專利名稱：人hcrcn81的原核重組質粒及其所表達的蛋白與兔抗人多克隆抗體及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種原核重組質粒及其所表達的蛋白與兔抗人多克隆抗體及用途。
背景技術：
近年來，惡性腫瘤對人類的威脅日益突出，腫瘤已成為死亡常見原因之一，嚴重影響著人類的健康。癌癥是一種常見的惡性腫瘤，在其發生和發展過程中，已經發現一些致癌基因的激活(如survivin、c_myc、Bcl-2等)和抑癌基因的失活(如p53、DCC> nm23、APC> PTEN、DPC4等)，所述致癌基因和抑癌基因與人癌癥的發生、發展有密切關系，但是至今還有許多的致癌基因、抑癌基因尚未發現。
人hcrcn81基因已在GenBank注冊，注冊號NM_001013649. 3，定量熒光PCR顯示，人hcrcn81基因的mRNA的表達在結直腸腺癌組織中下調，NM_001013649. 3在腫瘤組織中的低表達可能導致相應蛋白在惡性腫瘤細胞中的低表達，從而導致相關癌基因的激活及抑癌基因的失活，hcrcn81可能與結直腸腺癌的發病有關(見Qin Jiang, Chunle Zhang, Yao Chen . NM_001013649. 3 gene is down-regulated in human colorectal adenocarcinoma. Molecular Medicine Reports. 2011 ;4(6) : 1279-1281)。因此，有必要進一步研究HCRCN81蛋白質在人惡性腫瘤中的作用。
抗體是在對抗原刺激的免疫應答中，B淋巴細胞產生的一類糖蛋白。它是能與相應抗原特異的結合，產生各種生理效應的球蛋白。多克隆抗體是人類有目的地利用抗體的第一步，其在生物醫學等方面的應用已有上百年的發展歷史。多克隆抗體能有效提高抗原攝取、加工和識別，因此，有必要制備新型多克隆抗體，為進一步研究hcrcnSl基因的功能提供工具。發明內容
本發明的目的是提供一種人hcrcn81的原核重組質粒、重組人HCRCN81蛋白質和兔抗人多克隆抗體，并證明所述兔抗人多克隆抗體可用于檢測人癌細胞和人組織中 HCRCN81蛋白質的表達，為研究hcrcn81基因在人癌癥發生發展中的作用和地位提供有用的工具。
人hcrcn81基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所述。本發明所述原核重組質粒，由序列表中SEQ ID NO. I中的基因片段與原核表達載體構建而成，所述基因片段是 SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列，所述的基因片段正向插入原核表達載體。
本發明所述原核重組質粒，其原核表達載體為pET質粒系統，包括pET_28a、 pET_30a、pET_32a 或 pET32a (+)。
本發明所述重組人HCRCN81蛋白質，由上述原核重組質粒表達而成,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
本發明所述兔抗人多克隆抗體，由上述重組人HCRCN81蛋白質免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清純化得到，其制備方法依次包括以下步驟
(I)通過RT-PCR反應，獲得人HCRCN81蛋白質編碼基因，即序列表SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列；
(2)將步驟(I)擴增的人HCRCN81蛋白質編碼基因插入到原核表達載體構建原核重組質粒，再將所述原核重組質粒轉化至感受態細菌中進行培養，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；
(3)利用PCR擴增和限制性內切酶酶切圖譜分析所述原核重組質粒，并進行DNA序列分析；
(4)將正確克隆的原核重組質粒轉化工程菌中進行表達，分離純化表達的蛋白即獲得重組人HCRCN81蛋白質；
(5)采用SDS-PAGE、質譜分析鑒定重組人HCRCN81蛋白質的正確性；
(6)將所述重組人HCRCN81蛋白質免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清；
(7)采用抗原親和純化方法從步驟(6)所收集的抗血清中獲得兔抗人多克隆抗體 (Anti-HCRCN81)。
本發明用雷帕霉素處理結腸癌細胞，并對處理之前和處理之后的結腸癌細胞所表達的總蛋白進行Western blot試驗,驗證所述兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)對結腸癌細胞表達的HCRCN81蛋白的檢測效果。
本發明提取人結直腸癌組織和正常結直腸組織的總蛋白，并對所提取的總蛋白進行Western blot試驗,驗證所述兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)對人結直腸癌組織和正常結直腸組織所表達的HCRCN81蛋白的檢測效果。
實驗結果表明，本發明所述兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)對人癌細胞和人組織所表達的HCRCN81天然蛋白均具有檢測作用，可在制備檢測人癌細胞和人組織中 hcrcn81基因所表達的蛋白質的檢測劑方面應用。
本發明具有以下有益效果
本發明首次制備了重組人HCRCN81蛋白質，并提供了一種新型兔抗人多克隆抗體，實驗結果表明，本發明所述兔抗人多克隆抗體對人癌細胞和人組織中的所表達的 HCRCN81天然蛋白均具有檢測作用，因而有助于研究hcrcnSl基因在人癌癥發生發展中的作用和地位。
