專利名稱：一種用于mtDNA等位基因分型及點突變檢測的ARMS-PCR方法
技術領域：
本發明屬于分子遺傳學領域，尤其涉及線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)多 態性基因型鑒定及點突變檢測方法。
背景技術：
為了解mtDNA突變或多態性與疾病關聯而進行的病例對照研究中，往往涉及對大 量個體的多態性基因型進行區別鑒定；mtDNA相關疾病的分子診斷、遺傳咨詢和用藥指導 等服務，也都需要快速、簡便、有效的突變分析或基因分型方法。 限制性酶類方法如限制性片段長度多態性(restriction fragment 1 engthpo 1 ymorphi sms ， RFLPs)分析是當前進行mtDNA點突變或mtDNA單個位點核苷酸多態 性(mitochondrial DNA single nucleotide polymorphisms，mtSNPs)檢測的主要方法，如 mt4833A/G置換多態可通過Hae 11、mt5178C/A經Alu 1、mtl0398A/G經Bgl I及mtl5497G/ A經Dde I等不同限制性酶識別序列獲得鑒定；但該方法僅適用于待檢多態性或突變位點 附近存在適當的特定限制性內切酶酶切識別序列的情況。 此夕卜，由于mtDNA分子較小(16，569bp)，隨著DNA測序技術不斷進步同時成本不斷 下降，mtDNA全長或部分(如編碼區)序列分析也成為mtDNA多態性和基因突變分析的常 用方法，但這不僅需要特定的測序試劑盒和自動測序儀及檢測設備等，還需要從長的測序 結果中比對確定靶位點核苷酸，因此對于mtDNA單個位點特定多態性的明確而言，這是一 個消耗大量成本和工作量而僅獲得非直接結果的不經濟的方法。 擴增難熔突變系統(amplification refractory mutation system,ARMS)或稱等 位(基因)特異性擴增(allele-specific amplification,ASA)是驗證性檢測DNA序列變 化的經典方法之一。ARMS-PCR基因分型檢測通常包括兩個互補的PCR反應，使用相同的DNA 模板和一條相同的共有引物及其他條件，區別僅在于與共有引物配對的ARMS引物不同，一 條3'末端與給定位點上的一種特定核苷酸互補，與另一種則為錯配，反之另一條引物亦如 此。因而兩個反應只能選擇性擴增特定的DNA模板，即只有ARMS引物完全退火結合的反應 可順利進行，而3'末端不匹配引物的延伸受到阻滯。雖然在原理上ARMS-PCR只要針對核 苷酸可變(基因突變或多態性)位點進行特異性錯配引物設計即可，但由于mtDNA分子大 小及結構復雜度遠較核基因組DNA小，且在細胞內呈多拷貝，導致其模板效用性遠較核DNA 高，致使常規使用的僅3'末端堿基(核苷酸)錯配的ARMS引物不足以形成對相同模板的 擴增效率差異，因此，現有技術領域中沒有將ARMS-PCR用于mtDNA突變或mtSNPs檢測的方 法。
發明內容
本發明的目的在于解決現有mtDNA基因型多態性分析方法的不足，針對mtDNA模 板效用性較核基因組DNA高而不易形成錯配引物間PCR擴增效率差異的特點，提出一種優化改進的ARMS-PCR方法用于mtDNA點突變檢測或mtSNPs多態性基因型鑒定。
本發明檢測mtDNA點突變或mtSNPs多態性基因型的ARMS-PCR方法的詳細技術方 案為針對mtDNA突變或多態性待測位點，設計特異性ARMS適配引物，使引物3'末端終止 在待診位點，同時在ARMS引物(位于上游或下游均可)3'端倒數3-4位增加設置兩個連續 的堿基錯配，錯配方式為A-T或G-C的互換；但ARMS-PCR擴增反應中增加模板mtDNA的用量 為常規PCR擴增mtDNA的2 10倍，如20 lOOng總基因組DNA (其中包含mtDNA) /25uLPCR 反應體系；PCR擴增獲得包含靶位點的一段mtDNA片段，最后通過瓊脂糖凝膠電泳加以檢 測，根據陽性反應確定待檢基因型。 對于mtDNA而言，其中存在大量密集排布的多態性位點，所選擇設計的錯配ARMS 引物中不應再包含其他潛在的不匹配核苷酸，因此本發明中，通過選擇錯配引物的位置在 上游或者在下游，可以盡量避開其他潛在的多態性位點，從而避免可能的假陰性PCR擴增 結果，這使得該方法的模板適用范圍得以擴大。 本發明依據傳統ARMS-PCR技術的原理，進行了增加ARMS引物3'端錯配堿基數和 PCR反應模板DNA用量的雙重改進，前者降低PCR擴增效率，后者則提高。非適配ARMS引物 中因聯合了對擴增效率影響更大的3'末端錯配，使得模板mtDNA的擴增效率嚴重下降，即 使模板mtDNA用量增加也不足以糾正，而3'末端適配的ARMS引物擴增效率本就顯著高于 非適配引物，模板DNA用量增加則進一步糾正了添加的錯配對擴增效率的影B向，因而能獲 得足夠檢測靈敏度的產物累積。