專利名稱：一種富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備方法，屬于應用 微生物飼料添加劑技術領域。
背景技術：
現今動物生產的經營方式已經從供給消費者所能生產的動物產品轉移到生產消 費者想要的動物產品上來，越來越多的消費者希望不使用促生長抗生素的產品。主要是擔 心使用抗生素來提高動物產品的產量和飼料利用效率最終會導致人產生對抗生素的耐藥 性。為了保證消費者的要求，政府正在通過立法嚴格限制或完全禁止使用促生長抗生素。歐 盟經過激烈的辯論，關于在動物飼料中添加四種抗生素的禁令已經生效。美國的食品和藥 物管理署正考慮在食用動物的生產中限制使用飼料級抗生素。如何尋找抗生素的替代品已 是各國動物營養學家最為關注的問題。其中具有作為抗生素替代品潛力的天然飼料添加劑 葡甘露低聚糖已逐漸被各國動物營養學家關注。大量研究表明，葡甘露低聚糖提供的富含 甘露糖的吸附源能結合細菌，避免它們吸附在腸壁上，能與被吸附的病原菌一起通過腸道， 防止它們在腸道內集結；葡甘露低聚糖具有免疫原性，刺激機體免疫應答，發揮免疫調節作 用，減緩抗原的吸收，增加抗原的效價，從而增強動物體的細胞和體液免疫反應；葡甘露低 聚糖能調控動物的胃腸道微生態環境，促進有益菌的生長和繁殖，抑制有害物質在腸道的 粘附和定植，維持正常的腸道群。葡甘露低聚糖在提高動物的生產性能的同時，作為一種天 然的飼料添加劑，不會帶來污染、耐藥性和殘留等問題，作為抗生素飼料添加劑的替代品， 將有廣闊的應用前景。釀酒酵母用作飼料補充料可促進反芻動物生長，隨著畜牧業的日益 發展，酵母菌被開發成多種形式的產品，目前飼料酵母作為良好的蛋白原料被應用于各種 動物。葡甘露聚糖是魔芋塊莖的主要成分，目前，雖然研究者對如何從魔芋精粉中酶法 提取甘露寡糖的制備方法進行了研究，但由于酶解需要的β -甘露聚糖酶活力較低，生產 成本高，不能大規模的用作飼料添加劑，而且生產的葡甘露寡糖需要經過后續精制，工藝繁 瑣，沒有充分利用酶解過后所產生的葡萄糖和甘露糖，同時生產甘露寡糖和釀酒酵母，將其 應用于飼料添加劑領域。
發明內容
本發明目的是，利用魔芋精粉這種富含葡甘露聚糖的廉價原料，應用微生物酶工 程技術，酶法生產甘露寡糖，然后利用釀酒酵母對葡甘露低聚糖生產過程中產生的葡萄糖 和甘露糖進行發酵，最后將發酵液冷凍干燥，得到即含葡甘露低聚糖又含釀酒酵母的新型 的飼料添加劑，應用于畜禽養殖業，替代抗生素，具有優良效果。本發明的方法通過對現有 過程中的一些方法和實驗參數加以改進，可以不需要購買額外昂貴的化學試劑就可以進行 大規模的工廠化生產，節約了成本，提高了生產效率；同時化學添加試劑的減少增強了飼料 的環保作用，降低這些化學試劑對動物可能存在潛在的不利影響，本發明幾乎用純生物制作工藝完成，幾乎不會對動物體產生不利的影響。本發明目的通過以下技術方案得以實現。一方面，本發明提供一種動物飼料添加劑，它包括質量含量大于20%以上的葡 甘露低聚糖；5X105cfu/g以上的釀酒酵母。另一方面，本發明提供一種生產富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備 方法，該方法包括以下步驟(a)、黑曲霉MA-56酸性β -甘露聚糖酶粗酶液的制備稱取固體酶樣1份，加入 16-20份蒸餾水，40-50°C水浴抽提1-池，過濾，得到酸性β -甘露聚糖酶粗酶液，適當稀釋， 使酶活力達100IU/mL。其中酸性β-甘露聚糖酶固體酶的制備可采用已有技術，如2009年 7月15日公開的CN101481674A說明書第5頁。該專利作為全部應用作為本發明的一部分。 黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56，本申請人于2008年10月M日保藏于北京市朝 陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為 CGMCC No. 2722。(b)、魔芋精粉酶解液的獲得，它包括以下步驟(1)、pH3. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉21. 74g，檸檬酸 14. 63g，加入800mL蒸餾水加熱溶解，最后用容量瓶定容至1000mL。