專利名稱：甘藍型油菜低芥酸分子標記及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于油菜分子育種技術領域，具體涉及一種甘藍型油菜低芥酸分子標記的 制備及應用。所述的分子標記可以作為低芥酸甘藍型油菜育種標記輔助選擇，為培育遺傳 穩定的低芥酸油菜新品種提供新的分子標記。
背景技術：
芥酸是一種22碳長鏈脂肪酸，分子式為CH3(CH2)7CH = CH(CH2) nCOOH。主要存在 于十字花科(Cruciferae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。十字花科蕓薹屬 (Brassica spp.)和糖芥屬(Erysimum spp.)植物的種子中芥酸含量一般為30% 60%， 金蓮花科植物種子的芥酸含量可高達80%，一些海洋動物的油脂中也發現有芥酸存在。芥 酸和其它脂肪酸一樣大部分可以被消化吸收和進入代謝。人體對高芥酸菜油基本能夠完 全消化(99% )，而老鼠只能消化77%左右。有試驗顯示，芥酸可以使老鼠等動物患心肌脂 肪沉積癥，按每千克體重飼喂6600mg芥酸時老鼠還會發生心肌壞死和纖維化，其原因可能 是，芥酸和其他長鏈脂肪酸一樣，難以被線粒體氧化酶系統作為基質利。但迄今為止， 還沒有發現芥酸導致人體心臟疾患的直接證據(武玉花等，植物芥酸合成代謝與遺傳調控 研究進展.中國油料作物學報，2005，27 (2) :82 76)。在植物細胞內，脂肪酸的合成系統分為從頭合成系統和延長系統，其中從合成系 統只能合成C18以下的脂肪酸；延長系統以油酸為底物，經過兩個連續的縮合反應形成C2tl 以上的超長鏈脂肪酸。超長鏈脂肪酸的合成過程主要涉及到的酶有β-酮酰-輔酶A合 酶、β -酮酰-輔酶A還原酶、β -羥酰-輔酶A脫水酶以及烯脂酰-輔酶A還原酶，總稱 為脂肪酸延長酶。其中β-酮酰-輔酶A合成酶又稱為脂肪酸延長酶1或簡稱KCS，在超 長鏈脂肪酸的合成中起主要作用，是該反應的限速酶milar等，Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme. PlantJ，1997，12 (1) :121_131)。其他三種酶的作用幾乎微乎其微，因 此KCS酶的活性大小成為制約超長鏈脂肪酸合成的重要因素。目前許多低芥酸品種的原理 都是通過該酶的突變完成的。Fael基因是β-酮酰-輔酶A合酶(KCS)的編碼基因，也是控制芥酸等超長鏈 月旨肪酸合成的關鍵基因(Kunst 等，Fatty acid elongation in developing seeds of Arabidopsis thaiiana. Plant Physiol Biochem，1992，30 :425_434)。油菜種子中芥酸含 量的遺傳受到胚基因型控制(張潔夫等，甘藍型油菜芥酸含量的遺傳與QTL定位.江蘇農 業學報，2008，24(1):22-28)。這可能是因fael基因在發育的胚中特異表達。目前分離得 到的野生型fael基因全長1521個核苷酸，不含內含子，編碼506個氨基酸。分子生物學研究證實，油菜中從油酰CoA到芥酸的兩步延伸反應分別由El和E2 兩個位點上的等位基因控制，這兩個位點表現加性效應。通過分析高芥酸油菜(E1E1E2E2) 和低芥酸油菜(elele2e2)分離群體的基因型和芥酸含量，發現elele2e2基因型植株的芥 酸含量< 2%，E1E1E2E2植株的芥酸含量> 40%，ElelE2e2植株的芥酸含量中等。雖然目前對兩個基因位點對芥酸含量的貢獻率大小仍有爭議，但一致認為甘藍型油菜中有兩個 基因位點控制芥酸的合成，且表現加性效應(Fourmann等，The two genes homologous to Arabidopsis FAEl co-segregate with the two loci governing erucic acid content in Brassica napus. Theor Appl Genet, 1998,96 :852_858)。Jourdren等通過數量性狀座位QTL方法和RAPD分子標記將E1、E2兩個位點 定位至Ij了兩個獨立的連鎖群中(Puyanbert 等，Acyl-CoA elongase expression during seed development in Brassica napus. Biochimica et Biophysica Aeta,2001,1533 141-152)。