豬藍耳病病毒與疫苗及二者的生產方法

專利名稱：豬藍耳病病毒與疫苗及二者的生產方法
技術領域：
本發明屬于獸用生物制品技術領域，涉及豬藍耳病病毒與疫苗及二者的生產方 法。
背景技術：
豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征，是一種危害養豬業的病毒性傳染病。2006年 夏秋季，我國南方部分省份發生豬“高熱病”疫情，農業部積極組織科研人員聯合攻關，確定 豬藍耳病變異病毒為主要病原，定名為“高致病性豬藍耳病”。直至今日，疫病形勢依然嚴 峻，同其他病毒性疾病一樣，目前尚無有效的治療性藥物用于藍耳病的治療，免疫接種是防 制該病的最有效方法，目前商品化的藍耳病疫苗主要是由經典株制備的弱毒苗和由變異株 制備的滅活苗。而這兩種疫苗生產的關鍵點就是作為抗原的病毒的生產。病毒株生長的培 養條件對于獲得該株系的所希望的高產量來說具有重大意義。為了最大化所想要的病毒的產量，系統和培養條件都必須特定地適合于提供對于 產生所想要的病毒來說有利的環境。中國專利CN101307304A公開了利用Marc_145細胞生產藍耳病病毒JXAl-R株的 方法，其采用的方法是傳統的轉瓶工藝。現有的藍耳病病毒大規模生產采用轉瓶培養生產 的傳統培養模式，有如下缺點(1)作坊式生產，勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細 胞生長的表面積小；(2)細胞生長密度低，產量低；(3)收獲病毒液后，后續混合，存在批間 差，均一性不好；(4)培養時各項監測和控制環境條件受到限制等。上述缺點造成了藍耳病 病毒滴度不高，限制了產品的產量、質量的提高和生產成本的降低。因此，本領域中仍迫切 需要能夠進一步改善生產藍耳病病毒疫苗的方法。

發明內容
本發明主要目的是提供一種藍耳病病毒及疫苗的生產方法，包括如下步驟1)微載體生物反應器中，加入1.5X107 4. 5X107Cells/g微載體的傳代細胞及 細胞生長液，啟動細胞吸附程序，使微載體與傳代細胞充分結合后，啟動細胞培養程序，培 養傳代細胞；2)上述傳代細胞培養至6. 0X109cells/L 2. 6X101Qcells/L時換用細胞維持 液，按照感染復數為Μ. 0. I. = 0. 0001 1. 5接種豬藍耳病病毒，啟動病毒吸附程序，使病 毒與微載體上的細胞吸附完全后，換用病毒培養程序，擴增豬藍耳病病毒；3)生物反應器中收獲豬藍耳病病毒液；4)收獲的病毒液加入滅活劑，滅活后加入佐劑、乳化劑，制得豬藍耳病滅活疫苗； 收獲的病毒液加入凍干保護劑進行凍干，制得豬藍耳病活疫苗。、優選地，本發明所述的生物反應器為微載體懸浮培養生物反應器。更優選地，本發明所述的生物反應器為潮汐式微載體懸浮培養生物反應器。優選地，所述微載體為片狀、球形或網狀。
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優選地，所述的微載體的成分為聚酯、明膠或多糖。更優選地，所述的微載體為網狀的聚酯纖維，優選地，所述的微載體的添加量為40 75g/L。優選地，本發明所述的生物反應器為潮汐式生物反應器的程序載體上下運行頻 率為0 lOmm/s，培養液面在載體瓶中上下端點停留時間為O 2min。優選地，本發明所述的步驟3)中所述的豬藍耳病病毒液的體積為2. 5L 1000L。優選地，本發明所述制苗用細胞為CL2621細胞、MA104細胞、Marc_145細胞或其他 傳代細胞株。優選地，本發明步驟2)中所述細胞生長液，配方為MEM培養基加3% 5%的牛血 清，培養條件為溫度36. 5°C 37. 5°C，pH值調節7. O 8. O，溶氧調節10% 80%，二氧化 碳濃度為0% 10%。。優選地，步驟3)中所述細胞維持液使用MEM培養基加0. 5% 1. 5%的牛血清配 制而成，其培養條件為控制在36. 5°C 37. 5°C，pH調節7. 2 7. 5，溶氧調節25% 80%， 二氧化碳濃度為1% 5%。優選地，本發明步驟3)中所述的收獲病毒液為分批培養收獲。本發明的另一方面為由上述方法制備的豬藍耳病病毒。本發明的又一方面為由上述方法制備豬藍耳病病毒在疫苗生產中的應用。本發明采用把Marc-145細胞接種到生物反應器中，待其長到一定密度后，接種豬 藍耳病病毒液，在生產過程中調節各種控制參數，如PH值、DO值、灌流速度、優化接種病毒 的感染復數(Μ. 0. I.)