專利名稱：動物雙歧桿菌及其制備雙歧桿菌發酵飲料的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株動物雙歧桿菌及其在制備雙歧桿菌發酵飲料中的應用，特別涉 及一動物雙歧桿菌菌株及其發酵雪蓮果復合汁制備發酵飲料的工藝。
背景技術：
人體腸道內存在數以百萬億個細菌，這些菌大多數與人和平共處有益而無害， 稱為人體正常菌群。人體腸道菌群的總重量約占人體總重量的1/50 1/60，其中95% 以上是活菌，每天在人體腸道內進行著活躍的生長代謝活動。堪稱人體第六大器官。人 體的營養、消化、生物拮抗、免疫、抗腫瘤、藥物效能和抗衰老等與人體腸道微生物密 切相關。雙歧桿菌是人體消化道菌群中的優勢益生菌之一，自嬰兒出生2 3天開始增 殖，5 7天達高峰，并占絕對優勢。口服抗菌藥物、手術、飲食變化，疾病和衰老等 均能使腸道雙歧桿菌數量發生變化，隨著年齡的增長，歧桿菌數量逐漸減少，體弱多病 的老人腸道內該菌幾乎消失，而健康人雙歧桿菌保持著恒定的數量約108 109CFU/ml。 這反映出人體腸道內雙歧桿菌的數量乃是檢驗人是否健康的指標之一。隨著微生態學的發展和對雙歧桿菌的認識，大量研究證實了雙歧桿菌在人體內 發揮著多種生理活性功能，包括拮抗致病菌，調節腸道菌群平衡，調節免疫，抗癌， 抗腫瘤，延緩衰老等。因此雙歧桿菌在食品及醫學界受到廣泛關注。目前國內外已開發了多種雙歧桿 菌制品。醫藥產品有1)片劑形式，如金雙岐三聯活菌片2)膠囊或沖劑，如膠囊形式的 麗珠腸樂膠囊，沖劑形式的優菌多顆粒、女士優菌多顆粒、龍寶寶益生菌沖劑等。3)液 體制劑如三株口服液、株王常維舒口服液。這些產品在治療腸道菌群失調引起的腹瀉、 慢性腹瀉、抗生素治療無效的腹瀉及便秘的等方面發揮了很大的作用，同時也是某些臨 床疾病的良好的輔助藥物。雙歧桿菌保健品及食品有昂立一號；雙歧桿菌與保加利亞 乳桿菌、嗜熱鏈球菌混合發酵的酸奶，酸豆乳；添加雙歧桿菌代謝產物的食品如日本的 L-乳酸的新型保健糖果等。近年來興起了對于以其它食材為原料，生產雙歧桿菌及其代謝產物或保健食品 的研究。目前還未見以雪蓮果為原料的雙歧桿菌飲品或制劑上市。雪蓮果，學名Smallanthus sanchifalius，別名晶薯、菊薯、神果、地參果。屬
菊科，葵花屬植物，故又稱為菊薯，原產自南美洲的安第斯山脈，是當地印第安人的一 種傳統根莖食品，已有500年歷史。1985年日本琦玉縣引種成功，近年來通過多種途徑 進入中國，目前已在云南、福建、海南、貴州、湖南、湖北、山東、河南、河北引種栽 培成功。生產示范面積逾96公頃。產品多用于出口，部分進入超市。
發明內容
本發明的目的是提供一株動物雙歧桿菌及其在制備雙歧桿菌發酵飲料中的應用。動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01已于2005年04月13日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCM.1353。動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis) 01，其保藏編號為 CGMCC 1353。本發明還提供一種雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料的制備方法，是將動物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animalis) 01 CGMCC 1353活化，擴大培養，接種在含有雪蓮果果漿的液 體中，36-38°C厭氧培養至pH為3.8-4.8，結束發酵，獲得雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料。1上述方法中，動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)01 CGMCC 1353接種前 經過種子活化培養，方法如下所述1) 一代種子的制備將動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis) 01 CGMCC 1353 接種到 MRS 液體培養
基中，在37°C厭氧培養24h_48h得到一代種子。2) 二代種子的制備將一代種子接種在MRS液體培養基中37°C厭氧培養14_16h得到第二代種子。3)三代種子的制備將二代種子接種在MRS培養基中厭氧培養14h得到第三代種子。4)種子擴大培養將步驟3)獲得的第三代種子發酵液，以體積比為3%接種量接種至復合果 汁-MRS液體培養基(制備方法如下所示)進行擴大培養。復合果汁-MRS改良液體培養基的制備復合雪蓮果汁(含雪蓮果果漿的液體)與MRS液體培養基以體積比1 2-2 1 混合，pH7.0，115°C高壓滅菌15-20min。復合雪蓮果汁與MRS液體培養基體積比優選 為 1 1。