專利名稱：一種雙向誘導表達質粒、其構建方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種雙向誘導表達質粒及其構建方法和用途。
背景技術：
從環境元基因組文庫中篩選具有催化作用的基因避開了微生物純培養的限制，該方法具有廣闊的應用前景。底物誘導基因表達篩選技術(Substrate-induced gene-expressionscreening, SIGEX)由于使用了高度自動化的流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)，所以具有省時省力、效率高、能篩選到較新穎的基因等優點，其研究也越來越受到重視。SIGEX技術的理論基礎是催化基因的表達常常受其底物或者代謝產物的誘導，并常常受各種調節元件的控制。許多細菌的轉錄調節與宿主菌(E. coli)具有相似的轉錄調節機制并能在一起工作，這樣，通過SIGEX技術可以篩選到各種細菌內的催化操縱子。 SIGEX技術對環境元基因組文庫的篩選主要分為建庫、預篩選、底物誘導并陽性克隆篩選三個步驟，其中，用于建庫機篩選的可誘導表達質粒載體是該技術的核心和基礎。現在已有的可誘導表達質粒載體P18GFP包含了一個綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP) 報告基因(Taku Uchiyama 等，naturebiotehnology，23 (1)，88-93，2005)，但是由于核酸是雙鏈結構并能雙向表達，所以現有的可誘導表達質粒載體不能完全報告出克隆于該載體上的可誘導表達的基因片段。構建一個可被雙向誘導表達的質粒載體，并在克隆位點正向和反向的下游區都設計上一個報告基因，可以使克隆于該載體上正反兩個方向可受誘導的基因片段均得到報告，提高SIGEX的篩選效率。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種同時含有綠色熒光蛋白基因和增強型綠色熒光蛋白基因的雙向誘導表達質粒。本發明的目的之二是提供上述雙向誘導表達質粒的構建方法。本發明的目的之三是提供上述雙向誘導表達質粒的用途。本發明的雙向誘導表達質粒是一種同時含有綠色熒光蛋白基因和增強型綠色熒光蛋白基因的質粒。本發明采用基因重組的方法，使綠色熒光蛋白基因與增強型綠色熒光蛋白基因置于一個酶切位點兩邊并分別在各自的啟動子的調控下，獲得雙向誘導表達質粒。在酶切位點處連接可誘導基因，并轉化大腸桿菌得到基因工程菌后，接種于培養基，經誘導生長培養后表達。該雙向誘導表達質粒作為載體構建某種基因組文庫后，可用于底物誘導的基因表達篩選及環境因素誘導基因表達篩選。該雙向誘導表達質粒轉化的宿主菌可以是大腸桿菌E. coli JM109.E. coli DH5a。
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該質粒轉化大腸桿菌后可得到含該雙向誘導表達質粒的菌種，該菌種已于2010 年7月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC NO. 4004，分類命名為大腸埃希氏菌hcherichia coli。保存該雙向誘導表達質粒的方法將其轉化進入大腸埃希菌hcherichia coli, 于o°c以下保存，或者溶于重蒸水中，于o°c以下保存。本發明提供雙向誘導表達質粒，用于SIGEX可以使克隆于該載體上正反兩個方向可受誘導的基因片段均得到報告，提高SIGEX的篩選效率。
圖1為雙向誘導表達質粒pl8BG的示意2為SIGEX技術對環境元基因組文庫的篩選流程圖3為雙向誘導表達質粒P18BG的構建流程圖4為流式細胞儀對環境元基因組文庫預篩選5為流式細胞儀對經預篩選并誘導后的環境元基因組文庫篩選圖
具體實施例方式下面通過構建雙向誘導表達質粒pl8BG對本發明作進一步闡述，但并不限制本發明的范圍。重組質粒pl8BG的構建將gfp及egfp基因重組到pUC18質粒載體上，以使gfp與egfp基因置于一個酶切位點兩邊并分別在各自的啟動子的調控下，獲得一種雙向誘導表達質粒P18BG。為此，我們利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術從pGFP質粒上擴展得到gfp基因片段，并在其兩端設計上BamH I和sph I酶切位點。利用限制性內切酶BamH I和sph I雙酶切消化前述得到的 gfp基因片段，并將酶切后所得到的gfp基因片段與經同樣酶切的載體質粒PUC18相連，得到重組質粒P18GFP。接著再利用PCR技術從pEGFP質粒上擴增得到egfp基因片段，并在其兩端設計上BamH I和Kpn I酶切位點。利用限制性內切酶BamH I和Kpn I雙酶切消化前述得到的egfp基因片段，并將酶切后所得到的egfp基因片段與經同樣酶切的載體質粒 P18GFP相連，得到重組質粒pl8BG。本實施例中涉及的酶切、連接、感受態細胞制備、電擊轉化等分子生物學方法均參考"Molecular Cloning-Α laboratory Mannual，，ed. by J. Sambrook, Ε. F. Fritsch and Τ. Maniatis, 1989, CSHL Press.本實施例所涉及的研究材料見下表
權利要求
1.一種雙向誘導表達質粒載體，其特征是包含綠色熒光蛋白基因與增強型綠色熒光蛋白基因。
2.如權利要求1所述的雙向誘導表達質粒的構建方法，其特征是采用基因重組的方法，使綠色熒光蛋白基因和增強型綠色熒光蛋白基因置于一個酶切位點兩邊并分別在各自的啟動子的調控下，獲得雙向誘導表達質粒。
3.如權利1所述的雙向誘導表達質粒的表達方式，其特征是在酶切位點處連接可誘導基因，并轉化大腸桿菌得到基因工程菌后，接種于培養基，經誘導生長培養后表達。
4.如權利要求1所述的雙向誘導表達質粒在底物誘導基因表達篩選及環境因素誘導基因表達篩選中的用途。
5.一種保存權利要求1所述的雙向誘導表達質粒的方法，其特征是將其轉化進入大腸埃希菌(Escherichia coli)，于0°C以下保存，或者溶于重蒸水中，于0°C以下保存。
全文摘要
本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種雙向誘導表達質粒及其構建方法和用途。本發明雙向誘導表達質粒載體包含綠色熒光蛋白基因與增強型綠色熒光蛋白基因。采用基因重組的方法構建，使綠色熒光蛋白基因和增強型綠色熒光蛋白基因置于一個酶切位點兩邊并分別在各自的啟動子的調控下，獲得雙向誘導表達質粒。該雙向誘導表達質粒用于底物誘導基因表達篩選及環境因素誘導基因表達篩選中。本發明提高了底物誘導基因表達篩選的效率。
文檔編號C12N15/63GK102337283SQ20101023925
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者劉慶華, 李旭東, 楊俊仕, 郝純 申請人:中國科學院成都生物研究所