重組質粒pNZ8048-plnD的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物工程技術領域，具體設及一種重組質粒pNZ8048-plnD的構建方 法。
【背景技術】
[0002] 植物乳桿菌廣泛存在于人體和動物腸道內、騰制果蔬、騰制肉制品中，能利用葡萄 糖發酵代謝生產大量乳酸。除此之外，植物乳桿菌還能在胞外分泌一些具有抗菌活性的細 菌素。細菌素能被吸附在指示菌細胞膜上，引起指示菌細胞膜結構改變形成空桐，導致指示 菌胞內K+、ATP、氨基酸和憐酸鹽等物質外泄而死亡。細菌素具有熱穩定、無毒、高效和安全 等特點。
[0003] 植物乳桿菌ZJ316是從健康嬰兒糞便中分離篩選得到的一株植物乳桿菌，對該菌 的上清發酵液過膜除菌，經排酸、過氧化物W及膜蛋白酶和蛋白酶K等酶處理之后進行抑菌 試驗，試驗結果表明經過一系列處理后的發酵上清仍然對指示菌具有較強的抑菌效果，并 經過全基因組測序，確認植物乳桿菌ZJ316在發酵過程中產細菌素。相比較乳酸鏈球菌所產 的Nisin細菌素對革蘭氏陽性菌呈廣譜抑菌而言，植物乳桿菌ZJ316所產的細菌素對大腸桿 菌、銅綠假單胞菌、沙口氏菌、李斯特、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、巧樣色葡萄球菌和副 溶血性弧菌等革蘭氏陰性和陽性致病菌具有明顯的抗菌作用，具有抗菌廣譜性。綜上所述， 植物乳桿菌ZJ316細菌素在食品、工業、農業和醫藥等領域具有較大的開發價值。
[0004] 植物乳桿菌ZJ316細菌素合成基因簇的5個啟動子序列非常相似，具有高度保守 的-35和-10區（5'-了4〔67^41'-3'），-35區和-10區之間間隔著1269的距離，研究表明運兩個 區域的間隔長度對轉錄效果具有很大的影響。通過對植物乳桿菌細菌素生物合成的群體感 應調節操縱子plnABCD分析，植物乳桿菌ZJ316存在群體感應調控的信號膚基因基因 plncSIF和組氨酸蛋白激膜蛋白酶基因 plnB，但是胞內缺乏調控蛋白基因 plnC和plnD，因 此，我們猜測Ξ種可能性:一是植物乳桿菌ZJ316胞內缺乏調控蛋白，群體感應信號通路中 斷；二是除文獻已報道的調控蛋白基因 plnC和plnD外，還存在類似調控功能的未知蛋白 Ρ1ηΧ;Ξ是植物乳桿菌ZJ316還存在另外一套細菌素生物合成群體感應調節機制。
[000引本課題針對第一種猜測，通過將克隆有調控基因的重組質粒轉化至植物乳桿菌 ZJ316胞內，利用載體質粒上的信號膚強轉錄啟動子化C8IF表達調控蛋白W彌補群體感應 調控蛋白的缺失，搭建完善群體感應調節通路，研究和探討調控蛋白PlnC和PlnD在植物乳 桿菌ZJ316細菌素代謝合成作用調節機制。通過調控蛋白在植物乳桿菌ZJ316胞內表達可W 為植物乳桿菌ZJ316細菌素群體感應模式研究提供理論依據;為群體感應系統的開發奠定 基礎;為植物乳桿菌ZJ316細菌素高產研究提供一種創新思路，在植物乳桿菌ZJ316細菌素 的開發和商業運用上也具有十分重要的意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種重組質粒pNZ8048-plnD的構建方法，W便更好的研究 調控蛋白PlnD對植物乳桿菌細菌素的生物代謝的調控機制。
[0007]為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[000引本發明的重組質粒pNZ8048-plnD的構建方法，W植物乳桿菌ZJQ基因組為模板， PCR擴增plnD目的基因，將擴增得到的基因片段用PCR產物純化試劑盒純化特異性擴增條 帶，將純化后的PCR產物和質粒PNZ8048經化01和化nd III雙酶切后純化，16°C連接過夜，得 到重組質粒pNZ8048-plnD。
[0009] 所述PCR擴增所用引物為：
[0010] 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCT TTGTTTCCAATTTATTTATACGA-3 ' ；
[0011] 下游引物：5 ' -CCCAAGCTTCTAGTTGTCTCTCAACAACTTAT-3 '。
