專利名稱：一種原核表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域。具體的說，本發明涉及一種原核表達載體及包含 該載體的宿主細胞與該載體在重組表達生物活性蛋白中的應用。
背景技術：
大腸桿菌是目前生產重組外源蛋白的主要工程菌。然而，目前利用原核系統表達 生產重組蛋白，重組蛋白常出現以不溶的包含體(inclusion body)的形式存在、表達量 低、生物活性不高等問題。將分子伴侶(molecular chaperone或chaperone ；也稱融合伴 侶，fusion partner或融合標簽，fusion tag)和目標蛋白連接成為一個融合蛋白進行表 達是增加目標蛋白可溶性表達的常用策略之一。目前最常用的分子伴侶有谷胱甘肽轉移 酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、NusA蛋白、二硫鍵還原酶及異構酶 (Dsb家族，如DsbA、DsbC)、小泛素修飾蛋白(SUMO)及熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)等(Esposito D, Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol. 2006,17353-358 ；Betiku E. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2006，1 :66_75)。對生產重組蛋白而 言，不僅要獲得高產量可溶性重組蛋白，更重要的是要保證重組蛋白的生物學活性。特別 對于許多含二硫鍵的蛋白質，正確的二硫鍵折疊在維持蛋白質的結構和活性方面起著重要 的作用。在原核表達系統中，融合表達不僅可以提高蛋白表達量及可溶性，部分分子伴侶 還可以幫助目標蛋白正確折疊，從而保持較好生物活性。如，二硫鍵還原酶及異構酶(Dsb 家族，如DsbA、DsbC)、硫氧還蛋白(Trx)及小泛素修飾蛋白(SUMO)等能促進表達的目標 蛋白的二硫鍵的正確連接，從而使表達的目標蛋白保持天然生物活性(Marblestone JG et al.Protein Sci. 2006,15 182-189 ；Panavas T et al. Methods Mol Biol. 2009,497 303-317 ；Yasukawa T et al, J Biol Chem. 1995,270 25328-25331 ；Lauber T et al, Protein Expr Purif. 2001. 22 108-112)。為純化的方便，可在目標蛋白融合相應親和純化 標簽(affinity purification tags)，如 6Xhis_tag、GST、MBP、FLAG，BAP、Str印-II 及 CBP 等(Esposito D, Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol. 2006，17 :353_358)。然而，融合 表達不足之處是在融合表達后往往要通過特異的蛋白酶，如腸激酶、fXa等的酶切或化學裂 解除去融合標簽和分子伴侶。這就可能需要二次純化，并且引入酶切的蛋白酶價格昂貴，會 帶來成本的增加，并且可能導致非特異性切割(謝浩等.生物化學與生物物理進展.2009， 36 1364-1369) 0另外，還存在切除融合標簽后目標蛋白重新聚集形成沉淀現象。內含肽(intein)是存在于前體蛋白中的一段序列，在前體蛋白轉化為成熟蛋 白質的過程中，依靠自我剪切作用從前體蛋白中釋放出來，同時將兩端的蛋白質外顯肽 (extein)連接在一起。內含肽經誘導能夠介導N端或C端單側肽鍵斷裂。在蛋白質工程 方面，內含肽具有自我剪切特性的這種特性可以實現目標蛋白與親和標簽分離的目的。如 將編碼親和標簽、內含肽及目標蛋白的基因序列連接在一起，在合適的表達系統中表達出 一個親和標簽(Tag)-內含肽_目標蛋白的三聯體，再利用親和層析吸附標簽而截留融合 蛋白，隨后在理化因素作用下(如PH、溫度的變化或者巰基化合物的加入)該三聯體從內含肽的N-端或者C-端發生自我剪切釋放目標蛋白。