(2)、魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到50-60°C，加入魔芋精粉 (過40-140目篩)配制100-180g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機100-120r/min不 斷攪拌，避免魔芋精粉結成包塊。(3)、葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液加入步驟O)的魔 芋精粉溶液，加酶量為30-40IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為50-65°C，酶解時間為4_6h。獲 得魔芋精粉酶解液。酶解過后，酶解液的糖中既含有20-25%的葡萄糖和甘露糖單糖，也含 有75-80%葡甘露低聚糖。(c)、釀酒酵母發酵液的獲得。釀酒酵母于2010年7月購自中國工業微生物菌種 保藏管理中心，保藏編號CICC31015。它包括以下各級培養基的配制①斜面種子培養基去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L，自然pH，經 0. IMpa 滅菌 20min ；②釀酒酵母斜面種子制備將釀酒酵母劃線接種在步驟(4)①斜面種子培養基 上，于下恒溫培養5d后，放置4°C冰箱內保存，備用；(d)、發酵培養。包括以下步驟；①酵母菌發酵培養基的制備將步驟(b)中獲得的魔芋粉酶解液不添加任何其他 營養成分，自然pH，經0. IMpa滅菌20min。②酵母菌發酵生產將步驟②中斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為IXlO7-IO8 個/ml的細胞懸浮液，按2-5% (ν/ν)接種比例接入③中的菌種發酵培養基中，置搖床 200r/min，培養時間 16h。(e)、冷凍干燥制成成品將步驟(d)得到的發酵液裝入淺盤中，用保鮮膜封口， 置_70°C冰箱預冷2h，于托盤式冷凍干燥機中冷凍干燥48h。最后，把富含釀酒酵母的葡甘 露低聚糖樣品經高壓液相色譜檢測和菌落計數，將葡甘露低聚糖含量達到20%以上，釀酒 酵母5X105cfu/g以上的樣品包裝、封口即成本發明產品。
在一個優選的方式中，還可以在步驟(d)后對發酵液進行薄層層析檢測以葡萄 糖做為標準品，將魔芋精粉酶解液經釀酒酵母發酵前后的樣品進行薄層層析，結果發現未 經過發酵的樣品中的葡萄糖和甘露糖等單糖經釀酒酵母發酵后幾乎已被酵母菌利用完全， 發酵后的樣品中糖類為100%的葡甘露低聚糖。本發明的有益效果是(1)集酶工程技術和發酵工程技術于一體，發明產品具有活菌制劑和雙岐因子的 雙重功能。葡甘露低聚糖含量20-25%，釀酒酵母菌含量5-6X105cfu/g。(2)釀酒酵母的發酵，直接利用魔芋粉酶解液，即充分利用了酶解過程產生的單 糖，又提高了葡甘露低聚糖的含量，還可以使產品中富含釀酒酵母活菌。(3)另外，整個生產過程無需添加其他價格昂貴的試劑，使生產成本較低；特別適 合大規模生產。在本發明的方法中，特別在制備酵母菌發酵培養基的步驟中，不需要添加其 它價格昂貴的輔助化學成分就可以獲得純度較高的制備葡甘露低聚糖，同時除去產品中的 單糖。(4)同時，冷凍干燥出來的產品可作為飼料添加劑直接添加使用，無需增加后提取 工藝，更進一步降低了生產成本。
圖1為葡萄糖作為標準品，將葡甘露低聚糖酶解液經釀酒酵母發酵前后的樣品進行薄 層層析圖，其中ι為葡萄糖樣品；2為發酵前樣品；3為發酵后樣品。
具體實施例方式通過以下具體實施例，對本發明作進一步的具體說明，但應該理解本發明并不受這些內容所限止。實施例1 β -甘露聚糖酶粗酶液的生產制備本例β -甘露聚糖酶按以下步驟制備(1)黑曲霉菌株 MA_56 (黑曲霉(Aspergillus niger)菌株 MA-56，于 2008 年 10 月24日保藏于北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. 