，同時，還要掌握好接種病毒時細胞的密度和接毒時間等，使病毒在高 密度的生物反應器中高效繁殖，分批培養收獲病毒，并能進一步提高病毒的滴度。技術效果與現有技術相比，本發明的豬藍耳病病毒及疫苗的生產方法，具有以下有益效 果(1)毒價高運用潮汐式微載體懸浮培養技術高密度培養生產的病毒效價比傳統 的轉瓶工藝生產的豬藍耳病病毒效價要高出傳統方法10倍以上。(2)生產規模大、單批次產量高目前國內采用攪拌式懸浮培養工藝培養動物細 胞，單臺生物反應器最大規模不超過IOOL ；而本發明采用新的技術參數，運用潮汐式微載 體懸浮培養技術培養動物細胞，單臺生物反應器規模達500L，最大可達1000L，單臺規模提 高5 10倍。(3)分批封閉式培養、收獲病毒本發明的方法可以全封閉生產，自動換液，連續 收獲方式收集病毒液，減少了污染的機率，產品質量均一穩定，批間差異小。本發明方法制 備的細胞接種量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗 的免疫能力。本發明方法解決了傳統工藝僅能控制溫度和轉速，不同批次質量差異大、批間 差異大的問題。本發明方法，可直接線性放大用于生產。(4)生產成本相對較低、產品質量高且穩定傳統轉瓶生產工藝生產的豬藍耳病 病毒效價僅為108 5TCID5(l/ml，每ml的生產成本為3元，而本發明工藝生產的豬藍耳病病毒 效價可達109_5TCID5cZml，每ml的生產成本為0. 5元，產品成本下降6倍，質量提高提高10 倍(以毒價計)。
(5)操作方便、操作空間小本發明方法中采用的載體為網狀的聚酯纖維，具有親 水性和生物無害性，Ig載體可提供2400cm2的貼壁面積，在同樣的空間內極大的增大了細胞 的貼壁面積，增加了細胞生長的密度，細胞數可達到1.0X109cells/g微載體以上，其效能 為傳統轉瓶培養系統的數十倍，可以節省許多成本及人力。本發明500L工作體積僅需20m2 的操作區域，僅需2人就可完成全部操作，而傳統工藝需要2000個大方瓶或轉瓶，最少需要 600m2的操作區域，最少需要100人才能完成。采用本發明方法，解決了傳統轉瓶生產時單 批產量不高、批間差異大、產品質量不穩定、勞動強度大、生產成本高等問題。(6)工藝參數控制精確本發明運用潮汐式微載體懸浮培養技術生產時可控參數 有溫度、PH值、溶氧量、二氧化碳濃度、載體濃度，可實現在線監測的參數有葡萄糖、乳酸和 銨離子濃度，批次質量穩定，而傳統轉瓶培養工藝僅能控制溫度和轉速，不同批次質量差異 大。(7)本發明利用生物反應器，解決抗原濃度低、生產成本高、勞動強度大的問題，而 且能連續培養、占地小、生產規模大、無攪拌式懸浮培養時對細胞形成的剪切力、無氣泡產 生、對細胞傷害小。綜上所述，本發明通過優化的方法使用微載體懸浮生物反應器系統培養的藍耳病 病毒數量和滴度顯著高于轉瓶培養10 100倍，因此在制備疫苗的后工藝中，不但提高了 疫苗產量，也可大量減少殘余細胞宿主蛋白、殘余細胞DNA、殘余牛血清等異源物質的含量， 進一步提高了疫苗接種的安全性。


圖1為細胞接種1天時微載體上的顯微照片；圖2為細胞培養5天時微載體上的顯微照片；圖3為病毒接種3天時微載體上的顯微照片；圖4為潮汐式微載體懸浮培養生物反應器結構示意圖。
具體實施例方式本發明實施例中使用了潮汐式微載體懸浮培養生物反應器，其他類型的微載體懸 浮培養生物反應器，如攪拌式、旋轉式或灌注式微載體懸浮培養生物反應器，均可以使用 本發明之方法大規模生產豬藍耳病病毒或疫苗。優選地，本發明使用潮汐式微載體懸浮培 養生物反應器，可以提高培養時的培養基和溶解氧的供應，無氣泡并且剪切力小，對細胞傷害小。本發明實施例中采用的生物反應器為潮汐式生物反應器。結構示意圖如圖4所 示。其中，各個標記分別為恒溫攪拌系統1，培養基恒溫備料槽體2，自動饋料系統3，恒溫 培養箱4，載體瓶5，微載體6，DO檢測器及pH控制器7，收集器8。培養系統分為兩部份； 一個是載體瓶5，另一個是培養基攪拌袋(槽)。細胞固定在載體瓶，培養基流動于載體瓶 與攪拌槽之間，造成間歇性的暴露與淹沒載體。本發明試驗了載體瓶5體積為0. 5L、2. 5L、 51^、1(^、2(^、5(^、10(^，均能對溫度4!1值、溶解氧、二氧化碳濃度自動控制。