新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs, NEB)根據此原理已經構建IMPACT ，如pTWim表達載體，該系統不需用蛋白酶 酶切。IMPACT 系統表達的目標蛋白與內含肽及幾丁質結合蛋白形成融合蛋白，通過幾丁 質柱親和純化融合蛋白。然后誘導純化融合蛋白中的內含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質 介質上將目標蛋白釋放出來，而內含肽與幾丁質結合蛋白(CBD)仍結合在幾丁質介質上， 達到單柱分離純化蛋白的目的。這種通過引入內含肽自我剪切親和純化而避免了外源蛋 白酶的加入以 及后期對蛋白酶的清除步驟。而且內含肽介導的裂解僅發生在剪接位點， 與目標蛋白上的蛋白酶敏感位點無關，也避免了蛋白酶對目標蛋白的降解(Chong S et al. Gene. 1997，192 :277_281 ；Sharma SS et al. J Biotechnol. 2006，125 48-56)。但目前通過內含肽介導生產重組蛋白均是先分離、純化融合蛋白，然后再對在親 和介質上的融合蛋白(如用鎳柱親和帶his-tag的融合蛋白，幾丁質介質親和帶CBD的融 合蛋白)進行誘導剪切，以獲得目標蛋白(Chong S et al. Gene. 1997，192 :277_281 ；Sharma SS et al. J Biotechnol. 2006，125 :48-56)。該法往往造成在融合蛋白表達過程中及其分 離純化過程中發生的提前剪切的目標蛋白大量損失。同時，內含肽也不能有效提高目標蛋 白的產量、可溶性表達及促進其二硫鍵的有效折疊。鉤蟲抗凝肽是從吸血寄生鉤蟲發現的一類具有顯著抗凝活性的多肽，通常由80 個氨基酸組成，含5對二硫鍵，可能開發為抗凝抗栓新藥或試劑(彭禮飛等.廣東醫學院學 報.2006,24 624-627)。其中，本發明人課題組發現的源自犬鉤蟲的抗凝肽AcaNAPlO具有 很強的抗凝活性，是凝血途徑啟動階段關鍵凝血因子-組織因子與活化的凝血因子VII復 合物(TF/fVIIa)及凝血途徑放大階段關鍵因子-活化的凝血因子XI (fXIa)的高效抑制劑 (Li Det al. Biochem Biophys Res Commun. 2010，392 155-159)，是目前唯一既能抑制 TF/ fVIIa又能抑制fXIa的抗凝物質，其作為抗凝抗栓新藥或試劑開發值得期待。為了重組表達商用蛋白，特別是希望通過原核表達系統高效地表達可溶性、保持 天然生物活性的目標蛋白，減少分離目標蛋白與融合標簽和分子伴侶所帶來的生產成本以 及較大量的獲得目標蛋白，本發明人研制了一種原核表達載體，并提供了對表達的融合蛋 白首先進行有效誘導剪切使目標蛋白與融合蛋白分離，然后再對與融合蛋白分離的目標蛋 白進行分離純化的方法，并進一步揭示了該表達載體在表達含二硫鍵的蛋白，特別是鉤蟲 抗凝肽AcaNAPlO的應用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種原核表達載體及其應用。該載體能通過分子伴侶促進 高效可溶性地表達目標蛋白并使目標蛋白，特別是含有二硫鍵的目標蛋白保持天然生物活 性。應用該載體表達的目標蛋白能通過內含肽的自我剪切作用實現目標蛋白與融合蛋白經 濟高效地分離，分離后的目標蛋白進一步分離純化，可經濟高效獲得大量目的蛋白。本發明提供了一種原核表達載體，構建本發明中所述表達載體的出發載體可為基 因工程領域中所述各種原核表達載體，如PET系列表達載體。通過基因工程常規方法可把 能促進目標蛋白可溶性表達或/和二硫鍵正確折疊的分子伴侶和能在C端自我剪切的內含 肽編碼核苷酸序列連接入出發載體中。該載體通過分子伴侶促進高效可溶性表達目標蛋白 或/和目標蛋白的二硫鍵正確折疊以提高目標蛋白產量并保持天然活性，并通過融合在分子伴侶的內含肽的C末端的自我剪切作用使目標蛋白與融合蛋白分離。所述的分子伴侶與 內含肽之間可由或長或短一段序列(編碼柔性氨基酸區)連接。