Fourmarm等通過聚丙烯酞胺凝膠電泳檢測fael擴增產物的多態性，定位了兩 個fael基因拷貝(Bn-fael. 1和Bn-fael. 2)，這兩個基因拷貝與控制芥酸含量的上述兩 個QTLs (El和E2)分離。在高芥酸油菜(Gaspard)和低芥酸油菜(ISLR4)中，這兩個基 因都轉錄表達,但Bn-fael. 2的表達水平比Bn-fael. 1低(Fourmann等，The two genes homologous to Arabidopsis Faelco-segregate with the two loci governing erucic acid content in Brassica napus. Theor AppI Gene,1998,96 :852_858)。Barret等利用擬南芥fael的部分序列標記探針，篩選甘藍型油菜幼胚的cDNA 文庫，分離到兩個與fael同源的cDNA克隆(CE7和CE8)，CE7和CE8DNA同源性達97%， 氨基酸同源性達98%，定位克隆結果顯示CE7與El位點緊密連鎖，并調控油菜中芥酸的 含量(Barret 等，A rapeseed FAEI gene is linked to the Ellocus associated with variation in the content of erucic acid. Theor AppI Genet, 1998,96 :177-186)。Han 等從高芥酸油菜品種(Askari)和低芥酸油菜品種(Drakkar)中均分離到了 Bn-fael. 1的 序列，這兩條序列同源性很高，有一個不含內含子的連續編碼區，都編碼507個氨基酸的 蛋白質，其差異在于第282位的氨基酸不同，高芥酸品種中是絲氨酸(Ser)，低芥酸品種中 是苯丙氨酸(Phe) (Han J. X.等· Functional characterization of β-ketoacyl-CoA synthase genes from Brassica napus L. Plant Mol Biol,2001,46 (2) :229_239)。Gupta等人通過實驗發現fael. 1和fael. 2分別在高低芥酸油菜中含有4個和3 個單核苷酸位點不同(SNPs)，因此他們提出根據上述SNPs差異既可以通過這7個SNPs來 判斷高低芥酸品種，又可以僅通過fael. 1獨有的4個SNPs中的前3個位點直接判斷，也就 是說如果3個位點中存在el的特征核苷酸，則屬低芥酸品種，若無則屬高芥酸品種(Gupta ^,Molecular tagging of erueic acid trait in oil seed mustard (Brassica juncea) by QTL mapping and single nucleotide polymorphisms in FAEI gene. Theor AppI Genet, 2004,108 :743_749)。Fael被克隆后，對KCS的酶活性進行了大量研究。利用定點突變，將低芥酸品種 (westar)FAEI蛋白第282位的Phe替換成ser，Kes活勝恢復；而將有活性的FAEI蛋白第 282位的Ser替換成中性氨基酸，包括極性(Cys、Thx、和Gly)和非極性(Ala)的脂肪族氨基 酸，酶的活性并未喪失，而且替換成Cys還使酶的活性提高，因此第282位的ser并不是酶 活性所必須的。利用酵母表達系統，進行定點突變研究，還證實了 CyS223、HiS3oZ、HiS387、 His391和His420都是β -酮酰-CoA合酶的活性位點，這些氨基酸任何一個發生突變都會 導致酶的活性喪失，其中Cys223與酞基鏈的轉移有關，若將Cys223定點突變成Ala，即使 有18 I-CoA底物存在，突變體也不能催化丙二酸單酰-CoA的去羧基反應，從而不能進行縮 合反應(Katavica 等，Gaining insight into the role of serine282 in B. napus FAEIcondensing enzyme. FEBS Letters, 2004, 562 :118_124)。
發明內容