本發明的實施 例中載體瓶體積為20L。本發明試驗了如下豬藍耳病病毒株及疫苗的制備方法豬藍耳病病毒強毒株NVDC-JXAl株(保藏號No. 1964保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)、豬藍耳病病病 毒弱毒株NVDC-JXAl-R株(保藏號No. 2467保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)、 ATCCVR-2332株、CH-IR株(保藏號No. 1883保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)及 HBR株(保藏號No. 2657保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)。優選地，本發明實施 例中使用了豬藍耳病病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株及豬藍耳病病毒強毒株NVDC-JXAl株。本發明實施例中，傳代細胞使用了非洲綠猴腎細胞(Marc-145)，其他本領域常用 的傳代細胞如CL2621細胞、MA104細胞，也可用于本發明之方法大規模生產豬藍耳病病毒 或疫苗。本發明所述方法中，在細胞吸附微載體階段與細胞培養階段，啟動了細胞吸附程 序與細胞培養程序，本發明實施例中優化了反應器的控制參數，但本發明方法不僅限于實 施例中的參數，本領域技術人員可以根據本發明提供的技術啟示，根據不同的生物反應器， 調整相應的參數，達到微載體與細胞充分結合后，大量擴增細胞的目的。本發明所述方法中，在病毒吸附微載體上的細胞階段與病毒培養階段，啟動了病 毒吸附程序與病毒培養程序，本發明實施例中優化了反應器的控制參數，但本發明方法不 僅限于實施例中的參數，本領域技術人員可以根據本發明提供的技術啟示，根據不同的生 物反應器，調整相應的參數，達到病毒與細胞及微載體充分結合后，大量擴增病毒的目的。本發明試驗了微載體密度為40 75g/L，加入1.5X IO7 3. 5X IO7Cells/ g微載體的傳代細胞，更優地，本發明實施例中使用的微載體密度為65g/L，細胞密度為 2. 0X107cells/g 微載體。本發明試驗了當傳代細胞的密度達到6. 0X109cells/L 2. 6X101Qcells/L時， 即密度達到初始密度的10 20倍時，換用細胞維持液，起始病毒吸附與培養程序。優選 地，本發明實施例中當細胞密度達到2.0X101(lcellS/L時，換用細胞維持液，啟動病毒吸附
與培養程序。本發明試驗了按照感染復數為Μ. 0. I. = 0. 0001 1. 5接種豬藍耳病病毒，收獲 的豬藍耳病病毒毒價最高，優選地，本發明實施例中使用了 Μ. 0. I. = 0. 001接種病毒，啟動 病毒吸附程序與病毒培養程序，擴增豬藍耳病病毒。本發明收獲培養液，制備豬藍耳病病毒液，采用分批培養收獲病毒液，即將培養物 和培養液一次性裝入反應器內，進行培養，經過一段時間反應后，將整個反應系取出。本發明實施例中疫苗的制備方法為加入甲醛滅活劑，滅活后加入油性佐劑、乳化 劑，制得豬藍耳病病毒滅活苗疫苗。其他常用的滅活方法或滅活劑，如丙內脂，也可用 于制備本發明所述疫苗。本領域其他常用的疫苗制備的佐劑和乳化劑，如異丙肌苷，也可用 于制備本發明所述疫苗。本發明實施例中疫苗的制備方法為加入蔗糖、牛奶等保護劑，凍干 后，制得豬藍耳病病毒活疫苗。為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。實施例1潮汐式微載體懸浮生物反應器大規模生產豬藍耳病病毒及活疫苗本實施例中所用的微載體為聚酯纖維，用于制備藍耳病病毒抗原的病毒株為 NVDC-JXAl-R毒株(保藏號No. 2467保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)，以對藍耳病病毒具有良好敏感性的細胞系非洲綠猴腎細胞(Marc-145細胞)，作為制苗用細胞系，選 用20L載體瓶潮汐式生物反應器。1).細胞的接種與培養先使用細胞生長液為(含5%牛血清MEM培養基，pH值為7. 25)利用轉瓶擴增培 養Marc-145細胞。