2上述方法中，所述含雪蓮果果漿的液體按下述方法制備1)雪蓮果清洗切分，在85-100°C水中燙漂滅酶，然后撈出雪蓮果肉，以雪蓮果 肉和水的質量比1 1-5的比例加入水混合打漿，得到雪蓮果漿；2)添加是雪蓮果漿體積的1-10%的脫脂復原乳和是雪蓮果漿體積的1-8%西紅 柿汁，混合均質后，得到混合果汁；所述脫脂復原乳的制備方法為10 12.5g脫脂乳加 入1L飲用水，充分攪拌溶解獲得脫脂復原乳；3)在混合果汁里充氮，使氧還電位降至-0.03ev以下，滅菌得到復合雪蓮果汁。所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的步驟1)中，所述燙漂滅酶的溫度優選為 100 °C,時間優選為10分鐘。所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的步驟1)中，所述雪蓮果肉和水的質量比優 選為1 2。所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的步驟2)中，所述脫脂復原乳的添加量優選 為雪蓮果漿體積的5% ；所述西紅柿汁的添加量優選為雪蓮果漿體積的3%。3所述方法中，所述厭氧培養的溫度為37°C ；所述動物雙歧桿菌(Bifidobacteri umanimalis)01 CGMCC 1353 的接種量為 1 X 105-1 X 107cfu/ml,優選為 1 X 106cfu/mlcfo/ml。本發明提供的動物雙歧桿菌，保藏編號為1353，可用于制備雙歧桿菌發酵飲 料。動物雙歧桿菌01具有耐受消化道逆環境，抗氧化等保健功效。本發明還利用上述動物雙歧桿菌，選擇了富含雙歧因子且價格低廉的雪蓮果， 制備了一種雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料，并優化了該雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料的生產工 藝，其中包括雪蓮果復合汁的制備工藝，雙歧桿菌種子的制備工藝。在雪蓮果汁加入輔 料充氮滅菌，突破了傳統乳原料的束縛，配之以營養豐富的脫脂復原乳，并配以西紅柿 輔料制成復合果汁，復合果汁經該株雙歧桿菌的發酵產生乙酸和乳酸，B族維生素等多 種具有重要生理活性的代謝產物，形成了良好的感官和營養品質。實驗證明，成品無菌 灌裝，在4°C條件下貯藏15天內雙歧桿菌活菌數保持在106CFU/mL以上，大腸菌群在 30天內呈陰性。本發明制備的雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料色澤溫和(圖1)，口感好，風味 佳，貨架期較長，具有良好的保健效果的保健飲品。
圖1為本發明的雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料樣品(包裝形式之一)。圖2為基于hsp60序列的動物雙歧桿菌01系統發育樹
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01CGMCC 1353 的獲得一、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01CGMCC 1353 的獲得及其鑒定無菌厭氧取得廣西巴馬長壽老人新鮮糞便25g，置于無菌預還原225mL生理鹽 水中。充分混勻，采用亨蓋特厭氧稀釋技術對樣品進行10倍系列稀釋，選取稀釋倍數為 105、106、107以亨蓋特厭氧滾管法進行分離，置于37°C恒溫箱培養48 72h。挑選菌落 特征為光滑、凸圓、邊緣整齊、乳白色或微帶黃色、質地柔軟的中小菌落，接種于MRS 液體培養基，厭氧培養24 48h，進行革蘭氏染色。挑選具有雙歧桿菌形態等特征的 菌落，再進行需氧和厭氧培養，選取僅在厭氧培養條件下生長的菌落，再一次顯微鏡觀 察，選取形態不規則的疑似雙歧桿菌菌株，進行鑒定。最終獲得一株菌株命名為01。對菌株01進行生理生化與hsp60序列鑒定。GroEL (Hsp60)是分子伴侶家族中 一類，Hsp60廣泛存在于原核生物，真核動植物中。其基因序列具有高度保守性。被用 于各物種間親緣關系的分析。有研究表明雙歧桿菌的16S序列非常接近，而hsp60的序 列在雙歧桿菌各種之間差異較大，能夠更好的區分雙歧桿菌所屬種。01菌株生理生化檢 測結果見表2，動物雙歧桿菌01的hsp60基因序列鑒定方法如下1、基因組的提取1)雙歧桿菌總DNA的提取基因組提取試劑盒(北京三博志遠生物技術有限責任公司)提取雙歧桿菌總 DNA。2、目的片段的擴增1)簡并引物
H60F 5 ‘ -GG (ATGC) GA (CT) GG (ATGC) AC (ATGC) AC (ATGC) AC (ATGC) GC (ATGC) AC (ATGC) GT-3 ‘H60R 5 ‘ -TC (ATGC) CC (AG) AA (ATGC) CC (ATGC) GG (ATGC) GC (CT) TT (ATGC) AC (ATGC) GC-3 ‘引物的合成由上海英俊生物技術有限公司完成。2)PCR反應體系20u 1 雙蒸水14.25ul ； DNTP 2.5ul ；上游引物l.Oul ；下游引 物 l.Oul ； Teq 酶 0.25ul ；模板 l.Oul ；PCR 反應程序初始變性 95°C，5min。