具有抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能的基因DvCRP2、其編碼蛋白及應用的制作方法

專利名稱：具有抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能的基因DvCRP2、其編碼蛋白及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DVCRP2、其編碼蛋白及其應用。
背景技術：
隨著現代工業的發展，重金屬污染日趨嚴重。重金屬污染引發的環境和健康問題 在許多國家都有報道。鎘(Cd2+)是生物毒性最強的重金屬之一，而且Cd2+在環境中的化學 活性強、移動性大、毒性持久。自上世紀20年代起，由于采礦、冶煉、電鍍、化工等行業的快 速發展及其廢水的排放，導致水體和土壤Cd2+污染日益嚴重。水體和土壤中污染的Cd2+易 被水體生物和高等植物吸收和積累，影響它們的生長及代謝，造成農產品產量和品質下降 及生態環境的破壞。更嚴重的是水體和土壤中的Cd2+容易通過食物鏈的富集作用進入人 體，對人類健康造成嚴重的危害。環境Cd2+污染的生物修復是一種新興的綠色環境治理技術，具有很大的應用潛 力。該技術主要利用對Cd2+耐性強、吸收和富集量大的生物體(如高等植物和微生物)來 降低環境中Cd2+的含量，以達到修復的目的。從長遠來看，生物修復技術的長足進步將依賴 于Cd2+耐受和積累關鍵基因的鑒定和克隆，并通過轉基因技術培育一批高耐受、高積累Cd2+ 的生物新品種。研究發現很多綠藻對Cd2+具有很高的耐受性，如硅藻(Phaeodactylum tricornutum)可以耐受超過 400 μ M 的 Cd2+，而萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)也 可以耐受200 μ M以上的Cd2+ ；另外很多綠藻還具有很強的吸附和積累Cd2+的能力，因此綠 藻在治理水體Cd2+污染方面被公認為具有很好的應用前景。此外，綠藻特異耐Cd2+基因的 克隆可為Cd2+污染的生物修復技術提供優良基因資源。鹽藻(Dimaliella)(又稱杜氏鹽藻)是一種生存于極端環境下的真核單細胞綠 藻，對鹽脅迫具有極強的適應能力，研究表明鹽藻對Cd2+也具有較強的耐受性(Tsuji et al.，2002，2003)。但對鹽藻的研究缺乏轉化系統，不能通過成熟的遺傳學方法進行研究。利用酵母的功能互補系統克隆外源基因是一個非常有效的手段，因為酵母是真核生 物基因的優良表達系統，具有高效的轉化方法，而且酵母有可供篩選的豐富突變體。由于這一 方法通過功能互補進行篩選，因而具有高效、直接、目的性強等優點，更重要的是通過該方法可 以篩選到與酵母突變基因不同源的新基因。植物很多抗Cd2+基因是通過這一方法被克隆的，如 擬南芥的AtPCSl和AtPcrl、小麥的TaPCSl、TaTM20和TaHsfA4a及遏藍菜的TcHMA4等。因此，利用酵母功能互補系統從鹽藻中分離抗鎘基因是一個非常有效的手段，將 有可能從鹽藻中篩選獲得新的抗鎘基因，從而為提高生物體抗鎘能力、增加生物體內鎘的 積累量的基因工程提供優良基因資源。

發明內容
本發明的目的之一在于提供了一種從極端生物鹽藻(Dimaliella viridis)中分離出來的具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRP2。本發明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。本發明目的之三在于提供該基因在提高生物體抗鎘和抗銅能力中的應用。本發明的目的之四在于提供該基因在增加生物體內鎘和銅的積累量方面的應用為達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRP2，其特征在于該基因具有下列核苷酸 序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的堿基序列；2)與SEQ ID NO 1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同生物學 功能蛋白質的DNA序列。一種上述的基因DvCRP2編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具有下列氨基酸序列之1)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2)通過將SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而產生的衍生蛋白質的氨基酸序列，該衍生蛋白質與SEQ ID NO :2的蛋白具有相 同的生物學功能。一種重組載體，其特征在于該重組載體含有權利要求1所述的DvCRP2基因。一種宿主細胞，其特征在于該宿主細胞含有權利要求3所述的重組載體。上述的DvCRP2基因在提高生物抗鎘和抗銅能力中的應用。上述的DvCRP2基因在增加生物體內鎘和銅的積累量方面的應用。上述的DvCRP2基因編碼的蛋白在提高生物抗鎘和抗銅能力中的應用。上述的DvCRP2基因編碼的蛋白在增加生物體內鎘和銅的積累量方面的應用。