該載體也可基于根據純 化需要在融合伴侶中設計親和標簽，如6Xhis-tag、GST、MBP, FLAG, BAP、Strep-II, CBD及 CBP等(Esposito D, Chatterjee DK. Curr Opin Biotechnol. 2006，17 :353_358)，用于簡單 快捷親和層析除去還沒有剪切完的融合蛋白，如可用幾丁質柱親和除去帶CBD的沒有剪切 完的融合蛋白。常見的能促進目標蛋白可溶性表達或/和二硫鍵正確折疊地方融合的融合 伴侶有谷胱甘肽轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、NusA蛋白、二硫 鍵還原酶及異構酶(Dsb家族，如DsbA、DsbC)、小泛素修飾蛋白(SUMO)及熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)等，但不僅限于上述蛋白。能在C端自我剪切的內含肽包括mini Ssp DnaB(Mathys S et al. Gene. 1999，231 1-13)及See VMA(Chong S et al. Gene. 1997,192 277-281)等，以mini Ssp DnaB為佳，但不僅限于上述蛋白 。利用發明載體高效融合表達的目標蛋白與融合蛋白的通過自我剪切分離，可在 0°C 40°C下，較佳的是在低溫條件下，如0°C 20°C下，PH為6. 0 8. 0的緩沖液中進行。 在低溫下進行自我剪切能避免或減少對目的蛋白的降解。與融合蛋白分離后的目標蛋白的 分離、純化方法有可以根據目標蛋白的大小、帶電荷及等電點等理化性質，用相應的常規 純化技術進行分離純化；為純化方便，也可在表達的目標蛋白中設計親和標簽，如在目標蛋 白的N末端或C末端融合His-tag后，可用鎳親和層析進行快速方便純化目標蛋白；還可利 用目標蛋白的抗體進行親和純化。對于還沒有切割完的融合蛋白需要除去，可在融合伴侶 中設計不同于目標蛋白帶有的親和標簽的親和標簽，通過親和層析除去沒有切割完的融合 蛋白，也可以根據分子伴侶及融合蛋白的大小、帶電荷及等電點等理化性質，用常規的層析 技術、分子篩技術等除去沒有切割完的融合蛋白。本發明的一個應用在于應用發明的表達載體經濟高效地獲得保持天然生物活性 的目標蛋白，特別是含二硫鍵的生物活性蛋白，如水蛭素、鉤蟲抗凝肽、蛋白酶抑制劑等。鉤 蟲抗凝肽AcaNAPlO (SEQ ID NO. 1)是目前唯一對凝血途徑啟動階段關鍵凝血因子-組織因 子與活化的凝血因子VII復合物(TF/fVIIa)及凝血途徑放大階段關鍵因子-活化的凝血 因子Xl(fXIa)的均有抑制作用的高效抑制劑。應用本發明載體表達AcaNAPlO或其保守性 變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生物，可以作為抗凝抗栓藥物或制劑進行開 發應用。本發明的其它方面由于本文技術內容的公開，對本領域技術人員是易于理解并實 施的。例如，利用線性連接技術或PCR技術等，把僅含目標蛋白編碼核苷酸序列連接入本發 明載體，可以獲得沒有帶任何自身之外的氨基酸殘基序列的目標蛋白；一種涉及分離純化 自我剪切后的目標蛋白的方法，可根據目標蛋白性質進行分離、純化等；利用本發明特點可 以涉及一種基于PET表達載體之外的其它原核表達載體出發構建的具有本發明特點的原 核表達載體；一種用含有本發明表達載體表達生物活性蛋白的遺傳工程化的宿主細胞等。因此，本發明載體一方面通過分子伴侶提高表達目標蛋白的產量、可溶性及保持 目的蛋白天然生物活性；另外一方面，通過內含肽的自我剪切實現目標蛋白與融合蛋白經 濟高效地分離，減少使用腸激酶、fXa等的酶切或化學裂解除去融合標簽和分子伴侶及進行 二次純化帶來的成本；第三方面，通過內含肽的自我剪切作用實現目標蛋白與融合蛋白經 濟高效地分離后，再對與融合蛋白分離后的目標蛋白進行進一步的分離純化，可以減少在融合蛋白表達過程中及其分離純化過程中發生的提前剪切的目標蛋白大量損失。
圖1表達載體pICET32質粒圖。
