專利名稱：一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種氨基酸鹽的制備方法，尤其是涉及一種L-鳥氨酸- α -酮戊二酸鹽的制備方法。
背景技術：
L-鳥氨酸- α -酮戊二酸鹽是廣泛使用于醫藥保健的原料，是一種肌肉能量合劑， 同時也能幫助加速生長激素缺乏的孩子生長和加速外傷患者的創傷愈合。制備L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽的方法主要是L-鳥氨酸與α酮戊二酸直接成鹽反應后結晶。而由于L-鳥氨酸制備方法的不同，可以由不同途徑來制備L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽。目前，國內外對制備L-鳥氨酸的文獻報道很多，L-鳥氨酸的制備方法主要有三種化學法、發酵法、酶解法。化學法目前工業上最常用的生產方法是采用化學水解L-精氨酸制備L-鳥氨酸，1966年shell int. Rearsch采用丙稀酸和氰化鈉作為主要原料合成L-鳥氨酸。 (GB1020492,1966)。發酵法用腸桿菌中的某些菌類如 Escherichia coli，Aerobacter aerogenes, Proteusrettgeri和Proteus mirabili的突變菌株，進行發酵生產L-鳥氨酸，發酵液中 L-鳥氨酸最高為 15mg/ml, (GB1098348,1968 ；US39668072,1972)，Shibuya 等利用 Arthrobacter citreus23_2A的突變株發酵生產L-鳥氨酸，發酵72h，產率為35. 2g/L。酶解法沈淑英等用糞鏈球菌ATCC8043，糞產堿桿菌ATCC21400，糞鏈球菌S-43游離細胞轉化底物L-精氨酸制備L-鳥氨酸，轉化率95-100 %，提取收率為85-90 % (天津微生物，1981，3 :28-38)。1995年，M Kyriakos等利用從動物肝臟中提取的精氨酸酶水解L-精氨酸用于L-鳥氨酸鹽的制備(USM05761，1995)。因為上述L-鳥氨酸酶法生產過程都是利用游離細胞轉化底物L-精氨酸，所以轉化液中會含有少量菌體蛋白和其他雜質，不利于產物的分離純化；且轉化要去除菌體，降低產物得率，導致生產成本增加。
發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種操作簡單、精氨酸轉化率高、產量高的固定化酶生產L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽的方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種L-鳥氨酸- α -酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂，用碳酸鉀溶液浸泡6-1 后過濾，再將濾出的三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂與碳酸鉀、溴化氫按重量比為1 (0.1-0.6) (0.2-0. 5)配制成溶液，于冰浴中反應5-60min，調節pH值至7_10，再加入精氨酸酶，使其與三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量比為(0.002-0.01) 1，于l-10°c反應12-4他，洗滌后用飽和食鹽水浸泡0. 5-3h，再利用去離子水洗凈至溶液中檢測不出氯離子，即得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按重量比 1 (1-3) (0.004-0.02)混合，加入去離子水中，攪拌，采用乙酸調節PH值至9. 0-9. 4， 在35-40°C下，反應15-1 得固定化酶混懸液；(3)產物提取及精制將步驟( 中的固定化酶混懸液過濾后，向濾液中加α酮戊二酸、活性炭，于20°C 以下攪拌反應5-30min后，過濾，加入醇類，攪拌0. 5_lh，析出L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽， 攪拌3- ，控溫至20°C以下、離心、干燥即得產品。所述步驟(1)中的溶液中含三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量百分濃度為 40-60g/mlo所述步驟⑴中的碳酸鉀為摩爾濃度1-5M的溶液，所述的溴化氫為重量百分濃度 l-4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶為重量百分濃度l_4g/L的溶液。所述步驟(1)中調節pH采用摩爾濃度為0. 05-2M的碳酸氫鈉溶液。所述步驟(1)中洗滌過程是依次利用體積為100_400ml，濃度為0. 05-0. 3M的碳酸氫鈉溶液、0. 5-4M的氯化鈉溶液及去離子水洗滌2-5次。所述步驟⑵中攪拌反應的攪拌速度為70-80rpm，反應終點利用高效液相(HPLC) 控制。所述步驟(3)中加入α酮戊二酸量為[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(調pH 所用的乙酸量)，活性炭的加入量為2-5g/100ml濾液。所述步驟(3)中的濃縮后溶液中L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的重量百分數為 30-33%。所述步驟(3)中的醇類包括甲醇、乙醇或正丙醇。所述步驟(3)中加入醇類后的攪拌反應的溫度為20°C以下。