專利名稱：表達特異性HBV shRNA的重組HBV載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，特別涉及表達特異性HBV shRNA的重組HBV載體，還涉及該載體的構建方法和應用。
背景技術：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus )是引起人類急、慢性肝炎的DNA病毒，也稱丹氏顆粒，簡稱HBV。HBV屬嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，基因組長約3. 2kb，有四個 0RF,編碼以下蛋白Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白和S蛋白(L,M, S)。Core是核衣殼蛋白；X蛋白對病毒復制是重要的，并與肝癌的發生有關；S蛋白是病毒的包膜蛋白，與病毒進入細胞有關。HBV 超螺旋共價、閉合、環狀 DNA 分子(covalently closed circularDNA, cccDNA)的持續存在是HBV慢性感染的根源，松弛環狀DNA (RC DNA)是cccDNA形成的前體，故阻斷RC DNA的合成將致cccDNA減少。研究發現缺失某些序列的突變型rHBV的RC DNA合成效率更高，rHBV與HBV共存于細胞內時，由于rHBV具有如下特性①合成效率高，rHBV將在數量上占優；@rHBV自身不能合成復制所必需的Core、Pol蛋白，需利用野生HBV的Core、Pol蛋白進行復制，從而競爭性抑制野生HBV的復制，但不能完全抑制。因此尋找一種能夠完全抑制野生HBV的方法是解決HBV持續慢性感染的關鍵。
發明內容
本發明的目的之一在于提供表達特異性HBV shRNA的重組HBV載體，能夠依賴野生型HBV進行復制，并且形成RC DNA,為慢性HBV感染的治療提供了新的工具。為實現上述發明目的，技術方案為
表達特異性HBV shRNA的重組HBV載體，所述乙型肝炎病毒shRNA表達載體由LJ196載體刪除2111-2643位、187-680位或1060-1500位堿基后，在刪除序列處替換識別所述刪除序列的shRNA轉錄結構單元而得。優選的,所述shRNA轉錄結構單元由啟動子和shRNA編碼序列組成。優選的,所述啟動子為Hl啟動子。更優選的，所述shRNA 編碼序列如 SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 22 或 SEQ ID NO. 25 所示。本發明的目的之二在于提供表達特異性HBV shRNA的重組HBV載體的制備方法，其制備方法簡單，重復性好，技術方案為
所述重組HBV載體的制備方法，根據LJ196載體序列設計引物，然后以LJ196載體為模板，進行PCR擴增，得刪除LJ196載體2111-2643位、187-680位和1060-1500位堿基的序列，同時克隆Hl啟動子并分別與所得序列連接，環化后在Hl啟動子3’端連入識別所述刪除序列的shRNA的轉錄結構單元，得重組HBV載體。優選的，所述引物為SEQ ID NO. 2-7所示的核酸序列。更優選的，所述克隆Hl啟動子的具體方法為以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示核酸序列為引物，以PLVTHM質粒為模板，進行PCR擴增，得Hl啟動子。本發明的目的之三在于提供乙型肝炎病毒shRNA表達載體的應用，技術方案為 所述重組HBV載體在制備干擾乙型肝炎病毒基因組DNA復制的藥物中的應用。本發明有益效果在于本發明公開的重組HBV載體，刪除病毒蛋白表達元件，并保留RC DNA合成必須順式元件，并在刪除序列處替代shRNA轉錄結構單元(由Hl啟動子和shRNA序列組成，不足300bp)，用以表達靶向被刪除序列的shRNA，使其特異性降解野生型 HBV pgRNA,阻斷RC DNA合成及cccDNA的形成；該重組HBV載體依賴野生型HBV復制并且不會整合入宿主基因組中，因此重組HBV載體只能在感染HBV病毒的細胞中存活，在正常細胞中會很快消失，不會影響正常細胞的生長，也不會引起轉基因細胞發生突變。重組HBV載體因刪除了靶序列而不受RNAi的影響，并能在野生型HBV表達的Core、Pol蛋白輔助下轉化為cccDNA，后者持續表達siRNA達到持久抗HBV復制效應①在半衰期方面，野生型HBV cccDNA和rHBV cccDNA相同，同時在肝細胞內可能存在降解cccDNA的未知機制；②在復制效率方面，rHBV高于野生型HBV ;③受RNAi抑制作用方面，野生型HBV在pgRNA水平受到大量降解，RC DNA合成受阻，而rHBV的pgRNA不受RNAi影響，可以合成RC DNA進而形成cccDNA ;在這些效應下，隨著肝細胞的分裂，最終野生型HBVcccDNA先于rHBV cccDNA被耗竭，達到治療乙型肝炎病毒感染的目的。
圖1 rHBV載體與LJ96輔助質粒共轉染IfepG2細胞后Southern blot結果。圖2為rHBV-Hl載體與LJ96輔助質粒共轉染H印G2細胞后Southern blot結果圖。圖3為shRNA541雙鏈結構圖。圖4為shRNA456雙鏈結構圖。圖5為shRNA1436雙鏈結構圖。圖6為shRNA1302雙鏈結構圖。圖7為shRNA1573雙鏈結構圖。圖8為rHBV-shRNA表達載體的結構示意圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。本發明中使用的LJ196和LJ96質粒由Daniel D. Loeb教授惠贈，并在公開的文獻中有記載(Liu N, Ji L, Maguire ML, Loeb DD. cis-Acting sequences that contributeto the synthesis of relaxed-circular DNA of human hepatitis B virus. J Virol.Jan 2004 ；78(2) :642-649.)。一、缺失突變rHBV構建過程