20L生物反應器中，加入無菌載體濃度1300g，把轉瓶細胞消化分散后以 細胞密度為2.0X107cells/g微載體接入20L生物反應器中，使之與載體結合，微載體和細 胞結合的電子顯微鏡圖如圖1、2、3所示。圖1為細胞接種1天時微載體上的顯微照片；此 時Marc-145細胞培養于載體之上基本貼附完全，細胞形態正常，但細胞密度較小。圖2為 細胞培養5天時微載體上的顯微照片；培養至第6天Marc-145細胞密度較高，緊密貼附于 載體之上，且載體縫隙中也附著有大量細胞。圖3為病毒接種3天時微載體上的顯微照片； 接毒后隨著病毒的增殖細胞病變逐漸加重，先后出現變圓、破碎并從載體上脫落的現象，接 種后第3天細胞大量脫落，破碎附著在微載體上。生物反應器與裝有生長液的37°C恒溫攪拌系統1(容量500L)連接，培養條件為吸 附程序培養液的液面上升速度5mm/s，下降速度3mm/s，液面在反應器上下端點停滯時間 為60s/10s。培養溫度37. 0°C，pH值調節7. 3，溶氧調節65%，二氧化碳濃度調節10%。自運行吸附程序計時，3h后啟動培養程序培養液的液面升降速度均為4mm/s，液 面在反應器上下端點停滯時間為50s/50s。灌注培養5天，培養濕度37. 0°C;采用7.5% (W/ V)NaHCO3自動調節pH值，使值控制在7. 2左右，溶氧為50%，二氧化碳濃度為5%。細胞接 種后按每24h的時間點取載體樣和培養基樣，控制培養液中葡萄糖濃度1000 4500mg/L。2)病毒的接種與培養在20L潮汐式懸浮培養生物反應器中，細胞培養至第5天，Marc-145細胞在生物 反應器內的密度達2. OX 101(lcellS/L，把培養基恒溫備料槽體2中的培養液換成維持液含 有1 %牛血清的標準MEM培養基)，按Μ. 0. I.為0. 001接種藍耳病病毒。運行接毒程序培 養液的液面上升速度4mm/s，下降速度2mm/s，液面在反應器頂部停留55s，底部停留10s，病 毒吸附3h。之后，運行病毒培養程序維持液的液面上升與下降速度均為4mm/s，液面在反 應器頂部停留50s，底部停留50s。培養溫度37. 5°C;采用7. 5% (W/V)NaHCO3自動調節pH， 使PH值維持在7. 2 ；溶氧為30%，二氧化碳濃度為3%。病毒吸附程序結束后，繼續運行細 胞培養程序，此時參數根據二氧化碳濃度利用7.5% (ff/V) NaHCO3自動調節pH值7. 3，溶氧 為45%，二氧化碳濃度為3%。3)病毒的收獲培養至接毒后第3天即收獲病毒液，先對載體瓶運行病毒液排除 程序，使之全部流入恒溫攪拌系統1中，對恒溫攪拌系統中的病毒液，采用50L的自動收集 桶按照5L/min的流速進行收集，-20°C保存。收獲病毒液500L，病毒滴度保持在IO9 5TCID5tl/ ml以上。Marc-145細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器時，細胞培養和病毒增殖情況 基本相同，收獲病毒也的滴度也無明顯差異。4)制苗毒液的檢驗按照高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)檢驗 規程進行。5)配苗、分裝及凍干將檢驗合格的病毒液加入保護劑，充分混勻，定量分裝；分 裝后迅速進行冷凍真空干燥后即得成品。
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6)成品檢驗按照高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)檢驗規程進 行。實施例2潮汐式微載體懸浮生物反應器大規模生產豬藍耳病病毒及滅活疫苗藍耳病病毒液的制備方法同實施例1，毒株選用豬藍耳病病毒強毒株NVDC-JXAl 株。將制備的病毒液按照高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(JXA1株)檢驗規程進 行。經檢驗合格的病毒液按0. 1% V/V比例加入甲醛，混勻，置于4°C滅活48h后，取滅活病 毒液94份(體積份)，加入6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相；取注射用白油94份 (體積份)，加入6份(體積份)司本-80混合，隨加隨攪拌至透明為止，加熱到121°C、壓力 103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混合，混合之比為1 2—起以IOOOrpm乳化 8min，制備滅活油佐劑疫苗。