會直接接觸到空氣。請參照圖5d及圖5e，在本發明之另一較佳實施例之中，接種裝置1050具有至少 一導管1052，導管1052具有多個孔洞1053并插入多孔性基材1005。接種液是經由導管 1052的孔洞1053流出并浸沒多孔性基材1005。由于接種液中的接種物較不易被多孔性基 材1005所阻隔，因此形成較少的垂直阻塞。
本發明的新穎接種方法與現有的接種方法之間最大的差異在于，在接種期間，現 有接種方法為將基材槽填滿培養液，而將高濃度的接種物從充滿培養液的頂部注入；而新 穎的接種方法則是一開始基材槽并未以培養液浸沒，而直接將均勻的接種液注入到基材 槽。因此，可將均勻的接種液注入基質槽而不受信道效應所干擾。此外，接種液中均勻的水 平分布可形較低的水平梯度。再者，接種液中的接種物經設置于多孔性基材的導管流動，因 此不易被由多孔性基材所形成的深度過濾器所阻塞，因此可達到更均勻的垂直分布。實施例1使用新穎細胞接種方法所得到的細胞分布準備高度為54cm、半徑為 6cm 的圓筒。以 BioNOC II 基材(CESCOBioengineering Co.，Ltd.的產品，www. cescobio. com. tw)填充圓筒。準備包含良好混合1. 1X106個細胞/ ml細胞的細胞培養液，并將其置放于具有出口與連接1/8”硅膠管的2L玻璃容器。將包含 細胞的培養液自右上方藉由蠕動泵注入，直到培養液填滿多孔性基材之間的孔隙。將圓筒 放入二氧化碳培育箱并使其靜置3小時。3小時后，自圓筒的上方，每9cm的垂直距離及每 3cm的水平距離采集基材樣本。為進行比較，使用公知方法進行另一項實驗，包括將濃縮的 接種液注入到40cm高、以BioNOC II基材填充并填滿培養液的基材槽。接著將此培養液開 始由上往下循環流動3小時。自圓筒的上方，每3cm的垂直距離采集基材樣本。圖6顯示 使用本發明的新穎接種方法所得到的細胞分布結果。圖7顯示使用現有接種方法所得到的 細胞分布結果。結果顯示在圓筒之中在垂直距離部分沒有明顯的梯度分布。然而，現有的 方法在容器之中在垂直距離部分具有明顯的細胞分布的梯度。這代表本發明的接種方法可 以減輕現有方法在填充床生物反應器之中的梯度分布。實施例2細胞培養及病毒生產所采用的培養裝置是依據圖3所建構，除了混合槽是置放在搖動器之中的彈性 袋，而非使用磁性攪拌器。也就是，混合槽為50L的彈性培養液袋，置放于具有轉速及溫度 控制的恒溫搖動器；基材槽為填充BioNOC II基材的10L玻璃槽。將混合槽及基材槽以1/2” 硅膠管連接，并夾住以停止培養液在兩槽之間的流動。培養液的流動控制是藉由具有時間 控制器的空氣泵及真空泵，并以硅膠管連接到基材槽。在泵和基材槽之間設置0. 22um空 氣濾凈器以避免污染。有50L彈性培養液袋中填以40L培養液，也就是DMEM/5%FBS。將 具有包含1 X 106個細胞/ml的MDCK細胞于7L培養液的玻璃容器由入口上方接種到填充 BioNOC II基材的10L基材槽，直到基材槽填滿培養液。接著將硅膠管上的夾子打開，以使 兩槽相連。將混合槽中的1L的培養液通到基材槽并停留30秒。接著將1L的培養液從基 材槽送回混合槽并停留30秒。此循環持續4小時，直到所有的細胞固定于基材槽之中的基 材上。在4小時之后，將基材槽中的培養液完全推到混合槽，并將基材自培養液露出，并曝 露至大氣以增加溶氧。從進料容器及收集容器進料及收集新鮮及處理后的培養液。進料及 收集速率是依照葡萄糖消耗速率，并將最低葡萄糖控制為不低于1. 0g/L。此循環持續6日， 直到基材槽的細胞濃度達到IX 107個細胞/ml。沿著垂直方向采集基材樣本以檢查細胞分 布。利用結晶紫及檸檬酸打破細胞，并使細胞核從基材釋放出來。利用血球計數器計算細 胞核。接著將106個Hmi病毒連同最后濃度為2ug/ml的TPCK處理的胰蛋白酶接種到混 合槽。