這種雙重因素的平衡調節，糾正了因mtDNA模板效用高而 造成的PCR擴增效率差異不明顯的缺陷，從而使得ARMS-PCR可用于mtDNA的單個位點基因 分型檢測。 與現有mtDNA點突變或mtSNPs多態性基因型檢測方法相比，ARMS-PCR技術用于 mtDNA多態性或基因變異檢測不僅結果高度可靠，而且在操作和實用性上還具有獨特優勢 PCR擴增結合瓊脂糖凝膠電泳檢測的操作能簡單地在裝備程度較低的實驗室中實施；不依 賴特異性限制性內切酶識別位點而進行限制性消化，也不需要諸如樣品的過夜消化、沉淀、 脫鹽或大量洗滌等費時操作；不需要同位素或其他標記物進行標記；能用簡單的紫外檢 測，不需要昂貴的激光誘導性熒光檢測設備等等，都極大地加速了分析過程，同時減少了不 必要的費用和工作量。尤其對mtSNPs多態性檢測而言，由于mtSNP具有源于母系單系遺傳 的特殊性，導致個體僅以純合子基因型相區分，不需要考慮見于核基因多態性的雜合子基 因型情況，即僅以擴增產物的有無就可判斷分型結果，因此采用ARMS-PCR方法進行基因分 型更為簡便易行，結果也完全可以信賴。
圖1實施例1中設計的6對ARMS-PCR擴增引物； 圖2實施例1中以3G禾P 4A引物方案進行ARMS-PCR擴增確定mtSNP8701A/G基因 分型的電泳圖。
具體實施例方式
實施例1用本發明的方法檢測mtSNP 8701A/G 以mtSNP 8701A/G的個體基因分型為例，針對其在不同個體中A和G兩種核苷酸的交替變化，進行了符合ARMS-PCR擴增原理的錯配引物設計，并使用優化的擴增條件對 200例DNA樣品進行基因分型檢測，其結果與序列分析分型的結果相互吻合。
(1).設計ARMS-PCR擴增引物 實驗設計了 6對ARMS-PCR擴增引物，如圖1所示。共用上游引物為ATFl (np8466 8587) 。 6條位于下游的ARMS引物3'末端固定地終止于mtDNAnp8701位點，并針對兩種SNP 等位基因之間G和A的核苷酸置換，設計了在3'端相互區別的6條下游引物。
如圖l所示，WG引物的3'末端堿基與G型等位基因序列完全互補匹配，與A型 基因則為錯配；反之，^2A引物與A型基因完全互補，但其3'末端與G型基因錯配。同理， 成對設計的3G和4A、5G和6A引物的3'末端也分別僅與兩種等位基因之一匹配，與另一種 為錯配。此外，3G和4A引物3'端倒數第3-4位加入錯配，GT — CA ;5G和6A的3'端倒數 第2-3位錯配，GG — CC。因此，6條下游引物中，有2條分別與G或A等位基因完全匹配， 其余4條均部分錯配。 圖1中下劃線部分示意除3'末端外附加的錯配位置及堿基。這6條在相同核苷 酸位置上的下游ARMS引物與共同上游引物配對組成了三套引物，每套引物包括2條下游引 物(即1G+2A、3G+4A和5G+6A)及上游引物ATF1，被用來建立檢測mtDNA G8701A SNP個體 基因型的ARMS-PCR方案，即在優化的PCR擴增條件下，選擇三套引物中適用于基因分型檢 測者，目標是使得模板DNA的兩個平行PCR擴增之一顯示陽性結果，另一個顯示陰性結果， 組合的電泳圖譜結果具有個體特異性，因而個體可獲檢mtDNA G8701A SNP基因型。通過實 驗結果表明3G和4A是該方案中適合的ARMS引物(參見附圖2)，也就是說，ARMS-PCR用 于mtDNA單核苷酸多態性基因型檢測時，ARMS弓I物設計時應當在3'末端倒數3 4位增 加設置兩個連續的堿基錯配，錯配方式為A-T或G-C的互換。
(2). ARMS-PCR擴增反應 以PCR擴增在25ii L總體積中進行為例，以基因組總DNA約50ng為模板；其他PCR 反應成份及其濃度為常規使用，如每種dNTP濃度為200 ii M，上、下游引物各5-10pmo1， 50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8. 3'25。C )，1. 5mM MgCl2及0. 5U rTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司， 大連)；PCR擴增參數亦為常規使用，如94°C 30s，56。C 30s和72°C 30s，循環30個周期后于 72t:充分延伸5min。 實驗中ARMS-PCR擴增的參數主要針對引物退火溫度和擴增循環數進行調整，結 果表明常規PCR的30次左右循環、57t:左右退火溫度(根據不同PCR擴增儀的性能差異調 整)為優化條件。 (3).瓊脂糖凝膠電泳鑒別樣品mtSNP 8701A/G基因型 按常規操作進行，如取每份PCR擴增產物5 ii L與適量上樣緩沖液混合后分別加 至1. 5%瓊脂糖凝膠(含0. 