圖I是原核表達載體pET32a(+)的結構示意圖。
圖2是本發明所述人hcrcn81的原核重組質粒pET32a(+)/hcrcn81的結構示意圖。
圖3是本發明所述人hcrcn81的原核重組質粒pET32a(+)/hcrcn81的測序圖。
圖4是本發明所述人hcrcn81的原核重組質粒pET32a(+)/hcrcn81的PCR電泳圖，圖中 M:DM2000 Plus Marker，從上到下依次為 8000、5000、3000、2000、1000、750、500、 250、lOObp。
圖5是本發明所述人hcrcn81的原核重組質粒pET32a⑴/hcrcn81轉化BL21(DE3)pLysS感受態細菌所表達的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖中，M :PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是 250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ;1，2 : BL21 (DE3) pLysS (pET32a)分別 0，ImM IPTG 誘導；3-6 :BL21(DE3)pLysS (pET32a: :hcrcn81)分別 0，0· 01，0· 1，ImM IPTG 誘導。
圖6是本發明所述人hcrcn81的原核重組質粒pET32a (+) /hcrcn81轉化 BL21(DE3)pLysS感受態細菌超聲后上清和沉淀所表達的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖中，M :PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ；1, 2 0mM IPTG誘導上清和沉淀；3, 4 0. ImM IPTG誘導上清和沉淀。
圖7是純化后的重組人HCRCN81蛋白質的SDS-PAGE電泳圖，圖中，M =PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是 250、150、100、70、 50、40、30、20、15、10kD ;1 :流穿液；2-7 :分別為 10、20、50、100、250、500mM 咪唑洗脫液。
圖8是重組人HCRCN81蛋白質電洗脫后SDS-PAGE電泳圖，圖中，M =PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),從上到下分別是 250、150、100、 70、50、40、30、20、15kD ;1 :電洗脫蛋白；2 :濃縮濾液；3 :lmg/ml BSA 標準品。
圖9是重組蛋白質HCRCN81的質譜分析圖表。
圖10是本發明所述兔抗人多克隆抗體(Anti-HCRCN81)純化后的SDS-PAGE檢測圖，圖中，I為蛋白Marker ；2為CWRA320抗原親和純化兔抗人多克隆抗體；3為CWRA321抗原親和純化兔抗人多克隆抗體。
圖11的圖(a)是使用兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81),通過Western blot方法檢測結腸腺細胞株SW480中HCRCN81的蛋白表達圖，圖(b)是使用兔抗人多克隆抗體 (Anti-HCRCN81)，通過Western blot方法檢測結腸腺細胞株LoVo中HCRCN81的蛋白表達圖；圖中，SDS-PAGE 顯示 HCRCN81 蛋白在結腸腺細胞株 SW48(TKAPA、SW48(Tdms° 和 LoVc^APA、 LoVo_dms°中的電泳條帶，SW480_kapa代表經雷帕霉素處理的結腸腺細胞株SW480，SW480_dms°代表經DMSO處理的結腸腺細胞株SW480，L0V0-kapa代表經雷帕霉素處理的結腸腺細胞株LoVo， LoVo_dms°代表經DMSO處理的結腸腺細胞株LoVo，β -actin為內參照蛋白。
圖12是使用兔抗人多克隆抗體(Anti_HCRCN81)、通過Western blot方法檢測結腸結腸癌組織和正常組織中HCRCN81的蛋白表達圖，其中，圖(a)為第一病人的檢測圖，圖中，Tl為第一病人直腸癌的腫瘤組織樣本，NI為第一病人腫瘤旁5cm正常組織樣本；圖(13) 為第二病人的檢測圖，T2為第二病人直腸癌的腫瘤組織樣本，N2為第二病人腫瘤旁5cm正常組織樣本。
具體實施方式
實施例I :人hcrcn81的原核重組質粒的構建
根據目的序列(序列表SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列)， 設計全基因合成引物，表 I 中 hcrcn81_lF、hcrcn81_3F、hcrcn81_5F、hcrcn81_7F、 hcrcn81_9F、hcrcn81_llF、hcrcn81-13F 為正義鏈引物，表 I 中 hcrcn81_2R、hcrcn81_4R、 hcrcn81_6R、hcrcn81_8R、hcrcn81_10R、hcrcn81_12R、hcrcn81-14R 為反義鏈引物，上游引物hcrcn81_lF添加EcoRI酶切位點(劃線處)，下游引物hcrcn81_14R添加HindIII酶切位
表I :全基因合成引物序列