2722)各級培養基的配制包括，①斜面種子培養基去皮馬鈴薯200g/l，蔗糖20g/l，瓊脂20g/l，自然pH，經 0. IMpa 滅菌 20min ；②固體種子培養基300ml三角瓶中裝入由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份 80 19 1比例配制而成的培養基10g，按與固形物重量1 1比例加入自來水，攪拌均 勻，經 0. IMpa 滅菌 30min ；③固體生產培養基先將麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份75 23 3比例配制成 固體培養基；再將該固體培養基與水按重量1 1.3比例加水并攪拌均勻裝入布袋中，經 0. IMpa滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤中，發酵物料厚度為2-3cm ；(2)斜面種子制備將黑曲霉菌株MA-56劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養基 上，于觀°C下恒溫培養5d后，放置4°C冰箱內保存，備用；(3)固體種子制備將步驟( 斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為IXlO7-IO8 個/ml的孢子懸浮液后，吸取2ml接入步驟(1)②固體種子培養基中，于下恒溫培養3d，再與無菌蒸餾水按重量1 100比例攪拌混合后，用雙層紗布在無菌條件下過濾，得到 濃度為IX IO7-IO8個/ml固體種子孢子懸浮液，待用；(4)發酵生產將步驟(3)固體種子孢子懸浮液與步驟(1)③固體生產培養基按 重量份20 100比例混合均勻后，置曲房中發酵培養5 得飼用β-甘露聚糖酶酶 曲；(5)酶曲的后處理與質量檢測將步驟(4)酶曲置40°C鼓風條件下烘干10h、粉 碎、過80目篩，得酶干曲；將經飼用β-甘露聚糖酶活力檢測達到IX IO5-L 3 X 105U/g的酶 干曲包裝、封口即成產品。(6)稱取步驟(5)中的固體酶樣1份，加入18份蒸餾水，45°C水浴抽提池，板框過濾，得到酸性β-甘露聚糖酶粗酶液，適當稀釋，使酶活力達100IU/mLo實施例2 富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖的生產制備1本例富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖按以下步驟制備(1)ρΗ3. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制稱取磷酸氫二鈉21. 74g，檸檬酸 14. 63g，加入800mL蒸餾水加熱溶解，最后用容量瓶定容至1000mL。(2)魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到50°C，加入魔芋精粉配制 100g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機lOOr/min不斷攪拌，避免魔芋精粉結成包塊。(3)葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液(實施例1中的步 驟6獲得的)加入步驟O)的魔芋精粉溶液，加酶量為30IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為 50 0C，酶解時間為4h。酶解過后，經高壓液相色譜檢測，酶解液單糖中含有21 %的葡萄糖和 甘露糖，79%的葡甘露低聚糖(質量百分比)。(4)釀酒酵母(釀酒酵母于2010年7月購自中國工業微生物菌種保藏管理中心， 保藏編號CICC310M)各級培養基的配制包括，①斜面種子培養基去皮馬鈴薯200g/L，蔗 糖20g/L，瓊脂20g/L，自然pH，經0. IMpa滅菌20min ；②菌種發酵培養基魔芋精粉酶解液 不添加任何其他營養成分，自然PH，經0. IMpa滅菌20min。(5)釀酒酵母斜面種子制備將釀酒酵母劃線接種在步驟(4)①斜面種子培養基 上，于觀 30°C下恒溫培養5d后，放置4°C冰箱內保存，備用。(6)酵母菌發酵生產將步驟( 斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為1 X IO7個 /ml的細胞懸浮液，按2% (ν/ν)接種比例接入(4)②中，置搖床200r/min，培養時間 16h。