退火 46°C，30s ；延伸 72°C，lmin ； 30 個循環；終延伸72°C，lOmin。3、目的片段序列測定與系統發育樹構建 將PCR反映體系混合物送至測序公司測序，動物雙歧桿菌01的hsp60基因序列 如序列表中序列1所示，將測序得到的hsp60序列與基因bank中序列進行比對，用得到 被測菌株與模式菌株保守序列的相似度。以seqnconverter軟件轉換序列格式，MEGA3.0軟件構建系統發育樹。圖2顯示了動物雙歧桿菌01基于hsp60基因序列的 系統發育樹。雙歧桿菌現有報道的菌種有32種。我們的01菌株在系統發育樹中與如雙 歧桿菌及動物雙歧桿菌在同一個分支上，有人認為乳雙歧桿菌為動物雙歧桿菌的一個亞 種。另有試驗結果證明01菌株的16SrDNA序列更接近動物雙歧桿菌。結合生理生化鑒 定結果，將01菌株鑒定為動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)。動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01已于2005年04月13日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCM.1353。表2動物雙歧桿菌01的生理生化特性
權利要求
1.動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)01，其保藏編號為 CGMCC 1353。
2.動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis) OICGMCC 1353在制備雙歧桿菌發酵飲料中的應用。
3.—種雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料的制備方法，是將動物雙歧桿菌(Bifidobacteriuma nimalis) OICGMCC 1353接種在含有雪蓮果果漿的培養基中，36_38°C厭氧培養至pH為 4.2-4.5，結束發酵，獲得雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述含有雪蓮果果漿的培養基是含雪 蓮果果漿的液體與MRS液體培養基混合得到的。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體按下述方法 制備1)雪蓮果清洗切分，在85-100°C水中燙漂滅酶，然后撈出雪蓮果肉，以雪蓮果肉和 水的質量比1 1-5的比例加入水混合打漿，得到雪蓮果漿；2)添加是雪蓮果漿體積的1-10%的脫脂復原乳和是雪蓮果漿體積的1-8%西紅柿 汁，混合均質后，得到混合果汁；3)在混合果汁里充氮，使氧還電位降至-0.03ev以下，滅菌得到含雪蓮果果漿的液體。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的 步驟1)中，所述燙漂滅酶的溫度為100°C，時間為10分鐘。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體制備方法 的步驟1)中，所述雪蓮果肉和水的質量比為1 2。
8.根據權利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體 制備方法的步驟2)中，所述脫脂復原乳的添加量是雪蓮果漿體積的5% ；所述西紅柿汁 的添加量是雪蓮果漿體積的3% ；所述含雪蓮果果漿的液體與MRS液體培養基混合的體 積比例是2 1-1 2，優選為1 1。
9.根據權利要求4-8中任意一項所述的方法，其特征在于所述厭氧培養的溫 度為37°C ；所述動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)OlCGMCC 1353的接種量為 1 X IO5-I X 107cfu/ml,優選為1 X 106cfo/ml ；所述脫脂復原乳的制備方法為10 12.5g脫 脂乳加入IL飲用水，充分攪拌溶解獲得脫脂復原乳。
10.權利要求3-9中任意一項所述的方法制備的雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料。
全文摘要
本發明公開了動物雙歧桿菌及其在制備雙歧桿菌發酵飲料的應用。該動物雙歧桿菌為動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)01，其保藏編號為CGMCC 1353。動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)01CGMCC 1353可用于制備雙歧桿菌發酵飲料。本發明制備的雪蓮果雙歧桿菌發酵飲料色澤溫和(圖1)，口感好，風味佳，貨架期較長，具有良好的保健效果的保健飲品。
文檔編號C12N1/20GK102010845SQ20101029489
公開日2011年4月13日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者劉國榮, 旭日花, 李平蘭, 王洋 申請人:中國農業大學