5mg/L EB)，使用0. 5XTBE電泳緩沖液(45mmol/L Tris-硼酸， lmmol/L EDTA，pH 8. 0)，于12V/cm電壓下恒壓電泳30min后，紫外燈下觀察結果，并照相保 留，根據電泳圖結果確定mtDNA單個位點基因分型，基因型結果(mt8701A或G)由二者當中 的陽性反應確定。 圖2是以3G和4A引物方案進行ARMS-PCR擴增后檢測mtSNP 8701A/G的電泳圖。 圖中#1-6為6個不同樣本，對每一樣品，ARMS檢測由對mtDNA8701A和G等位基因序列特異 性的兩個ARMS擴增反應組成，點樣次序為每個樣品先4A后3G反應，基因型結果(mt8701A或mt8701G)由二者當中的陽性反應確定。200例不同標本的結果與通過PCR產物直接序 列分析法所獲對應結果完全吻合。此外，對它們進行了三次獨立檢測，所有測試均顯示確定 不變的mt8701G或A純合子基因型，從而肯定了該方法的重現性、敏感性和可信度。圖2中
M :100bp DNA分子量梯級標志物；_ :陰性對照。
實施例2 :對mtl0398A/G的檢測 以前述可通過Bgl I酶切檢測的mtSNP10398A/G的個體基因分型為例，針對其在 不同個體中A和G兩種核苷酸的交替變化，進行了符合ARMS-PCR擴增原理的錯配引物設 計，并使用優化的擴增條件對DNA樣品進行基因分型檢測。 發明人設計兩對引物，共用的下游引物為(10398R): 5， -GGTGTTGAGGGTTATGAGAGTA-3，； 兩條上游引物為錯配的ARMS引物。上游ARMS引物1為(10398FG): 5， -GACTACAAAAAGGATTAGACA￡AG-3，； 上游ARMS引物2為(10398FA) :5， -GACTACAAAAAGGATTAGACA￡AA_3，。 上游引物3'末端堿基分別與A或G互補，同樣在3'端倒數第3-4位增加連續錯配
堿基，即引物序列中的下標處為引入的TG — AC錯配，以達到增加引物與模板的結合難度、
降低擴增效率的目的。其余PCR步驟同具體實施例l，僅更換相應引物為10398R、10398FG
和10398FA，并增加模板總基因組DNA的用量為常規用量的大約5倍( 50ng/25uL)，其結
果與序列分析分型的結果相互吻合。
權利要求
一種用于mtDNA等位基因分型及點突變檢測的ARMS-PCR方法，依次包括ARMS引物設計、ARMS-PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、根據陽性反應確定基因型的步驟，其特征在于所述特異性ARMS適配引物設計步驟中，引物3’末端終止在待診位點，在上游或下游ARMS引物3’倒數3-4位增加設置兩個連續的堿基錯配，錯配方式為A-T或G-C的互換；所述ARMS-PCR擴增時增加模板mtDNA為常規用量的2～10倍。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述堿基錯配方式為A-T或G-C的互換。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述ARMS適配引物為兩對引物，共用上游 引物，兩條下游引物分別在3'末端與待診位點堿基匹配和錯配，兩條下游引物均在3'末端 倒數3-4位增加兩個連續的堿基錯配。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述ARMS適配引物為兩對引物，共用下游 引物，兩條上游引物分別在3'末端與待診位點堿基匹配和錯配，兩條上游引物均在3'末端 倒數3-4位增加兩個連續的堿基錯配。
5. 如權利要求1 4所述之一的方法，其特征在于ARMS-PCR擴增時增加模板mtDNA 為常規用量的2 IO倍。
6. 如權利要求1 4所述之一的方法在檢測mtDNA基因突變中的應用。
7. 如權利要求1 4所述之一的方法在檢測mtSNPs中的應用。
全文摘要
一種用于mtDNA等位基因分型及點突變檢測的ARMS-PCR方法，特異性ARMS引物設計時，上游引物或下游引物在3’末端倒數3-4位增加設置兩個連續的堿基錯配，錯配方式為A-T或G-C的互換；ARMS-PCR擴增時增加模板mtDNA為常規用量的2～10倍。本發明通過改進ARMS-PCR，使其適用于mtDNA突變或mtSNPs等位基因分型檢測。與現有mtDNA多態性或基因變異檢測技術相比，本發明的方法不僅結果高度可靠，而且操作簡便易行，并極大地加速了分析過程、降低了費用并減少了工作量。
文檔編號C12Q1/68GK101768635SQ20091004241
公開日2010年7月7日 申請日期2009年1月5日 優先權日2009年1月5日
發明者周鋼, 朱敏, 胡維新, 黃河 申請人:中南大學