引物名稱序列(5’ 一3’)hcrcn81-lFCCGGAATTCATGGAGGCGGGGCCGCATCCCCGGCCGGGGCACTGCTGhcrcn81-3FCGGCTGGACATGAACCACGGCTTCGTGCACCATATCCGACGGAACCAGATCGCTCGGGAhcrcn81-5FGAAGCAGGCGGCCAAGGAGAAGGTGAGGAGGCGGCACACGCCCGCGCCGAChcrcn81-7FGCAGGTGTACCTGCCGCGACACCGAGATGTCTCTGCCCACCCACGCAACCCAGACTAhcrcn81—9FAGCAGTAGTGGAGGCTCTGAGCTGGAGCCTTCTGGCCATCAGCTCTTCTGCTTAGAATAhcrcn81-llFGGTCACATCAGTTATCGTCTATCAGGGTGATGACCCAGGAAAGGTGAGTGAGAAGGhcrcn81-13FCGCCTCTGGATCCACCCATGCGAGAAGCCCTCAAGTTGCGTATCCAGGAGGAhcrcn81-2RCGTGGTTCATGTCCAGCCGCCCCCCAGGCTTGCAGCAGTGCCCCGGCCGGGGATGCGGChcrcn81—4RCTTCTCCTTGGCCGCCTGCTTCACCTTCTTGTCATAGTCGTCCCGAGCGATCTGGTTCChcrcn81-6RTCGCGGCAGGTACACCTGCAGGTCTGGCTTGCGGGGCCGCGTCGGCGCGGGCGTGTGhcrcn81-8RCTCAGAGCCTCCACTACTGCTGCTTTCACCGGACTCTTCATAGTCTGGGTTGCGTGGGhcrcn81-IORGACGATAACTGATGTGACCTCTCCACTGTCTGCCTCGTATTCTAAGCAGAAGAGCThcrcn81-12RATGGGTGGATCCAGAGGCGTGTGTGCCGACACCTTCTCACTCACCTTTCChcrcn81-14RCCCAAGCTTTTATCAGTGTTGGCTCTGGCGCTTTGCAATCTCCTCCTGGATACGCAACT
將第一組引物hcrcn81-lF,hcrcn81- 2R, hcrcn81- 3F, hcrcn81-4R, hcrcn81-5F, hcrcn81-6R, hcrcn81_7F,hcrcn81_8R 混合,PCR 擴增得 hcrcn81 片段 I,PCR 反應體系見表2 ;將第二組引物hcrcn81-9F, hcrcn81-10R, hcrcn81-llF, hcrcn81-12R, hcrcn81-13F, hcrcn81_14R 混合，PCR 擴增得 hcrcn81 片段 2，PCR 反應體系見表 3。
表2 PCR反應體系I
體系I成分體積(μ I)IOXEs Taq buffer5dNTP(2. 5mM each)4MgCl2 (25mM)權利要求
1.一種人hcrcn81的原核重組質粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO. I中的基因片段與原核表達載體構建而成，所述基因片段是SEQ ID NO. I中第73位至第573位的核苷酸序列，所述的基因片段正向插入原核表達載體。
2.根據權利要求I所述人hcrcnSl的原核重組質粒，其特征在于原核表達載體為pET 質粒系統，包括 pET-28a、pET-30a、pET_32a 或 pET32a (+)。
3.—種重組人HCRCN81蛋白質，其特征在于由權利要求I或2所述的原核重組質粒表達而成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
4.一種兔抗人多克隆抗體，由權利要求3所述重組人HCRCN81蛋白質免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清純化得到。
5.根據權利要求4所述兔抗人多克隆抗體，其特征在于制備方法依次包括以下步驟(1)通過RT-PCR反應，獲得人HCRCN81蛋白質編碼基因，即序列表SEQID NO. I中第 73位至第573位的核苷酸序列；(2)將步驟(I)擴增的人HCRCN81蛋白質編碼基因插入到原核表達載體構建原核重組質粒，再將所述原核重組質粒轉化至感受態細菌中進行培養，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；(3)利用PCR擴增和限制性內切酶酶切圖譜分析所述原核重組質粒，并進行DNA序列分析；(4)將正確克隆的原核重組質粒轉化入工程菌中進行表達，分離純化表達的蛋白即獲得重組人HCRCN81蛋白質；(5)采用SDS-PAGE、質譜分析鑒定重組人HCRCN81蛋白質的正確性；(6)將所述重組人HCRCN81蛋白質免疫新西蘭大耳白兔后收集抗血清；(7)采用抗原親和純化方法從步驟(6)所收集的抗血清中獲得兔抗人多克隆抗體。
6.權利要求4所述兔抗人多克隆抗體在制備檢測人癌細胞和人組織中hcrcnSl基因所表達的蛋白質的檢測劑方面的應用。
全文摘要
本發明通過基因工程技術構建人hcrcn81的原核重組質粒，將原核重組質粒轉入工程菌進行誘導表達人HCRCN81蛋白質 ，并進行表達產物的提取、純化，用人HCRCN81蛋白質免疫新西蘭大耳白兔，制備兔抗人多克隆抗體(Anti-HCRCN81)。實驗表明，本發明所述兔抗人多克隆抗體 (Anti-HCRCN81)能夠檢測癌細胞和人組織中HCRCN81蛋白質的表達，為研究hcrcn81基因在人癌癥發生發展中的作用和地位提供了有用的工具。
文檔編號C07K14/47GK102936604SQ20121044586
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者陳堯, 溫曉霞, 王凱程 申請人:四川大學