專利名稱：藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種成纖維細胞的培養，尤其涉及藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方 法。
背景技術：
藏羚羊(Pantholops hodgsoni)隸屬于偶蹄目牛科山羊亞科藏羚屬，青藏高原特 有物種，屬國家一級保護動物和《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)中嚴禁進行貿 易活動的瀕危動物，主要分布在中國境內的青海、西藏、新疆三省的高寒荒漠化草原、高寒 草原和高寒草甸地區，平均生活在海拔4100 5500m之間惡劣的環境中。由于環境因素導 致深入研究藏羚羊存在著很大困難，目前關于藏羚羊的研究主要以宏觀動物學研究為主， 包括動物行為、種群分布、個體生物學、系統發生學、寄生蟲、疾病的診斷和治療、羊絨的物 理和化學性質等。關于藏羚羊分子生物學和細胞生物學的研究較少。鑒于此，建立藏羚羊 細胞系以解決研究材料的問題十分必要。細胞培養技術是生命科學研究領域的重要研究技術。現代生物技術中無論是基因 治療、干細胞、動物克隆都以細胞為載體進行。細胞的生長需要一定的營養環境，用于維持 細胞生長的營養基質稱為培養基。目前商品化的常用培養基包括MEM培養基系列、DMEM培 養基系列、RPMI-1640培養基系列、199培養基系列、水解乳蛋白細胞培養基、F10、F12細胞 培養基系列等。在眾多培養基中，哪種培養基可以培養藏羚羊皮膚成纖維細胞以及建立藏 羚羊皮膚成纖維細胞系的具體方法沒有詳細報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種獲得藏羚羊皮膚成纖維細胞、為開展藏羚 羊分子生物學和細胞生物學的相關研究提供研究材料的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建 方法。為解決上述問題，本發明所述的一種藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，包括 以下步驟(1)采樣從雌性成年藏羚羊個體的耳部取1cm2皮膚組織，并將其放入裝有貯存 液的離心管中；(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養將所述步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織 依次經含有雙抗的杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)浸洗、含有雙抗的D/F12培養液沖洗后，將樣 本組織塊放入35mm培養皿中，剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預先用胎牛血清涂布的培 養瓶中，均勻地擺放于培養瓶底部；最后將培養瓶倒置放在飽和濕度二氧化碳培養箱中，3h 后翻轉培養瓶，加入3 5mL D/F12培養液繼續培養10 18天，得到生長至80% 90% 匯合的原代細胞；(3)傳代與純化將所述步驟(2)所得的原代細胞進行傳代培養；首先將原代細 胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，再用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸
4(EDTA)的混合液消化，得到消化液A ；然后將所述消化液A放入飽和濕度二氧化碳培養箱 2 3min，取出，加入與消化液A等量的D/F12培養液終止消化，得到消化液B ；將所述消化 液B經離心、去上清液后，得到細胞沉淀物A ；用D/F12培養液將所述細胞沉淀物A傳入另 一個培養瓶中，在37. 5°C、含5% C02的飽和濕度二氧化碳培養箱中繼續培養3 6天，得 到生長至80% 90%匯合的皮膚成纖維細胞；(4)細胞凍存將所述步驟(3)所得的皮膚成纖維細胞用1 2mL含0. 05%胰蛋白 酶和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，離心后加入細胞凍存液混勻，先在4°C保 存半小時，然后在-70°C冰箱中過夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存皮膚成纖維細胞；(5)細胞復蘇將所述步驟(4)所得的凍存皮膚成纖維細胞放入37°C水浴中融化， 吸出細胞懸液，用9倍所述細胞懸液體積的D/F12培養液進行洗滌，經離心、去上清后，得到 細胞沉淀物B ；用D/F12培養液充分懸浮細胞沉淀物B，并接種于培養瓶中，置于飽和濕度二 氧化碳培養箱中培養即可。所述步驟(1)中的貯存液為加入雙抗的T20 ；所述加入雙抗的T20是由占總溶液 體積的20%的胎牛血清(FBS)和80%的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎培養液 組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調節pH值至7. 2 7. 4的溶液。所述步驟(2)中的杜氏磷酸緩沖液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 0203g/100mL的 KC1、0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、 0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸鈉、0. 0075g/100mL 的青霉素、 0. 005g/100mL的鏈霉素和0. lg/100mL的葡萄糖組成。所述步驟(2)、(3)和(5)中的D/F12培養液均是由占總培養液體積的10%的胎 牛血清(FBS)、90%的D/F12和雙抗組成。所述步驟(3)中的磷酸鹽緩沖液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 02g/100mL的KC1、 0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 組成。