一種克隆上述的DvCRP2基因的方法，其特征在于該方法包括如下步驟a)將酵母表達文庫通過LiAc熱擊法轉化酵母突變體Δ yapl，在150 μ M Cd2+的篩 選壓力下篩選突變表型回復的酵母轉化子，得到候選克隆；b)將步驟a)得到的候選克隆所攜帶的表達載體從酵母細胞中分離出來，轉化大 腸桿菌進行擴增；把擴增以后的載體回轉酵母突變體Ayapl，得到在150μΜ Cd2+的脅迫處 理下仍能夠正常生長的陽性克隆；c)利用限制性內切酶EcoRI/XhoI消化步驟b)得到的陽性克隆釋放出插入片段， 構建到測序載體中，通過測序獲得DvCRP2基因的部分cDNA序列；d)在步驟c)得到的部分cDNA序列上設計兩條5’ RACE弓丨物，引物序列分別為5， -cgcctgtctgcagtggccgcgacg-3，5， -gcagcacactgtgtctcaaggctctcat-3，，使用SMART RACE cDNA amplification kit 試劑盒進行 5，cDNA 擴增反應，回收 最長的擴增產物連接到測序載體上，通過測序獲得鹽藻DvCRP2基因的全長編碼序列。本發明還涉及所述的DvCRP2基因在提高生物體抗鎘和抗銅能力、增加生物體內 鎘和銅的積累量基因工程方面的應用；以及所述的DvCRP2基因編碼的蛋白質在提高生物 體抗鎘和抗銅能力、增加生物體內鎘和銅的積累量基因工程方面的應用。


圖1顯示了表達鹽藻DvCRP2基因的酵母轉化子的抗Cd2+表型。圖2顯示了表達鹽藻DvCRP2基因的酵母轉化子的抗Cu2+表型。圖3顯示了表達鹽藻DvCRP2基因的酵母轉化子中的高Cd2+積累量。
具體實施方案下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆 (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遺傳法實驗指南(Methods in Yeast Genetics :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al 編，Cold Spring Harbor Laboratory，1998出版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。實施例一 DvCRP2全長編碼區的克隆與分析將酵母表達文庫通過LiAc熱擊法轉化酵母突變體Δ yapl，在含150 μ M Cd2+的篩 選壓力下篩選突變表型回復的酵母轉化子，得到候選克隆。為了排除由于酵母基因組上自 發突變造成的假陽性，將候選克隆所攜帶的表達載體從酵母細胞中分離出來，轉化大腸桿 菌進行擴增，將擴增以后的載體回轉酵母突變體Ayapl，在150μΜ Cd2+處理下仍能夠穩定 生長得克隆即為真正的陽性克隆。對陽性克隆所攜帶的表達載體中的插入片段進行測序， 獲得DvCRP2的部分cDNA序列。 為了得到全長編碼區的cDNA序列，本發明在已知的cDNA序列上設計了兩條 5，RACE 弓丨物5，-cgcctgtctgcagtggccgcgacg-3，和 5，-gcagcacactgtgtctcaaggctctcat-3，。使用 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA amplification kit 試劑盒進行 5，cDNA 擴增 反應，回收最長的擴增產物連接到測序載體上進行測序，最終在原有cDNA的基礎上向5’端 補全了 cDNA序列，得到了鹽藻DvCRP2基因的全長cDNA序列，長度為1243bp。實施例二 DvCRP2的序列分析先后采用Blastx、tBlastx和Blastn程序將DvCRP2基因的全長cDNA序列在 NCBI相應數據庫進行同源性搜索(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov)，都沒有獲得有效的 Blast搜索結果(圖2)，表明鹽藻DvCRP2基因及其同源基因目前還沒有被克隆和研究，是 首次被發現的具有抗Cd2+功能的新基因。通 過 NCBI ORF Finder(http://www, ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/Rorf. html)對 DvCRP2基因的全長cDNA序列進行ORF預測，結果顯示DvCRP2正義鏈含有一個長333bp的 0RF(570-902bp，)。然后，通過PCR將這個預測的ORF亞克隆到pAJ401中并轉化Ayapl突 變體，轉化子的抗Cd2+表型鑒定顯示這個ORF具有和全長cDNA同等強度的抗Cd2+功能(見 實施例三)，表明所預測的DvCRP2基因的ORF是正確的。另外，在DvCRP2的cDNA序列中， 其ORF的5’端起始密碼子上游存在同框的終止密碼子，這表明DvCRP2基因的ORF是完整 的。因此，DvCRP2編碼一個110個氨基酸的蛋白質。實施例三DvCRP2在酵母中的功能分析(一 )酵母表達載體的構建
通過PCR方法，以DvCRP2的cDNA克隆為模板，擴增獲得DvCRP2的全長ORF片段。 為了構建克隆的需要，借助引物引入法，在靶序列5’端加上EcoRI酶切位點，在其3’端加 上XhoI酶切位點，引物序列如下DvCRP2+ 5' _attgaattcatgatgcatgcagaccagcg_3，DvCRP2- :5，_atctcgagtcacagtcccacatgcctct_3，將PCR擴增得到產物利用酶位點EcoRI和XhoI定向克隆至載體pAJ401中，轉化 大腸桿菌ToplO。通過酶切和測序鑒定獲得陽性克隆pAJ401-DvCRP2。(二)轉化酵母使用LiAc熱激轉化法將空載體pAJ401和DvCRP2的表達載體pAJ401_DvCRP2分 別轉化到酵母鎘敏感突變體Ayapl和酵母銅敏感突變Acupl中，同時將空載體pAJ401轉 化到相應的野生型酵母Y252和DTY3中。