專利名稱：納米吸附改善酶穩定性的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高酶穩定性的方法，特別涉及一種以納米顆粒作為酶吸附載體改善酶穩定性的方法。
背景技術：
酶是由蛋白質組成，其空間結構對所處的環境十分敏感。一般情況下，對熱、強酸、 強堿、有機溶劑等均不夠穩定，在反應中易失活。天然酶的不穩定性大大限制了其應用領域和應用效果，選擇適宜的載體對酶進行固定化可以提高酶的穩定性。在酶固定化采用的方法中，吸附法是最簡單的一種方法。它的最大優點是工藝簡便、條件溫和，酶分子不會被破壞，得到的固定化酶穩定性好。通過吸附作用對酶的穩定性進行改善，關鍵的問題是選擇合適的載體。在眾多載體中，納米二氧化硅是比較常見的一種無機載體，它具有較高的表面能和生物相容性，價格低廉。此外，還有較高的機械強度有利于在生物反應器中進行工業生產。因此，在通過吸附對酶進行固定化中具有較高的應用價值。載體粒徑大小、載體和酶吸附的方式直接影響固定化酶的穩定性，目前的研究結果已經證實，納米載體優于微米載體。但是，目前采用正硅酸乙酯與Ν-(β-氨乙基)_氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微膠囊中同步水解的方法，一步法制備了氨基化的二氧化硅顆粒，以此作為載體，通過戊二醛作為交聯劑，采用共價法對不同酶進行固定化。此種方法固定化時間長達幾十小時，操作復雜，同時，由于交聯劑的存在，不利于保持較高的酶活力，酶穩定性改善不顯著。
發明內容
本發明在最大限度提高酶活保持率情況下，提供一種改善酶穩定性的方法。采用納米SiO2作載體，調整介質的ρΗ，利用酶和納米載體所帶電荷不同，自組裝形成酶-載體聚合體，從而達到提高酶穩定性的目的。本發明的目的通過如下技術方案實現納米吸附改善胰蛋白酶穩定性的方法分別用pH4. 0-10. 0的緩沖液配制3. 3mg/ mL，10mg/mL和30mg/mL胰蛋白酶溶液，再用相同ρΗ的緩沖液配制10mg/mL納米SW2溶液。 各取IOmL胰蛋白酶溶液和納米SiO2溶液使酶和載體質量比實現1 3，1 1和3 1三個比例，在室溫下，用電動攪拌器攪拌吸附池。所述胰蛋白酶是一種常用的動物蛋白酶，酶活力單位為^5U/mg，酶解最適pH7. 8，最適溫度37°C。所述納米SW2粒徑分布均一，分別為 20nm、100nm、300nm。以吸附后的酶活保持率、熱穩定性和酸堿穩定性為指標，吸附ρΗ優選為7. 8，酶和載體質量比優選為1 1，載體SiO2粒徑優選為20nm。本發明另一種通過納米吸附改善木瓜蛋白酶穩定性的方法分別用pH4. 0-8. O的緩沖液配制3. 3mg/mL, 10mg/mL和30mg/mL木瓜蛋白酶溶液，再用相同ρΗ的緩沖液配制10mg/mL納米SW2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和納米SW2溶液使酶和載體質量比實現1 3，1 1和3 1三個比例。在室溫下，用電動攪拌器攪拌吸附汕。所述木瓜蛋白酶是一種來源廣泛的植物蛋白酶，酶活力單位為617U/mg，酶解最適pH6. 0，最適溫度50°C。 所述納米SW2粒徑分布均一，分別為20nm、100nm、300nm。以吸附后的酶活保持率、熱穩定性和酸堿穩定性為指標，吸附pH優選為6. 0，酶和載體質量比優選為1 1，載體SiO2粒徑優選為20nm。本發明采用以納米顆粒作為酶吸附載體改善酶穩定性的方法，與現有技術相比具有以下優點1.通過調整pH使納米SW2載體和酶帶有相反電荷，通過靜電吸附的物理方法完成酶的固定化，避免了現有化學方法對酶分子結構的影響與破壞，使吸附后酶活性保持率較高。2.吸附時間與傳統的化學交聯法相比明顯縮短。本方法吸附時間僅需池甚至更短，而傳統的化學交聯法要長達幾十個小時。3.與化學交聯法和微米SW2固定化酶的方法相比，本方法可以更有效提高酶穩定性。化學交聯法對木瓜蛋白酶固定化后，80°C時固定化酶活力較游離酶提高了 53%，常規微米SiO2吸附后提高了 25%，而本發明采用的方法提高了 82%。4.本發明的方法操作簡單，酶穩定性改善顯著，易于推廣，具有較高的經濟效益。
具體實施例方式為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，但是本發明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。實施例1分別用0. lmol/L pH7. 8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和lOmg/mL 20nm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和納米SiO2溶液混合使酶和載體質量比為1 1，在室溫條件下，用電動攪拌器攪拌吸附池。經檢測，吸附后酶活保持率為61 %。在pH7. 8的條件下，吸附在20nmSiA載體的胰蛋白酶在80°C時酶活力較游離酶提高了 88%;在溫度為37°C、pH3.0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 78%。實施例2分別用0. lmol/L pH7. 8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和lOmg/mL IOOnm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和納米SiO2溶液混合使酶和載體質量比例為1 1，在室溫條件下，用電動攪拌器攪拌吸附池。經檢測，吸附后酶活保持率為56%，在pH7. 8的條件下，吸附在IOOnmSiA載體的胰蛋白酶在80°C時酶活力較游離酶提高了 72%;在溫度為37°C、pH3.0的條件下，固定化酶括力較游離酶提高了 65%。實施例3分別用0. 05mol/L pH9. 0的硼砂-氫氧化鈉緩沖液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和 10mg/mL 300nm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和300nm SiO2溶液混合使酶和載體質量比例為1 3，在室溫條件下，用電動攪拌器攪拌吸附池。