所述步驟(4)中的凍存液是由占總溶液體積的20%的胎牛血清(FBS)、10%的二 甲基亞砜(DMS0)、70%的D/F12和雙抗組成。所述步驟(2)、(3)和(5)中的飽和濕度二氧化碳培養箱是指溫度為37. 5°C、含 5% C02的飽和濕度空氣的二氧化碳培養箱。所述雙抗是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的鏈霉素。本發明與現有技術相比具有以下優點1、本發明通過建立藏羚羊皮膚成纖維細胞的培養方法獲得藏羚羊皮膚成纖維細 胞，為開展藏羚羊分子生物學和細胞生物學的相關研究提供了研究材料。2、本發明在進行組織塊帖壁法原代培養時，通過預先對培養瓶底壁涂布血清和倒 置培養3h，有效地避免了組織塊在培養液中脫離底壁浮起，有效地提高了組織塊成活率。3、本發明采用了組織塊帖壁法進行原代培養，與酶消化法相比，所獲得的成纖維 細胞較好的保持了原有組織細胞的特性，而避免了酶消化對細胞表面蛋白質的破壞以及對 細胞特性的改變(參見圖1)。4、本發明利用皮膚成纖維細胞對消化液較上皮細胞敏感的原理，控制合適的消化 時間便可使成纖維細胞脫壁，而上皮細胞因脫壁較慢仍貼在培養瓶壁上，因此，只需經過幾 次傳代就可以得到純化的皮膚成纖維細胞(參見圖2)。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細的說明。圖1為本發明藏羚羊耳部皮膚組織經培養前消毒處理及剔除毛發處理后，采用組 織塊貼壁培養法進行原代培養，經10天培養組織塊周圍有成纖維細胞游出，環繞于組織塊 周圍。圖2為本發明原代培養的皮膚細胞經過2 3次傳代以后得到的較純的成纖維細 胞，成纖維細胞呈梭型。
具體實施例方式材料本實驗所用耳部皮膚組織供體為患有嚴重腦包蟲病的雌性成年藏羚羊個 體。藏羚羊為我課題組經國家林業局批準的人工馴養藏羚羊。試劑杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 0203g/100mL 的 KC1、 0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、 0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸鈉、0. 0075g/100mL 的青霉素、 0. 005g/100mL的鏈霉素和0. lg/100mL的葡萄糖組成。貯存液為加入雙抗的T20 ；所述加入雙抗的T20是由占總溶液體積的20%的胎牛 血清(FBS)和80%的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎培養液組成，并在配置后加 入雙抗，然后用NaOH調節pH值至7. 2 7. 4的溶液。D/F12培養液均是由占總培養液體積的10%的胎牛血清(FBS)、90%的D/F12和雙 抗組成。磷酸鹽緩沖液(PBS)是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 02g/100mL 的 KC1、0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 組成。凍存液是由占總溶液體積的20%的胎牛血清(FBS)、10%的二甲基亞砜(DMS0)、 70%的D/F12和雙抗組成。雙抗是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的鏈霉素。一種藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，包括以下步驟(1)采樣取樣時，先用滅菌的剪刀剪掉雌性成年藏羚羊個體的耳部毛發，再用剃 須刀片盡可能的剔除殘留的發根。然后用香皂、蒸餾水、新潔爾滅、生理鹽水、75%酒精、 D-PBS依次清洗，最后剪取1cm2皮膚組織，并將其放入已裝有貯存液的50mL離心管中。(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養將步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織用含 有雙抗的D-PBS浸洗5次，每次浸泡3min ；再用含有雙抗的D/F12培養液沖洗3遍后，將樣 本組織塊放入35mm培養皿中，用剪刀盡量將組織塊剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預先 用胎牛血清涂布的培養瓶中，均勻地擺放于培養瓶底部；最后將培養瓶慢慢翻轉，倒置放在 飽和濕度二氧化碳培養箱中，3h后輕輕翻轉培養瓶，加入3 5mL D/F12培養液繼續培養 10 18天，得到生長至80% 90%匯合的原代細胞。(3)傳代與純化將步驟(2)所得的原代細胞進行傳代培養；首先將原代細胞用無 Ca2+、Mg2+的PBS清洗2次，再用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0. 01 %乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，得到消化液A(消化液A以鋪滿培養瓶底為宜)；將消化液A放入飽和濕度 二氧化碳培養箱2 3min，取出，在顯微鏡下觀察消化情況，輕輕敲打底部，然后加入與消 化液A等量的D/F12培養液終止消化，得到消化液B ；將消化液B轉移至離心管中以1000 轉/分鐘離心5min，去上清液后，得到細胞沉淀物A ；用D/F12培養液將細胞沉淀物A輕輕 混勻，傳入另一個培養瓶中，在飽和濕度二氧化碳培養箱中繼續培養3 6天，得到生長至 80% 90%匯合的皮膚成纖維細胞，該皮膚成纖維細胞呈梭型(參見圖2)。(4)細胞凍存將步驟(3)所得的皮膚成纖維細胞用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶 和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，離心后加入細胞凍存液混勻，先在4°C保存 半小時，然后將細胞凍存盒直接放入-70°C冰箱中過夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存 皮膚成纖維細胞。(5)細胞復蘇將步驟(4)所得的裝有凍存皮膚成纖維細胞的凍存管從液氮中取 出，迅速放入37°C水浴中融化，吸出細胞懸液放于15mL離心管中，用9倍所述細胞懸液體積 的D/F12培養液進行洗滌后，以1000轉/分鐘離心5min，去上清后，得到細胞沉淀物B ；用 D/F12培養液充分懸浮細胞沉淀物B，并接種于培養瓶中，置于飽和濕度二氧化碳培養箱中 培養即可。上述步驟(2)、(3)和(5)中的飽和濕度二氧化碳培養箱是指溫度為37. 5°C、含 5% C02的飽和濕度空氣的二氧化碳培養箱。