與現有技術相比，本發明具有生產成本低、生產條件溫和、轉化體系中雜質較少、 工藝步驟簡單、生產操作安全等優點，采用本發明生產L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽純度高、 產量高，每升反應溶液中含有300_320g的L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽，α -酮戊二酸的轉化率90%以上。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例1一種酶轉化生產L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)固定化酶的制備原料用量如下所示三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g、精氨酸酶400mg、飽和食鹽水以能浸沒固定酶為準，取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用2M碳酸鉀溶液浸泡12h，過濾，濾干后，加入100ml 2M碳酸鉀溶液，于冰浴下加入IOml溴化氫(2g/ml)于冰浴下反應15min，其中三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂濃度為40g/ml。用冷0. IM碳酸氫鈉洗至pH值至 8. 5，加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分濃度為4g/l)，4°C反應Mh。依次用0. IM碳酸氫鈉、IM氯化鈉，去離子水洗滌3次，每次200ml，再用飽和食鹽水浸泡固定化酶lh，最后利用去離子水將其洗凈至檢測不出氯離子，保存于水中，備用；(2)轉化條件的優化將精氨酸60g、乙酸4. 8g與乙酸錳0. 2g混合，溶于90g去離子水中得到混合液，將步驟(1)中制得的濕固定化酶50. 4g加入混合液中，控制pH值為9. 4，攪拌速度為 70-80rpm，在35-40°C攪拌17h ； α -酮戊二酸轉化率達到90-92%，反應15h，以高效液相控制終點。反應結束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用；(3)產物提取及精制在步驟( 過濾后的濾液中加入19.2ga-酮戊二酸，5g活性炭，20°C以下攪拌 IOmin后，過濾，滴入800g 95 %乙醇，溫度控制在20°C以下攪拌40min，料析出，繼續保溫 3h，降溫至常溫離心，干燥得Og L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽2 1。實施例2(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂40g，用IM碳酸鉀溶液浸泡8h，過濾并濾干后，加入 IOml IM碳酸鉀溶液，于冰浴下加入5ml溴化氫(lg/ml)于冰浴下反應5min，用冷0. 05M碳酸氫鈉洗至PH值至7，加入精氨酸酶溶液400ml (重量百分濃度為lg/Ι)于1°C反應12h。 依次用0. 05M碳酸氫鈉溶液100ml、0. 5M氯化鈉溶液100ml，去離子水IOOml洗滌2次，最后用飽和食鹽水浸泡固定化酶0. 5h，洗凈至溶液中檢測不出氯離子即制得固定化酶，保存于水中，備用；(2)轉化條件的優化將精氨酸60g，乙酸6. 4g與乙酸錳0. 2g混合，溶于90g去離子水中得到混合液，將步驟⑴中制得的濕固定化酶40. 5g加入混合液中，控制pH值為9. 4，在35-40°C攪拌18h， 以高效液相控制終點。反應結束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用；(3)產物提取及精制在步驟( 過濾后的濾液中加入α-酮戊二酸19.2g，6g活性炭，20°C以下攪拌 5min后，過濾，滴入750g 95%乙醇，溫度控制在20°C以下攪拌30min，將料析出，繼續攪拌 4h，離心，干燥得56. 0g, L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽。α -酮戊二酸轉化率達92%。實施例3(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用2M碳酸鉀溶液浸泡12h，過濾并濾干后，加入100ml 2M碳酸鉀溶液，IOml溴化氫(2g/ml)于冰浴下反應15min，用冷0. IM的冷碳酸氫鈉洗至PH值至8. 5，加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分濃度為4g/l)于4°C反應Mh.。依次用0. IM碳酸氫鈉溶液200ml、IM氯化鈉溶液200ml，去離子水200ml洗滌3次，最后用飽和食鹽水浸泡固定化酶lh，洗凈至溶液中檢測不出氯離子即制得固定化酶，保存于水中，備用；(2)轉化條件的優化將精氨酸60g，乙酸7g與乙酸錳0.2g混合，溶于90g去離子水中，將步驟(1)中制得的固定化酶(濕)50. 4g加入混合液中，pH值9. 1，在35-40°C攪拌速度IOOrpm的條件下反應15h;反應結束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用；(3)產物提取及精制在步驟( 過濾后的濾液中加入19.4ga-酮戊二酸，8g活性炭，20°C以下攪拌 IOmin后，過濾，滴入700g95%乙醇，溫度控制在20°C以下攪拌30min，料析出，繼續保溫5h， 離心，干燥得58. 