繼續進行培養直到細胞被打破而釋放出病毒。每日采樣以進行病毒效價測量。結果 顯示于圖8-12。圖8顯示使用細胞培養裝置的葡萄糖消耗。藉由灌流及補充濃縮液將葡萄 糖濃度控制于1. 0g/L以上。圖9顯示使用細胞培養裝置的pH值分布。pH值為控制在7. 1到7. 2。圖10顯示使用細胞培養裝置的溶氧量分布。藉由從混合槽或是基材槽注入空氣或 是氧氣將溶氧控制在25%以上。圖11顯示IOL填充床基材槽在病毒感染之前，在垂直方向 由上到下的細胞分布。結果顯示不會產生梯度分布。圖12顯示使用細胞培養裝置的病毒 生產分布。在感染72小時之后，病毒的效價可以達到1024HA/50ul。藉由本發明可使在一 個IOL基材槽之中細胞濃度達到IXlO11的細胞，而Hmi病毒效價可達到1024HA/50ul。綜合上述，本發明提供一種細胞培養裝置、接種方法及培養方法，其可減少一般填 充床生物反應器所具有的細胞培養時曝氣及含氧的限制、可以減少梯度效應及減少隧道效 應。本發明的接種方法可增加大型填充床生物反應器之中細胞分布的均勻度。因此，本發 明提供一種細胞培養裝置、接種方法及培養方法，其易于放大到實際生產規模，因為具有特 殊設計以提供足夠的氧氣供應，減少現有填充床細胞培養裝置的梯度效應及隧道效應，并 提供改良的接種方法。
以上所述的實施例僅是為說明本發明的技術思想及特點，其目的在使本領域技術 人員能夠了解本發明的內容并據以實施，當不能以之限定本發明的專利范圍，即大凡依本 發明所揭示的精神所作的均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明的專利范圍內。
權利要求
一種可放大的細胞培養裝置，包括一基材槽，其具有多個多孔性基材設置于其內；一混合槽，其具有一混合裝置，用以混合一培養液；一連通裝置，用以連通該基材槽及該混合槽；一驅動裝置，用以驅動該培養液于該基材槽及該混合槽之間流動；以及一控制裝置，用以控制該培養液在一高液面時浸沒該些多孔性基材及在一低液面時露出該些多孔性基材。
2.如權利要求1所述的可放大的細胞培養裝置，其特征在于，該驅動裝置包含空氣壓 縮機、空氣泵、油壓或氣壓泵。
3.如權利要求1所述的可放大的細胞培養裝置，其特征在于，該驅動裝置是用以垂直 移動該混合槽或該基材槽，以改變該基材槽及該混合槽之間的相對高度。
4.如權利要求1所述的可放大的細胞培養裝置，其特征在于，該混合槽還包含一打氣 裝置，用以增加該培養液的含氧量。
5.如權利要求1所述的可放大的細胞培養裝置，其特征在于，該控制裝置包含液位傳 感器或時間控制器。
6.如權利要求1所述的可放大的細胞培養裝置，其特征在于，該基材槽更包含一接種 裝置，其用于將一接種液注入該些多孔性基材。
7.如權利要求1所述的可放大的細胞培養裝置，其特征在于，該接種裝置包含至少一 導管，其具有多個孔洞并且插入該些多孔性基材。
8.如權利要求1所述的可放大的細胞培養裝置，其特征在于，該些多孔性基材為織物 載體、無紡布載體、板材、多孔陶瓷載體、其它高分子材質的多孔體、或細胞工程支架。
9.一種可放大的細胞培養裝置的接種方法，包括提供一基材槽，其具有多個多孔性基材填充于其內，其中該些孔洞性基材之間形成多 個孔隙；以及注入具有一接種物的一接種液于該基材槽，其中該接種液滲入該些孔隙，并浸沒該些 孔隙，使該接種物散布于該些孔洞性基材的表面。
10.如權利要求9所述的可放大的細胞培養裝置的接種方法，更包括上下振蕩該接種液一段時間。
11.如權利要求9所述的可放大的細胞培養裝置的接種方法，其特征在于，該接種液的 注入是經由位于該些孔洞性基材的頂部的至少一該些孔隙。
12.如權利要求9所述的可放大的細胞培養裝置的接種方法，其特征在于，該些多孔性 基材為織物載體、無紡布載體、板材、多孔陶瓷載體、其它高分子材質的多孔體、或細胞工程 支架。