圖2表達載體pICET32完整核酸序列。圖3在大腸桿菌BL21(DE3)宿主中中，用pICET32表達含有5對二硫鍵的鉤蟲抗 凝肽 AcaNAPlO (SEQ ID NO. 1)的 SDS-PAGE 電泳圖。圖4在大腸桿菌BL21(DE3)宿主中中，用pICET32表達含有3對二硫鍵的Kunitz 型絲氨酸蛋白酶抑制劑AduKuM的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式下面結合具體實例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施僅用于說明本發明而不 用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 分子克隆實驗指南(第3版)([美]J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著.黃培堂等譯，科學出版 社，2002年)，精編分子生物學實驗指南(第5版)([美國]F.M.奧斯伯，R.布倫特編.金 由辛，包慧中，趙麗云譯.科學出版社，2008年)所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1表達載體pICET32的構建以pET32a出發載體，pET32a具有T7高效啟動子，含硫氧還蛋白TrxA，是目前常用 促進蛋白可溶性高效表達載體之一。設計上游引物DPl 5’-CATGGCCATATGAAAATCGAAGAAGG TAAAC-3’(下劃線即斜體部分為限制性內切酶Msc I酶切位點)及下游引物DP2 5'-GTCCA TGGCCGTTGTGTACAATGATGTCATTC-3，用pfu酶從表達載體pTWim (NEB公司產品)擴增獲得 幾丁質結合域(CBD)及內含肽mini SspDnaB編碼核苷酸序列，以此產物為模板，用上游引 物 DPl 與新設計引物 5’ -GTACACAACGGCCATGGACATCATCATCATCATCATGGATCC-3，擴增獲得第 二輪產物。通過此輪擴增引入限制性內切酶NcoI酶切位點及6Xhis tag編碼序列。以第 二輪擴增為模板，用引物DPl與新設計引物5’-TGCTCGAGTAAGCTTTGAATTCGGATCCATGATGATG ATG-3’(下劃線即斜體部分為限制性內切酶Xho I酶切位點)擴增獲得第三輪產物。通過 第三輪擴增引入限制性內切酶BamH I.EcoR I.Hind III及Xho I酶切位點。第三輪產物 經Msc I及Xho I雙酶切后，連接入同樣經Msc I及Xho I酶切的pET32a載體。連接的載 體轉入E. coli DH5 α，構建質粒經酶切及測序鑒定正確，成功獲得構建目標載體pICET32。pICET32質粒圖見附圖1，核酸序列見附圖2。該載體是基于pET32a出發的構建的 載體，具有原核表達系統所需的基礎元件。具有T7高效啟動子，含有分子伴侶硫氧還蛋白 (TrxA)促進目標蛋白高效可溶性表達并使目標蛋白保持天然生物活性，通過含肽mini Ssp DnaB的自我剪切內可實現目標蛋白與融合蛋白分離。為純化需要，在內含肽中融合了親和 標簽幾丁質結合域(CBD)，在硫氧還蛋白及Ssp DnaB相互之間連接區段均有相應柔性區。 在mini Ssp DnaB編碼序列的3’端依次為多克隆位點、6Xhis tag編碼序列、多克隆位點 及6Xhis tag編碼序列。也可通過PCR實現目標蛋白與內含肽的無縫連接，使獲得的目標 蛋白不帶本身之外的氨基酸序列。實施例2用pICET32表達鉤蟲抗凝肽AcaNAPlO及其分離與純化根據犬鉤蟲抗凝肽AcaNAPlO (SEQ ID NO. 1)編碼序列設計引物從犬鉤蟲成蟲cDNA中擴增編碼核酸序列，設計出引物序列為N10-3 :5，-GAGGATCCAATCCAAGCTGTGGTGAG-3，( 含內切酶位點 BamH I) ；N11-2 :5，-CGAAGCTTGGTCATTTTCTATTAGGG-3，(含內切酶位點 Hind II I)。PCR產物回收純化后，用BamH I和Hind III進行雙酶切，與經同樣雙酶切的表達質粒 PICET32過夜連接。連接產物轉化至E. coli DH5 α感受態細胞中，在含氨芐青霉素的培養 基中培養。經PCR及測序鑒定的重組克隆質粒命名為AcaNAP10/pICET32。