7g L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽，α-酮戊二酸轉化率達92.5%。實施例4(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂60g，用5Μ碳酸鉀溶液浸泡18h，過濾，濾干后，加入 150ml 4M碳酸鉀溶液，20ml溴化氫(4g/ml)于冰浴下反應60min，用冷2M的冷碳酸氫鈉洗至PH值至10，加入精氨酸酶溶液200ml (重量百分濃度為2g/l)于10°C反應48h.。依次用 0. 3M碳酸氫鈉溶液400ml、4M氯化鈉溶液400ml，去離子水400ml洗滌5次，最后用飽和食鹽水浸泡固定化酶3h，洗凈至溶液中檢測不出氯離子即制得固定化酶，保存于水中，備用；(2)轉化條件的優化將精氨酸60g，乙酸7.2g與乙酸錳0.2g混合，溶于90g去離子水中，將步驟(1)中制得的固定化酶(濕)60. 4g加入混合液中，PH值9. 0，在35-40°C攪拌速度200rpm的條件下反應15h;反應結束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用。(3)產物提取及精制在步驟( 過濾后的濾液中加入20. Sga-酮戊二酸，IOg活性炭，20°C以下攪拌 30min后，過濾，滴入800g 95 %乙醇，溫度控制在20°C以下攪拌45min，料析出，繼續攪拌 3h，離心，干燥得M.Og L-鳥氨酸-α酮戊二酸鹽，α-酮戊二酸轉化率達92.4%。實施例5(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用5M碳酸鉀溶液浸泡6h，過濾并濾干后，加入 50ml 5M碳酸鉀溶液，IOml溴化氫(2g/ml)于冰浴下反應35min，用冷0. 05M的冷碳酸氫鈉洗至PH值至7，三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂濃度為60g/ml。加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分濃度為4g/l)于4°C反應Mh。依次用0.05M碳酸氫鈉溶液400ml、4M氯化鈉溶液 IOOml，去離子水200ml洗滌3次，最后用飽和食鹽水浸泡固定化酶lh，洗凈至溶液中檢測不出氯離子即制得固定化酶，保存于水中，備用；(2)轉化條件的優化將精氨酸60g，乙酸6.8g與乙酸錳0. 12g混合，溶于90g去離子水中，將步驟(1) 中制得的固定化酶(濕)30g加入混合液中，pH值為9. 3，在30-35°C攪拌速度IOOrpm的條件下反應15h ；反應結束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用；(3)產物提取及精制在步驟( 過濾后的濾液中加入20g α-酮戊二酸，8g活性炭，α -酮戊二酸的加入量根據[(精氨酸量xO. 96) X 133/174]-(調pH所用的乙酸量)公式計算得到，35_40°C 保溫攪拌IOmin后，過濾，滴入750g 95%的正丙醇，溫度控制在20°C以下攪拌30min，料析出，溫度控制在20°C以下，離心，干燥得54. Og L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽，α -酮戊二酸轉化率達92. 0%。
實施例6一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，該方法包括以下步驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂100g，用碳酸鉀溶液浸泡6-1 后過濾，濾干后加入10L1M的碳酸鉀、20ml重量百分比為lg/ml的溴化氫配制成溶液，于冰浴中反應5min，調節PH值至7，再加入0. 2L重量百分比為lg/L的精氨酸酶，于1°C反應48h，洗滌后用飽和食鹽水浸泡0. 5h，再利用去離子水洗凈至溶液中檢測不出氯離子，即得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按重量比1 1 0.004混合，加入去離子水中，攪拌，采用乙酸調節PH值至9.0，在35°C下，反應1 得固定化酶混懸液；(3)產物提取及精制將步驟O)中的固定化酶混懸液過濾后，向濾液中加α酮戊二酸、活性炭，其中， α酮戊二酸的加入量為[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(調ρΗ所用的乙酸量)，活性炭的加入量為2g/100ml濾液，于20°C以下攪拌反應5min后，過濾，加入甲醇，攪拌0. 5h，析出 L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽，攪拌池，控溫至20°C以下、離心、干燥即得產品。實施例7一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，該方法包括以下步驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂100g，用碳酸鉀溶液浸泡1 后過濾，濾干后加入 12L5M的碳酸鉀、12. 5ml重量百分比為4g/ml的溴化氫配制成溶液，于冰浴中反應60min，調節ρΗ值至10，再加入0. 25L重量百分比為4g/L的精氨酸酶，于10°C反應12h，洗滌后用飽和食鹽水浸泡3h，再利用去離子水洗凈至溶液中檢測不出氯離子，即得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按重量比1 3 0.02混合，加入去離子水中，攪拌，采用乙酸調節PH值至9.4，在40°C下，反應1 得固定化酶混懸液；(3)產物提取及精制將步驟O)中的固定化酶混懸液過濾后，向濾液中加α酮戊二酸、活性炭，其中， α酮戊二酸的加入量為[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(調ρΗ所用的乙酸量)，活性炭的加入量為5g/100ml濾液，于20°C以下攪拌反應30min后，過濾，加入正丙醇，攪拌lh，析出L-鳥氨酸- α -酮戊二酸鹽，攪拌證，控溫至20°C以下、離心、干燥即得產品。