經檢測，吸附后酶活保持率為47% ；在pH7. 8的條件下，吸附在300nmSiA載體的胰蛋白酶在80°C時酶活力較游離酶提高了在溫度為37°C、pH3.0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 48%。實施例4分別用0. lmol/L pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL 20nm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和20nm SiO2溶液混合使酶和載體質量比為1 1，在室溫條件下，用電動攪拌器攪拌吸附池。經檢測，吸附后酶活保持率為53%，在pH6. 0的條件下，吸附在20nmSiA載體的木瓜蛋白酶在80°C時酶活力較游離酶提高了 82%;在溫度為50°C、pH3.0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 49%。實施例5分別用0. lmol/L pH5. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL IOOnm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和IOOnmSiO2溶液混合使酶和載體質量比為1 1，在室溫條件下，在電動攪拌器作用下攪拌吸附池。經檢測，吸附后酶活保持率為42%，在pH6. 0的條件下，吸附在IOOnmSiA載體的木瓜蛋白酶在80 0C時酶活力較游離酶提高了 61 % ；在溫度為50 0C、pH3. 0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了四％。實施例6分別用0. lmol/L pH6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL 300nm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和300nmSi02溶液混合使酶和載體質量比為1 1，在室溫條件下，在電動攪拌器作用下攪拌吸附池。經檢測，吸附后酶活保持率為39%，在pH6. 0的條件下，吸附在300nmSiA載體的木瓜蛋白酶在80 0C時酶活力較游離酶提高了 60 % ；在溫度為50 0C、pH3. 0的條件下，固定化酶活力較游離酶提高了 25%。
權利要求
1.本發明涉及一種通過納米顆粒作為吸附載體改善酶穩定性的方法，其特征在于選擇不同粒徑納米顆粒為載體，將酶通過物理吸附作用固定在該載體上。
2.權利要求1中所提到的酶主要有兩種胰蛋白酶(最適溫度37°C，最適pH7.8，等電點川^，最適條件下的酶活力為觀日"!^)和木瓜蛋白酶(最適溫度50°C，最適pH6.0，等電點8. 75，最適條件下的酶活力為617U/mg)
3.權利要求1中所提到的納米顆粒是二氧化硅顆粒，粒徑有20nm、100nm和300nm三種。
4.權利要求1所提到改善酶穩定性的方法，具體步驟如下用不同PH的緩沖液配制一定濃度的酶溶液和納米S^2溶液。取酶溶液和納米S^2溶液按一定比例混合，于室溫下在電動攪拌器作用下攪拌吸附一定時間。
5.根據權利要求4中所述的方法，其特征在于對于胰蛋白酶，配制酶和載體緩沖溶液的PH范圍在4. 0-10. 0 ；對于木瓜蛋白酶，配制酶和載體緩沖溶液的pH范圍在4. 0-8. 0。
6.根據權利要求4中所述的方法，其特征在于納米SiO2溶液的濃度10mg/mL；酶溶液的濃度為3. 3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL，使酶和載體的質量比實現1 3，1 1和3 1 三個比例。
7.權利根據權利要求4中所述的方法，其特征在于納米S^2和酶的吸附時間是池。
8.根據權利要求5中所述的方法，其特征在于pH在4.0-8. 0的緩沖液是0. lmol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；PH范圍在8. 1-8. 9的緩沖液是0. 05mol/L的Tris-鹽酸緩沖液；PH范圍在9. 0-10. 0的緩沖液是0. 05mol/L的硼砂-氫氧化鈉緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種通過納米顆粒作為吸附載體提高酶穩定性的方法，該方法采用不同納米粒徑的SiO2作載體，選用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為模型酶，分別在pH4.0-10.0和pH4.0-8.0范圍內，使載體-酶質量比實現3∶1，1∶1和1∶3三個不同的比例，室溫下攪拌3h，使二者通過靜電作用相互吸附。本方法可以大大提高酶穩定性，以20nmSiO2為載體的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，在80℃時酶活力較天然酶分別提高了88％和82％，同時，本發明的方法操作簡單，條件溫和，酶穩定性改善顯著，易于推廣，具有較高的經濟效益。
文檔編號C12N11/14GK102344918SQ201010245800
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者于國萍, 姜毓君, 徐紅華, 李麗 申請人:東北農業大學