(三)酵母轉化子的表型鑒定將轉化pAJ401或pAJ401_DvCRP2的突變體Δ yapl轉化子細胞和轉化pAJ401的 野生型Y252轉化子細胞培養至對數期，5倍梯度稀釋(起始0D600 = 0. 5)后，取5 μ 1各梯 度稀釋菌液分別滴到含0、50、100、150及200 μ M CdCl2的YNB平板上，30°C培養6天。結 果如圖1所示，表達DvCRP2的突變體Δ yapl轉化子細胞的抗鎘能力得到了顯著的提高，并 超出了野生型酵母的抗鎘能力。將轉化pAJ401或pAJ401-DvCRP2的突變體Δ cupl轉化子細胞和轉化pAJ401的 野生型DTY3轉化子細胞培養至對數期，5倍梯度稀釋(起始0D600 = 0. 5)后，取5 μ 1各梯 度稀釋菌液分別滴到含0、25、50、75及ΙΟΟμΜ CuSO4的YNB平板上，30°C培養6天。結果 如圖2所示，表達DvCRP2的突變體Acupl轉化子細胞的抗銅能力得到了顯著的提高。(四)酵母轉化子中的鎘含量測定將轉化pAJ401或pAJ401_DvCRP2的突變體Δ yapl轉化子細胞和轉化pAJ401的野 生型Y252轉化子細胞培養至對數前期，加入終濃度為20 μ M的CdCl2,繼續培養12小時后， 收集不同酵母轉化子細胞，80°C烘干48小時，用電感耦合等離子質譜系統(ELAN DRC-e, Perkin-Elmer)測定樣品中的Cd2+含量。結果如圖3所示，表達DvCRP2的突變體Ayapl轉 化子細胞的鎘含量得到了顯著的提高，并超出了野生型酵母細胞中的鎘含量。盡管本發明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的， 即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利 要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。
權利要求
一種具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRP2，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO1所示的堿基序列；2)與SEQ ID NO1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同生物學功能蛋白質的DNA序列。
2.一種根據權利要求所述的基因DvCRP2編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具有下列氨 基酸序列之一1)具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列；2)通過將SEQID NO :2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而產生的衍生蛋白質的氨基酸序列，該衍生蛋白質與SEQ ID NO :2的蛋白具有相同的 生物學功能。
3.—種重組載體，其特征在于該重組載體含有權利要求1所述的DvCRP2基因。
4.一種宿主細胞，其特征在于該宿主細胞含有權利要求3所述的重組載體。
5.權利要求1所述的DvCRP2基因在提高生物抗鎘和抗銅能力中的應用。
6.權利要求1所述的DvCRP2基因在增加生物體內鎘和銅的積累量方面的應用。
7.權利要求2所述的DvCRP2基因編碼的蛋白在提高生物抗鎘和抗銅能力中的應用。
8.權利要求2所述的DvCRP2基因編碼的蛋白在增加生物體內鎘和銅的積累量方面的 應用。
9.一種克隆根據權利要求1所述的DvCRP2基因的方法，其特征在于該方法包括如下步驟a)將酵母表達文庫通過LiAc熱擊法轉化酵母突變體Ayapl，在150μΜCd2+的篩選壓 力下篩選突變表型回復的酵母轉化子，得到候選克隆；b)將步驟a)得到的候選克隆所攜帶的表達載體從酵母細胞中分離出來，轉化大腸桿 菌進行擴增；把擴增以后的載體回轉酵母突變體Ayapl，得到在150μΜ Cd2+的脅迫處理下 仍能夠正常生長的陽性克隆；c)利用限制性內切酶EcoRI/XhoI消化步驟b)得到的陽性克隆釋放出插入片段，構建 到測序載體中，通過測序獲得DvCRP2基因的部分cDNA序列；d)在步驟c)得到的部分cDNA序列上設計兩條5’RACE引物，引物序列分別為 5' -cgcctgtctgcagtggccgcgacg-3‘5' -gcagcacactgtgtctcaaggctctcat-3',使用SMART RACE cDNA amplification kit試劑盒進行5，cDNA擴增反應，回收最長 的擴增產物連接到測序載體上，通過測序獲得鹽藻DvCRP2基因的全長編碼序列。
全文摘要
本發明公開了鹽藻(Dunaliella viridis)抗鎘(Cd2+)和抗銅(Cu2+)基因DvCRP2的cDNA序列及所編碼蛋白質的氨基酸序列，并涉及該基因的功能和用途。本發明采用了酵母功能互補系統篩選得到了DvCRP2基因，運用RACE技術得到了全長cDNA序列，并且證明了該基因能夠顯著提高模式生物酵母的抗鎘和抗銅能力、并能顯著增加酵母細胞內鎘的積累量。所公開的全長基因及氨基酸序列為首次發現的鹽藻特有的抗鎘和抗銅基因，其在提高生物體的抗鎘和抗銅能力、增加生物體內鎘和銅的積累量基因工程方面具有應用價值。
文檔編號C12N1/19GK101921779SQ20101020143
公開日2010年12月22日 申請日期2010年6月12日 優先權日2010年6月12日
發明者余浣莎, 孟祥宗, 宋任濤, 許政暟 申請人:上海大學