權利要求
1.一種L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂，用碳酸鉀溶液浸泡6-1 后過濾，再將濾出的三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂與碳酸鉀、溴化氫按重量比為1 (0.1-0.6) (0. 2-0. 5)配制成溶液，于冰浴中反應5-60min，調節pH值至7_10，再加入精氨酸酶，使其與三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量比為(0.002-0.01) 1，于1-10°C反應12-4 ，洗滌后用飽和食鹽水浸泡 0. 5-3h，再利用去離子水洗凈至溶液中檢測不出氯離子，即得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按重量比1 (1- (0. 004-0. 02) 混合，加入去離子水中，攪拌，采用乙酸調節pH值至9. 0-9. 4，在35-40°C下，反應15-1 得固定化酶混懸液；(3)產物提取及精制將步驟O)中的固定化酶混懸液過濾后，向濾液中加α-酮戊二酸、活性炭，于20°C 以下攪拌反應5-30min后，過濾，加入醇類，攪拌0. 5_lh，析出L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽 2 1，攪拌3-5h，再經降溫至20°C以下、離心、干燥即得產品。
2.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的溶液中含三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量百分濃度為40-60g/ml。
3.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(1)中的碳酸鉀為摩爾濃度1-5Μ的溶液，所述的溴化氫為重量百分濃度l-4g/ml 的溶液，所述的精氨酸酶為重量百分濃度l_4g/L的溶液。
4.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中調節PH采用摩爾濃度為0.05-2Μ的碳酸氫鈉溶液。
5.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中洗滌過程是依次利用體積為100-400ml，濃度為0. 05-0. 3M的碳酸氫鈉溶液、 0. 5-4M的氯化鈉溶液及去離子水洗滌2-5次。
6.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟O)中攪拌反應的攪拌速度為70-80rpm，反應終點利用高效液相(HPLC)控制。
7.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中加入α-酮戊二酸量為[(精氨酸量Χ0. 96) X 133/174]-(調pH所用的乙酸量)，活性炭的加入量為2-5g/100ml濾液。
8.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中反應液L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的重量百分數為30-33%。
9.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的醇類包括甲醇、乙醇或正丙醇。
10.根據權利要求1所述的一種L-鳥氨酸-α -酮戊二酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(3)中加入醇類后的攪拌反應的溫度為20°C以下。
全文摘要
本發明涉及一種L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽的制備方法，通過精氨酸酶轉化生產L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽包括以下步驟(1)固定化酶的制備，(2)轉化條件的優化，(3)產物提取和精制工藝步驟。與現有技術相比，本發明具有生產成本低、生產條件溫和、轉化體系中雜質較少、工藝步驟簡單、生產操作安全、純度高，能合成符合透光要求的合格產品。每升反應溶液中含有300-320g的L-鳥氨酸-α-酮戊二酸鹽，α-酮戊二酸轉化率達90％以上等優點。
文檔編號C12N11/02GK102373245SQ201010256510
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月18日 優先權日2010年8月18日
發明者張建宇, 蘇建勇, 鄭南華 申請人:上海漢飛生化科技有限公司