權利要求
一種藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，包括以下步驟(1)采樣從雌性成年藏羚羊個體的耳部取1cm2皮膚組織，并將其放入裝有貯存液的離心管中；(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養將所述步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織依次經含有雙抗的杜氏磷酸緩沖液浸洗、含有雙抗的D/F12培養液沖洗后，將樣本組織塊放入35mm培養皿中，剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預先用胎牛血清涂布的培養瓶中，均勻地擺放于培養瓶底部；最后將培養瓶倒置放在飽和濕度二氧化碳培養箱中，3h后翻轉培養瓶，加入3～5mL D/F12培養液繼續培養10～18天，得到生長至80％～90％匯合的原代細胞；(3)傳代與純化將所述步驟(2)所得的原代細胞進行傳代培養；首先將原代細胞用磷酸鹽緩沖液清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液A；然后將所述消化液A放入飽和濕度二氧化碳培養箱2～3min，取出，加入與消化液A等量的D/F12培養液終止消化，得到消化液B；將所述消化液B經離心、去上清液后，得到細胞沉淀物A；用D/F12培養液將所述細胞沉淀物A傳入另一個培養瓶中，在37.5℃、含5％CO2的飽和濕度二氧化碳培養箱中繼續培養3～6天，得到生長至80％～90％匯合的皮膚成纖維細胞；(4)細胞凍存將所述步驟(3)所得的皮膚成纖維細胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，離心后加入細胞凍存液混勻，先在4℃保存半小時，然后在-70℃冰箱中過夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存皮膚成纖維細胞；(5)細胞復蘇將所述步驟(4)所得的凍存皮膚成纖維細胞放入37℃水浴中融化，吸出細胞懸液，用9倍所述細胞懸液體積的D/F12培養液進行洗滌，經離心、去上清后，得到細胞沉淀物B；用D/F12培養液充分懸浮細胞沉淀物B，并接種于培養瓶中，置于飽和濕度二氧化碳培養箱中培養即可。
2.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于所述步驟(1)中的貯存液為加入雙抗的T20；所述加入雙抗的T20是由占總溶液體積的20%的胎牛 血清和80%的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎培養液組成，并在配置后加入雙抗， 然后用NaOH調節pH值至7. 2 7. 4的溶液。
3.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于所述步驟(2)中的杜氏磷酸緩沖液是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 0203g/100mL 的 KC1、0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸鈉、0. 0075g/100mL 的青霉素、0. 005g/100mL 的鏈霉 素和0. lg/100mL的葡萄糖組成。
4.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于所述步驟 ⑵、(3)和(5)中的D/F12培養液均是由占總培養液體積的10%的胎牛血清、90%的D/F12 和雙抗組成。
5.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于所述步 驟(3)中的磷酸鹽緩沖液是由 0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 02g/100mL 的 KC1、0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 組成。
6.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于所述步驟⑷中的凍存液是由占總溶液體積的20 %的胎牛血清、10 %的二甲基亞砜、70 %的D/F12和 雙抗組成。
7.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于所述步驟 (2)、(3)和(5)中的飽和濕度二氧化碳培養箱是指溫度為37. 5°C、含5% C02的飽和濕度空 氣的二氧化碳培養箱。
8.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于所述雙抗 是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的鏈霉素。
全文摘要
本發明涉及一種藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，該方法包括以下步驟(1)采樣；(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養；(3)傳代與純化；(4)細胞凍存；(5)細胞復蘇。本發明通過建立原代培養、細胞傳代、細胞凍存與復蘇的方法，獲得了高活力藏羚羊成纖維細胞系，為深入開展藏羚羊分子生物學及細胞生物學的相關研究提供了研究材料與技術支持。
文檔編號C12N5/071GK101870962SQ20101020182
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月12日 優先權日2010年6月12日
發明者于鴻浩, 徐世曉, 曹俊虎, 趙新全, 郭志林, 郭松長 申請人:中國科學院西北高原生物研究所