[0012] 所述PCR擴增反應體系為：10Xbuffer(Mg2+)2化，2.5mmol/LdNTPMix化rel.化L， 10皿ol/L上游引物0.祉L，10皿ol/L下游引物0.祉L，DNA模板化L，rTaq DNA PolymeraseO. 2 化，其余為滅菌超純水，總體積為20化;所述PCR擴增反應條件為:95°C預變性5min;進入循 環，95°C變性30s，49°C退火50s，72°C延伸5〇3,31個循環;反應結束后72°(3延伸1〇111111，降溫 至4°C保存。
[0013] PCR產物的雙酶切反應體系為：10ΧΚ Buffer4化，plnD PCR產物30化，齡〇 I化L， Hind III化L，dd此0化L，總體積為40化;PNZ8048的雙酶切反應體系為：10ΧΚ Buffer4y L，pNZ8048質粒30化，化〇 I化L，Hind III化L，d地2〇化L，總體積為40化。
[0014] 所述過夜連接的連接體系為:plnD酶切目的片段化L，酶切質粒PNZ80482化，10X T4DNA Ligase Bufferl化，T4DNAligase化L，總體積10化。
[0015] 植物乳桿菌存在群體感應效應，其中plnABCD是群體感應調控操縱子，plnCD編碼 調控蛋白PlnC和PlnD。有報道表明，PlnC可能起促進轉錄作用，PlnD可能起抑制轉錄作用， 但目前關于兩者究竟如何調節轉錄及其作用機制尚不明確。本發明構建的重組質粒 pNZ8048-PlnC和pNZ8048-PlnD，能在植物乳桿菌Z J316 (缺乏調控蛋白PlnD)中表達。該體系 有助于研究和探討PlnC和PlnD在植物乳桿菌ZJ316中的轉錄調節機制，進而有助于掲示 PlnD對植物乳桿菌ZJ316細菌素合成代謝調節機制，為植物乳桿菌ZJ316群體感應模式研究 提供理論依據，也為植物乳桿菌ZJ316細菌素高產研究提供一種創新思路，在植物乳桿菌 ZJ316細菌素的開發和商業運用上也具有十分重要的意義。同時，該體系也適用于研究PlnD 對除ZJ316外的其他植物乳桿菌細菌素合成調節機制，為植物乳桿菌群體感應系統的開發 奠定基礎。
[0016] 本發明中設及的植物乳桿菌ZJQ已于2013年03月29日在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中屯、進行保藏，分類命名：植物乳桿菌，拉下文學名Lactobacillus plantarum，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏單位簡稱 CGMCC，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2013年03月29日，保藏 編號7391。
【附圖說明】
[0017] 圖1植物乳桿菌ZJQ基因組;注:Μ: Marker，上樣量3化;Li-L2 :植物乳桿菌ZJQ基因 組，上樣量化L。
[0018] 圖2 PCR擴增P InC目的基因；注:Μ: Marker，上樣量^-L9 :植物乳桿菌ZJQ號 plnC基因 PCR基因電泳條帶，上樣量化L bo:不加 DM模板的陰性對照，上樣量化L。
[0019] 圖3 PCR擴增plnD目的基因進:Μ:Marker，上樣量3化山-L9:植物乳桿菌9號plnD 基因 PCR基因電泳條帶，Li-Ls，上樣量化L，L9 :上樣量扣レbo:不加 DM模板的陰性對照，上樣 量!5化。
[0020] 圖4 PNZ8048質粒粘性末端片段的獲取；注：M:Marker，上樣量^L^:Nco I和 Hind III雙酶切后的DNA片段，上樣量化LL2:Nco I單酶切后的片段，上樣量化LL3:Hind III單酶切后的片段，上樣量化L Ls: PNZ8048環狀質粒，上樣量扣L。
[0021 ]圖5目的基因片段粘性末端片段的獲取；注：M:Marker，上樣量^L^:Nco I和 Hind III雙酶切后的plnC片段，上樣量化LL2:Nco I和化nd III雙酶切后的plnD片段，上 樣量化L。
[0022] 圖6重組質粒pNZ8048-plnD圖譜;將酶切后的PNZ8048質粒和plnDPCR片段進行連 接，后轉化大腸桿菌，并將其涂布在含有30yg/mL氯霉素的LB固體培養基上，37°C培養箱中 培養16-18小時。圖中為獲得的重組質粒pNZ8048-plnD圖譜。
[0023] 圖7轉化子E.coli MC1061 (pNZ8048-plnD)的鑒定；注:M:Marker，U-L日：plnD片段 的菌