本發明的目的在于獲得一種適用于選育具有低芥酸性狀的甘藍型油菜的分子標 記，為甘藍型油菜低芥酸育種提供一種簡單、快速和有效的輔助選育方法。本發明是通過以下方案實現申請人:通過試驗獲得一種適用于選育具備低芥酸性狀的甘藍型油菜共顯性SNP 分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示。制備適用于甘藍型油菜低芥酸性狀的顯性SNP分子標記的方法，按照以下步驟利用本申請人設計的引物HY-fael (其DNA序列見實施例1所示)擴增低芥酸甘藍 型油菜品系甲A254和高芥酸甘藍型油菜品系4185B-2基因組DNA，得到兩個DNA擴增片段， 然后對所述2個DNA擴增片段進行克隆、測序，其中從甲A254中擴增得到如SEQ ID NO=I 和SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，從4185B-2中擴增得到如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。與序列表SEQ IDNO :2相比，在序列表SEQ ID NO 1的存在1個單堿基突變(見附 圖2)，申請人利用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中存在的突變位點845C —845T的單核苷酸 多態性(SNP，Single Nucleotide Polymorphisms)，采用引物3’端錯配技術策略(Drenkard 等，A simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant Physiol, 2000124 1483-1492) 設計了引物對YQ-fael-1及YQ-fael-2(其DNA序列見實施例)。與序列表SEQ ID NO 4 相比，在序列表SEQ ID N0:3的第1422-1423bp處存在一個2bp的缺失突變，缺失堿基是 M(見附圖3)，申請人根據序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4中所示的核苷酸序列差異設計 引物對HD-f ae 1 -1及HD-f ae 1 -2 (其DNA序列見實施例1)。將引物對YQ-f ae 1 -1、YQ-f ae 1 -2、 HD-fael-1和HD-fael-2進行PCR擴增，得到與甘藍型油菜低芥酸基因連鎖的共顯性SNP分 子標記(即本發明的目標分子標記)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示。在上述方法中，所用引物對的核苷酸序列如下所示引物對(1)，編號為HY-fael 正向引物5，-CATGCCATGGATGACGTCCGTTAACGTAAAG-3，，反向引物5，-CATGGCTAGCTTAGGACCGACCGTTTTGGAC-3，。引物對(2)編號為YQ-fael-Ι 正向引物 5，-GGGCCGCTATTTTGCTATT-3，，反向引物5，-GTGTTCCCAAGGACTATTTGAC-3，。引物對(3)編號為YQ-fael-2 正向引物5，-GGCCGCTATTTTGCTCAC-3，，反向引物5，-GTGTTCCCAAGGACTATTTGAC-3，。引物對(4)編號為HD-fael-Ι 正向引物5，-GAGACGGAGCAAGTTATC-3，，
反向引物5，-TCCCAAGGACTATTTGGA-3引物對(5)編號為HD-fadl-2 正向引物5，-GAGACGGAGCAAGTTATC-3，，
反向引物 5，-TCCCAAGGACTATTTGTT-3，。其中，引物對HY-fael 用于擴增序列表中 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3以及SEQ IDNO :4所示的核苷酸序列；引物對YQ-fael-lJQ-fael-2分別用于擴增序列表 中SEQ ID NO 5和SEQ IDNO 6所示的核苷酸序列；引物對HD-fael-1、HD-fael-2分別用 于擴增序列表中SEQ ID NO 7和SEQ IDNO 8所示的核苷酸序列。本發明的積極效果本發明采用引物3’端錯配策略應用于甘藍型油菜SNP多態性標記的開發和檢測； 利用正向引物和反向引物同時錯配手段在異源多倍體作物甘藍型油菜中開發出基于PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳SNP標記。本發明成功得到甘藍型油菜低芥酸的共顯性SNP分子標 記，運用該標記在低芥麻酸甘藍型油菜的輔助選擇中可以克服傳統育種中依靠表型進行選 擇的缺點，減少育種工作量，縮短育種年限，加快了甘藍型油菜低芥酸育種的進程。更詳細的技術方案參見《具體實施方式