13.如權利要求9所述的可放大的細胞培養裝置的接種方法，其特征在于，該接種物包 括真核細胞、原核細胞、動物細胞或哺乳類細胞。
14.如權利要求9所述的可放大的細胞培養裝置的接種方法，其特征在于，該接種液的 注入是經由至少一導管，其具有多個孔洞并且插入該些多孔性基材。
15.一種可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，包括提供一可放大的細胞培養裝置，其包括一基材槽，其具有多個多孔性基材設置于其內，其中該些孔洞性基材之間形成多個孔隙；一混合槽，其具有一混合裝置，用以混合一培養液；一連通裝置，用以連通該基材槽及該混合槽；一驅動裝置，用以驅動該培養液于該基材槽及該混合槽之間流動；以及一控制裝置，用以控制該培養液在一高液面時浸沒該些多孔性基材及在一低液面時露 出該些多孔性基材；以及注入具有一接種物的一接種液于該基材槽，其中該接種液滲入該些孔隙，并浸沒該些 孔隙，使該接種物散布于該些孔洞性基材的表面；以及于該基材槽及該混合槽進行雙向的培養液流動以浸沒及露出該些多孔性基材。
16.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，更包含上下振蕩該接種液一段時間。
17.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該接 種液的注入是經由位于該些孔洞性基材的頂部的至少一該些孔隙。
18.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該些 多孔性基材為織物載體、無紡布載體、板材、多孔陶瓷載體、其它高分子材質的多孔體、或細 胞工程支架。
19.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該接 種物包括真核細胞、原核細胞、動物細胞或哺乳類細胞。
20.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該驅 動裝置包含空氣壓縮機、空氣泵、油壓或氣壓泵。
21.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該驅 動裝置是用以垂直移動該混合槽或該基材槽，以改變該基材槽及該混合槽之間的相對高 度。
22.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該混 合槽更包含一打氣裝置，用以增加該培養液的含氧量。
23.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該控 制裝置包含液位傳感器或時間控制器。
24.如權利要求15所述的可放大的細胞培養裝置的細胞培養方法，其特征在于，該接 種液的注入是經由至少一導管，其具有多個孔洞并且插入該些多孔性基材。
全文摘要
一種可放大的細胞培養裝置，包括一基材槽、一混合槽、一連通裝置、一驅動裝置及一控制裝置。基材槽具有多個多孔性基材設置于其內。混合槽具有一混合裝置，用以混合一培養液。連通裝置用以連通基材槽及混合槽。驅動裝置用以驅動培養液于基材槽及混合槽之間流動。控制裝置用以控制培養液在一高液面時浸沒多孔性基材及在一低液面時露出多孔性基材。此外亦提供一種可放大的細胞培養裝置的接種方法及細胞培養方法。本發明可減少一般填充床生物反應器所具有的細胞培養時曝氣及含氧的限制、可以減少梯度效應及減少隧道效應。
文檔編號C12M3/00GK101864361SQ201010165728
公開日2010年10月20日 申請日期2010年4月16日 優先權日2009年4月16日
發明者何昇龍, 張景明, 王昱麒 申請人:賽宇細胞科技股份有限公司