(7)薄層層析檢測以葡萄糖作為標準品，將葡甘露低聚糖酶解液經釀酒酵母發 酵前后的樣品進行薄層層析，結果發現樣品中的單糖經釀酒酵母發酵后已基本利用完全， 樣品中為100%的葡甘露低聚糖。(見圖1 ;1為葡萄糖樣品；2為發酵前樣品；3為發酵后 樣品)(8)冷凍干燥制成成品將步驟(6)得到的發酵液裝入淺盤中，用保鮮膜封口， 置_70°C冰箱預冷2h，于托盤式冷凍干燥機中冷凍干燥48h。最后，把富含釀酒酵母的葡甘 露低聚糖樣品經高壓液相色譜檢測和菌落計數，獲得的葡甘露低聚糖含量為20% (質量百 分比)，釀酒酵母菌含量5. 2X105cfu/g的樣品包裝、封口即成本發明產品。實施例3 富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖的生產制備)
其余工藝步驟按實施例2 ；本例中與實施例2中的不同在于步驟( 魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到60°C，加入魔芋精 粉配制180g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機120r/min不斷攪拌，避免魔芋精粉結成 包塊。步驟( 葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液加入步驟(2) 的魔芋精粉溶液，加酶量為40IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為65°C，酶解時間為他。酶解 過后，酶解液單糖中含有23%的葡萄糖和甘露糖，77%的葡甘露低聚糖。步驟(6)酵母菌發酵生產將步驟(5)斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為 IX IO8個/ml的細胞懸浮液，按5% (ν/ν)接種比例接入(4)②中，置搖床200r/min， 培養時間16h。最后經過檢測發現25%的葡萄糖和甘露糖全部轉換成葡甘露低聚糖。最后獲得的混合物質中葡甘露低聚糖含量為23% (質量百分比)，釀酒酵母菌含 量為 6. 0X105cfu/go實施例4 富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖的生產制備其余工藝步驟按實施例2 ；本例中與實施例2中的不同在于步驟( 魔芋精粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到55°C，加入魔芋精 粉配制140g/L的魔芋精粉溶液，期間用高速攪拌機120r/min不斷攪拌，避免魔芋精粉結成 包塊。步驟( 葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將β -甘露聚糖酶粗酶液加入步驟(2) 的魔芋精粉溶液，加酶量為40IU/g魔芋精粉，酶解水浴溫度為65°C，酶解時間為他。酶解 過后，酶解液單糖中含有25%的葡萄糖和甘露糖，75%的葡甘露低聚糖。步驟(6)酵母菌發酵生產將步驟(5)斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為 IX IO8個/ml的細胞懸浮液，按5% (ν/ν)接種比例接入(4)②中，置搖床200r/min， 培養時間16h。最后經過檢測發現25%的葡萄糖和甘露糖全部轉換成葡甘露低聚糖。最后獲得的混合物質中葡甘露低聚糖含量為23%，釀酒酵母菌含量為 5. 0X105cfu/g。
權利要求
1.一種動物飼料添加劑，其特征在于，它包括質量含量大于20%以上的葡甘露低聚 糖；5X105cfu/g以上的釀酒酵母。
2.如權利要求1所述的飼料添加劑，其特征在于，所述的葡甘露低聚糖的質量含量大 于 25%。