重組表達質粒轉 化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞。在含氨芐青霉素的LB培養液中培養含重組表達質粒 AcaNAP10/pICET32宿主菌BL21 (DE3)，1. Ommol/L終濃度的IPTG誘導。離心收集菌體，經超 聲破碎后收集上清，以1 4(上清緩沖液)的比例加入不同pH值(分別為ρΗ6. 0、ρΗ6· 4、 ρΗ6· 8、ρΗ7. 2、ρΗ7. 6、ρΗ8. 0)的 IOX 磷酸鹽緩沖液置于 4°C、16°C、30°C、40°C裂解，分別于 48小時內每間隔6小時取樣進行SDS-PAGE觀察裂解效果，用軟件Quantity One 4. 52分 析裂解效率。取相應裂解上清用Ni-IDA親和純化，經幾丁質柱親和除去還沒有裂解的融合 蛋白，流穿液即為目標蛋白，可除咪唑濃縮后備用。純化目標蛋白用PT及aPTT法檢測體外 抗凝活性(方法參照 Li D et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010，392 155-159)。同 時，用pTWim載體表達AcaNAPIO，按照說明書制備重組AcaNAPIO，制備好的蛋白用作對照。 用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定純化蛋白濃度。
結果表明重組質粒pICET32/AcaNAP10在大腸桿菌中得到高效可溶性表達，95% 以上目標蛋白(融合蛋白)為可溶蛋白，融合蛋白量可達宿主總蛋白的40%左右(圖3泳 道1)。在每升LB培養基中，獲得可溶性融合蛋白量可達250mg以上。用pICET32制備的 AcaNAPlO的可溶性及產出量均比pTWim顯著提高。純化獲得了 N末端帶6Xhis tag的 AcaNAPIO，蛋白分子量大小約為20Kda(形成了二聚體)(圖3泳道3)，沒有剪切及目標蛋 白剪切后的融合蛋白大小分別約為49kDa，39kDa(圖3泳道1)，與理論預測相符。在LB培 養基中，最終獲得的純化rAcaNAPIO量可達70mg/L以上。用pICET32及pTWim表達的蛋 白在表達及宿主菌分離、裂解破碎過程均發生了提前自我剪切。如圖2泳道1，PICET32在 誘導表達及收集宿主菌進行破碎裂解的過程中，有超過三分之一的融合蛋白已發生自我剪 切。在4°C放置12小時后，有80%以上的融合蛋白已完成自我剪切裂解，在4°C放置18小 時的融合蛋白已基本上完成自我剪切裂解(圖3泳道2)，在4°C放置36小時的融合蛋白幾 乎全部完成自我剪切裂解。在4°C中進行自我剪切，放置至48小時內的目標蛋白及融合伴 侶均沒有明顯降解。隨機進行5次蛋白表達純化及活性檢測對照表明，用PICET32載體制 備的重組AcaNAPIO (4°C，pH6. 4磷酸鹽緩沖液，自我剪切36小時后純化蛋白)延長2倍PT 所需濃度為30. 5 士4. 2nM,而用pTWim載體制備的重組AcaNAPIO延長2倍PT所需濃度為 58. 3士3. 8nM，即用pICET32載體制備的重組AcaNAPlO活性顯著要高。實施例3絲氨酸蛋白酶抑制劑AduKuM的表達及其分離純化AduKuH是發明人課題組從十二指腸鉤蟲分離出來的一種Kunitz型絲氨酸蛋 白酶抑制劑，含有3對二硫鍵，其成熟肽氨基酸序列為RNPHRKGRCGDDPAETGGECPDPETKYT YKFGDCHEVKYCGEQETRNLFDSYEKCSGKCVIF。根據AduKuI4成熟肽編碼序列，設計上游引物 5，-TAGGATCCCGCAATCCTCACAGAAAG -3，及下游引物5，-CCAAGCTTAGAAGATCACGCACTTTCC -3’，從十二指腸鉤蟲成蟲cDNA中擴增獲得成熟肽編碼序列。擴增產物連接入表達載體成 功構建PICET32/AduKuI4表達質粒。質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，經誘導培養，離心收 集菌體，超聲破碎后收集上清，以1 4(上清緩沖液)的比例加入不同pH值(分別為ρΗ6· 0、ρΗ6· 4、ρΗ6· 8、ρΗ7· 2、ρΗ7· 6、ρΗ8· 0)的 IOX 磷酸鹽緩沖液置于 4°C、16°C、30°C、40°C 裂解，分別于48小時內每間隔6小時取樣進行SDS-PAGE觀察裂解效果。取相應裂解上清 用Ni-NTA親和純化，經幾丁質柱親和除去還沒有裂解的融合蛋白，流穿液即為目標蛋白。