在不表達任何病毒蛋白的質粒LJ196 (SEQ ID NO.1)的基礎上，利用反向PCR技術刪除LJ196質粒的DNA片段，使刪除后RC DNA合成效率更高。分別刪除LJ196的第2111至2643位核苷酸(簡記為rHBVl)、刪除LJ196的第187至680位核苷酸(簡記為rHBV2)、刪除LJ196的第1060至1500位核苷酸(簡記為rHBV3)、刪除LJ196的第2111至2643位核苷酸和1060至1500位核苷酸(簡記為rHBVl. 3)、刪除LJ196的第2111至2643位核苷酸和187至1500位核苷酸(簡記為rHBVl. 23)。rHBV1-3載體的構建方法
設計合成以下引物
HBV187-163 :5’-aggggtcctagggatccttatgtga-3’ (SEQ ID NO. 2)；
HBV1060-1036 :5’-caaaggcatcaacgcaggataacca-3’ (SEQ ID NO. 3)
HBV2111-2087 :5’-agtcattagttccccccagcaaaga-3’ (SEQ ID NO. 4)
HBV680-704 :5’-agtgccatttgttcagtggttcgta-3’ (SEQ ID NO. 5)
HBV1500-1518 :5’-tgccgttccgaccgaccac-3’ (SEQ ID NO. 6)
HBV2643-2667 :5’-attatgcctgccaggttttatccaa-3’ (SEQ ID NO. 7)
按表I引物配對，以LJ196質粒為模板，分別進行反向PCR擴增，PCR擴增條件為94°C預變性2分鐘；然后96°C變性15秒，55°C退火30秒，68 °C延伸6分鐘40秒，共21個循環。表1.反向PCR擴增引物對
權利要求
1.表達特異性HBVShRNA的重組HBV載體，其特征在于所述表達特異性HBV shRNA的重組HBV載體由LJ196載體刪除2111-2643位、187-680位或1060-1500位堿基后，在刪除序列處替換識別所述刪除序列的shRNA轉錄結構單元而得。
2.根據權利要求1所述表達特異性HBVshRNA的重組HBV載體，其特征在于所述 shRNA轉錄結構單元由啟動子和shRNA編碼序列組成。
3.根據權利要求1所述表達特異性HBVshRNA的重組HBV載體，其特征在于所述啟動子為Hl啟動子。
4.根據權利要求1-3任一項所述表達特異性HBVshRNA的重組HBV載體，其特征在于 所述 shRNA 編碼序列如 SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 22 或 SEQ ID NO. 25 所示。
5.權利要求1-4任一項所述重組HBV載體的制備方法，其特征在于根據LJ196載體序列設計引物，然后以LJ196載體為模板，進行PCR擴增，得刪除LJ196載體2111-2643位、 187-680位和1060-1500位堿基的序列，同時克隆Hl啟動子并分別與所得序列連接，環化后在Hl啟動子3’端連入識別所述刪除序列的shRNA的轉錄結構單元，得重組HBV載體。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述引物為SEQID NO. 2-7所示的核酸序列。
7.根據權利要求5或6所述的制備方法，其特征在于所述克隆Hl啟動子的方法為， 以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列為引物，以pLVTHM質粒為模板，進行PCR 擴增，得Hl啟動子。
8.權利要求1-4任一項所述重組HBV載體在制備干擾乙型肝炎病毒基因組DNA復制的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及表達特異性HBVshRNA的重組HBV載體及其構建方法和應用，重組HBV載體由LJ196載體刪除2111-2643位、187-680位或1060-1500位堿基后，在刪除序列處替換識別所述刪除序列的shRNA轉錄結構單元而得，制備方法簡單，該重組HBV載體能夠利用野生型乙型肝炎病毒基因組的Core蛋白和Pol蛋白高效合成RCDNA，并且合成效率高于野生型乙型肝炎病毒基因組DNA，競爭野生型乙型肝炎病毒的復制，同時利用重組HBV載體合成效率高的特性，高效表達shRNA，然后干擾乙型肝炎病毒DNA復制和HBsAg合成，能夠用于制備干擾乙型肝炎病毒基因組DNA復制的藥物，為慢性乙型肝炎病毒感染的治療提供了新的思路。
文檔編號A61K48/00GK103014045SQ201210584159
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月30日 優先權日2012年12月30日
發明者李俊剛, 毛青, 王宇明 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學