3.—種生產權利要求1所述的飼料添加劑，包括以下方法(a)、制備酶活力100IU/mL的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶粗酶液(b)、魔芋粉酶解液的制備，它包括以下步驟(1)ρΗ3.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 的配制稱取磷酸氫二鈉21. 74g，檸檬酸14. 63g，加入SOOmL蒸餾水加熱溶解，最后用容量 瓶定容至IOOOmL ；⑵魔芋粉水溶液的配制將步驟(1)的緩沖液加熱到50-60°C，加入魔 芋粉配制100-180g/L的魔芋粉溶液，期間用高速攪拌機100-120r/min不斷攪拌，避免魔芋 粉結成包塊；C3)葡甘露低聚糖酶解樣品的制備將步驟(a)中的甘露聚糖酶粗酶液加 入步驟( 的魔芋粉溶液，加酶量為30-40IU/g魔芋粉，酶解水浴溫度為50-65°C，酶解時間 為 4-6h ；(c)、酵母菌發酵培養基的制備將步驟(b)中獲得的魔芋粉酶解液不添加任何其他營 養成分，自然PH，經0. IMpa滅菌20min ；(d)、將酵母菌種子用無菌蒸餾水制備成濃度為IXIO7-IO8個/ml的細胞懸浮液，按 2-5% (ν/ν)接種比例接入(c)中的菌種發酵培養基中，置搖床200r/min，培養時間 16h ；(e)、冷凍干燥制成成品將步驟(d)得到的發酵液裝入淺盤中，用保鮮膜封口， 置-70°C冰箱預冷2h，于托盤式冷凍干燥機中冷凍干燥48h ；最后，把富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖樣品經高壓液相色譜檢測和菌落計數，將葡甘 露低聚糖含量達到20%以上，釀酒酵母5X105cfu/g以上的樣品包裝、封口即成明產品。
4.如權利要求3所述的方法，其中黑曲霉為包藏號為CGMCC2722的菌株。
5.如權利要求3所述的方法，其中酵母菌為保藏編號CICC31015的菌株。
6.如權利要求1-5之一所述的方法，其中，步驟(a)還包括以下步驟(1)、黑曲霉各級培養基的配制包括，①斜面種子培養基去皮馬鈴薯200g/l，蔗糖 20g/l，瓊脂20g/l，自然pH，經0. IMpa滅菌20min ；②固體種子培養基300ml三角瓶中裝入 由麩皮、豆粕和魔芋粉按重量份80 19 1比例配制而成的培養基10g，按與固形物重量 1 1比例加入自來水，攪拌均勻，經0. IMpa滅菌30min;③固體生產培養基先將麩皮、豆 粕和魔芋粉按重量份75 23 3比例配制成固體培養基；再將該固體培養基與水按重量 1 1.3比例加水并攪拌均勻裝入布袋中，經0. IMpa滅菌30min，冷卻后均勻置于曲盤中， 發酵物料厚度為2-3cm ；O)、斜面種子制備將黑曲霉菌株MA-56劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養基上，于下恒溫培養5d后，放置4°C冰箱內保存，備用；(3)、固體種子制備將步驟( 斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為IXlO7-IO8A/ ml的孢子懸浮液后，吸取2ml接入步驟(1)②固體種子培養基中，于下恒溫培養3d，再 與無菌蒸餾水按重量1 100比例攪拌混合后，用雙層紗布在無菌條件下過濾，得到濃度為 1 X IO7-IO8個/ml固體種子孢子懸浮液，待用；份20 100比例混合均勻后，置曲房中發酵培養5 得飼用β-甘露聚糖酶酶曲；(5)、酶曲的后處理與質量檢測將步驟(4)酶曲置40°C鼓風條件下烘干10h、粉碎、過 80目篩，得酶干曲；將經飼用β-甘露聚糖酶活力檢測達到IX IO5-L 3 X 105U/g的酶干曲 包裝、封口即成產品；(6)、稱取固體酶樣1份，加入18份蒸餾水，45°C水浴抽提池，板框過濾，得到酸性 β -甘露聚糖酶粗酶液，適當稀釋，使酶活力達100IU/mL。
全文摘要
本發明提供一種動物飼料添加劑，其特征在于，它包括質量含量大于20％以上的葡甘露低聚糖；5×105cfu/g以上的釀酒酵母。在一個優選的方式中，所述的葡甘露低聚糖的質量含量大于25％。同時本發明一種生產富含釀酒酵母的葡甘露低聚糖飼料添加劑的制備方法。本發明集酶工程技術和發酵工程技術于一體，發明產品具有活菌制劑和雙岐因子的雙重功能，同時該方法生產成本低廉、簡單；另外采用冷凍干燥出來的產品可作為飼料添加劑直接添加使用，無需增加后提取工藝，更進一步降低了生產成本。
文檔編號C12P19/14GK102048029SQ20101025143
公開日2011年5月11日 申請日期2010年8月10日 優先權日2010年8月10日
發明者李艷麗, 柳永, 許少春, 許堯興 申請人:浙江省農業科學院