結果表明AduKuI4得到高效可溶表達，目標蛋白(融合蛋白)幾乎全部可溶，可 溶融合蛋白總量可達細菌總蛋白量50%以上。從裂解下來的融合伴侶可以看出，在誘導表 達及細菌破碎過程中即有50%以上可溶蛋白已發生提前自我剪切(圖4泳道2)。各溫度 下均能誘導剪切，24小時后，融合蛋白均絕大部分剪切(圖4泳道3、4分別為宿主菌上清 在4°C及40°C下經內含肽自我剪切后的裂解情況)，取相應裂解上清用Ni-IDA親和純化，經 幾丁質柱親和除去還沒有裂解完的融合蛋白，獲得目標蛋白，大小約為8kDa，與理論預測相 符(圖4泳道5、6、7)。在LB培養基中，最終獲得的純化rAduKuI4量可達80mg/L以上，即 AduKu14得到高效可溶表達。
權利要求
一種原核表達載體，其特征在于含有(a)促進目標蛋白可溶性表達或/和二硫鍵正確折疊的分子伴侶的編碼核苷酸序列；(b)能在C末端肽鍵斷裂的內含肽的編碼核苷酸序列。
2.據權利要求1所述的一種原核表達載體，其特征在于，宿主細胞是大腸桿菌。
3.據權利要求1所述的一種原核表達載體，其特征在于，所述分子伴侶能促進目標蛋 白可溶性表達或/和二硫鍵正確折疊，使表達的目標蛋白保持有天然生物活性；所述內含 肽能在一定條件下被有效誘導C末端的肽鍵裂解，使目標蛋白與融合蛋白分離。
4.據權利要求3所述的一種原核表達載體，其特征在于，所述分子伴侶包括硫氧還蛋 白、二硫鍵還原酶及異構酶、小泛素修飾蛋白、NusA及谷胱甘肽-S-轉移酶；所述的內含肽 包括 mini Ssp DnaB、See VMA 等，以選用 mini Ssp DnaB 為佳。
5.據權利要求1所述的一種原核表達載體的應用，其特征在于，表達的目標蛋白是具 有生物活性的蛋白或多肽，特別是含有二硫鍵的生物活性蛋白或多肽，包括鉤蟲抗凝肽及 其保守性變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生物。
6.據權利要求2所述的一種原核表達載體，其特征在于，一種宿主細胞包含有權利要 求5所述的載體。
7.據權利要求5所述的一種原核表達載體的應用，其特征在于，目標蛋白與融合蛋白 有效分離是在0°C 40°C下，較佳在0°C 20°C下，pH為6. O 8. O的緩沖液中進行。
8.據權利要求7所述的一種原核表達載體的應用，其特征在于，從融合蛋白中分離出 來的目標蛋白的分離、純化方法包括用親和層析純化融合有親和標簽，如帶His-tag的目 標蛋白，或用制備的抗體親和純化目標蛋白，或根據目標蛋白的理化性質進行層析純化。
9.據權利要求5所述的一種原核表達載體的應用，其特征在于，(a)在合適的培養基中培養權利要求6所述的宿主細胞；(b)據權利要求7所述條件下，進行目標蛋白與融合蛋白的有效分離；(c)據權利要求8所述方法進行目標蛋白的分離與純化。
10.據權利要求5—種原核表達載體的應用，其特征在于，目標蛋白包括由SEQ ID NO. 1氨基酸序列組成的多肽或其保守性變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生 物。
全文摘要
一種原核表達載體及其應用，載體包含有(a)促進目標蛋白可溶性表達或/和二硫鍵正確折疊的分子伴侶和(b)能在C末端肽鍵斷裂的內含肽的編碼核苷酸序列。該載體通過分子伴侶促進高效可溶性表達目標蛋白并使目標蛋白保持天然生物活性，而且，通過在一定條件下有效誘導內含肽的自我剪切作用使目標蛋白與融合蛋白分離后，再分離、純化目標蛋白，可以經濟高效地獲得保持有天然生物活性的目標蛋白。本發明還涉及包含上述載體的宿主細胞及上述載體在重組表達生物活性蛋白中的應用。
文檔編號C12N15/74GK101967493SQ20101020483
公開日2011年2月9日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者廖淑莉, 彭禮飛, 楊陳, 殷環, 甘偉瓊, 鄧莉 申請人:廣東醫學院