》。
序列表SEQ ID NO :1_4是本發明擴增的低芥酸甘藍型油菜品系甲A254和高芥酸 甘藍型油菜品系4185B-2基因組DNA的基因組DNA獲得的4個DNA片段(核苷酸序列)。序列表SEQ ID NO :5_8是本發明制備的甘藍型油菜芥酸含量分子標記的核苷酸序 列。序列表SEQ ID NO :9_18是本發明制備的甘藍型油菜芥酸含量分子標記的引物對 序列。圖1 利用引物對HY-fael在甘藍型油菜品系甲A254和4185B-2以及F1的基因 組DNA中的擴增結果。圖中=P1代表4185B-2 ;P2代表甲A254 A代表4185B-2X甲A254 ； M 代表 DNA marker (片段大小依次為 3000，2600，2050，1650，1000, 700，500 和 278bp)。圖2 利用引物對HY-fael在甘藍型油菜品系甲A254和4185B-2基因組中的擴增 的DNA片段序列比對，圖中:N0_1、N0_2分別代表序列表中SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的 序列，實心黑三角形“▲”表示序列的第845C — 845T的單堿基突變，設計的引物位置(即 引物對YQ-fael-1、YQ-fael-2的正向引物位置)參見下劃線處，空心三角形“▽，，表示引物 設計錯配堿基。圖3 利用引物對HY-fael在甘藍型油菜品系甲A254和4185B-2基因組中的擴增 的DNA片段序列比對，圖中:N0_3、N0_4分別代表序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的 序列，實心黑三角形“▲”表示序列的第1422-1423bp的AA缺失突變，設計的引物位置(即 引物對YQ-fael-1、YQ-fael-2的正向引物位置)參見下劃線處。圖4 利用引物對HY-fael在甘藍型油菜品系甲A254和4185B-2基因組中的擴增 的DNA片段序列比對，圖中N0_1、N0_2、N0_3、N0_4分別代表序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3和SEQ IDNO :4的序列，實心黑三角形“▲”表示引物對HY-fael、 HD-fael在同一親本中擴增的甘藍型油菜fael基因的不同拷貝之間的單堿基差異；Pri. 1
6代表引物對YQ-fael-1、YQ-fael-2的反向引物，Pri. 2代表引物對HD-fael-l、HD-fael-2 的正向引物，設計的引物位置參見下劃線處，箭頭代表引物方向，空心三角形“V”表示引物 設計錯配堿基。圖5 本發明獲得的引物 YQ-fael-1、YQ-fael-2, HD-fael-l 和 HD-fael-2 在甘藍 型油菜品系甲A254、4185B-2、F1以及利用(4185B-2X甲A254)F2群體的部分單株檢測結 果。圖中=P1代表4185B-2 ;P2代表甲A254 A代表4185B-2X甲A254 ； 1-19代表F2群體 中不同芥酸含量單株(圖中正下方數值為單株芥酸含量，單位％)；片段長度為所述引物 擴增產物長度。圖6 是本發明的技術流程圖。
具體實施例方式實施例11、制備F1代雜交種和建立F2群體在本實施例中，以本申請人選育的低芥酸含量(芥酸含量為2. 74% )的甘藍型油 菜品系甲A254(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中 國典型培養物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC-P200909)為父本，以高芥酸含量(芥酸含 量為47. 76% )甘藍型油菜品系4185B-2(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北 省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC-P200907，該材料 在本發明的在前專利申請(2009年11月25日提交的說明書中已經公開)其專利申請號為 200910272868. 6，
發明者周永明, 楊慶勇, 淮東欣 申請人:華中農業大學