按照實施例2高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(JXA1 株)檢驗規程進行檢驗，符合要求。實施例3懸浮培養工藝與傳統轉瓶培養技術比較1)在IOL轉瓶中生產豬藍耳病接入細胞密度lX105Cells/ml細胞懸液2L，37°C 培養至第2天以Μ. 0. I.為0. 001接毒，病毒吸附Ih后，補加維持液至3L，37°C培養96h收 獲液，-20°C凍存。2)在IOL生物反應器中生產豬藍耳病病毒，方法步驟同實施例1。3)實驗結果Marc-145細胞在IOL轉瓶中培養2d后細胞數能增加3倍，達到 6 X IO8 (3 X 105cells/ml)；在IOL反應器中以65g/L微載體的密度培養時，培養6d后密度能 達到3. OX 101CI(3. OX 106cells/ml)，大規模潮汐式細胞微載體懸浮培養系統與常用轉瓶培 養系統相關生產性能指標進行對比結果如表1所示。表1不同培養系統增殖藍耳病病毒的相關比較
權利要求
一種豬藍耳病病毒的大規模生產方法，其特征在于，包括如下步驟1)微載體生物反應器中，加入1.5×107～4.5×107cells/g微載體的傳代細胞及細胞生長液，啟動細胞吸附程序，使微載體與傳代細胞充分結合后，啟動細胞培養程序，培養傳代細胞；2)上述傳代細胞培養至6.0×109cells/L～2.6×1010cells/L時換用細胞維持液，按照感染復數為M.O.I.＝0.0001～1.5接種豬藍耳病病毒，啟動病毒吸附程序，使病毒與微載體上的細胞吸附完全后，換用病毒培養程序，擴增豬藍耳病病毒；3)在生物反應器中收獲豬藍耳病病毒液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反應器為微載體懸浮培養生物 反應器。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物反應器為潮汐式微載體懸浮培 養生物反應器。
4.根據權利要求3所述的豬藍耳病病毒的大規模生產方法，其特征在于，所述潮汐式 微載體懸浮培養生物反應器的程序為載體上下運行頻率為0 lOmm/s，培養液面在載體瓶 中上下端點停留時間為O 2min。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體為片狀、球形或網狀。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體的成分為聚酯、明膠或多糖。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體添加量為40 75g/L。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述豬藍耳病病毒是豬藍耳病病毒強毒 株、豬藍耳病病毒弱毒株或其他豬藍耳病病毒分離株。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述制苗用細胞為CL2621細胞、MA104細 胞、Marc-145細胞或其他傳代細胞株。
10.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述細胞生長液，配方為MEM 培養基加3% 5%的牛血清，培養條件為溫度36. 5°C 37. 5°C, pH值調節7. O 8. 0，溶 氧調節10 % 80 %，二氧化碳濃度為O % 10 %。。
11.按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中所述細胞維持液使用MEM培 養基加0. 5% 1. 5%的牛血清配制而成，其培養條件為控制在36. 5°C 37. 5°C，pH調節 7. 2 7. 5，溶氧調節25 % 80 %，二氧化碳濃度為1 % 5 %。
12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)豬藍耳病病毒液的體積為 2. 5L 1000L。
13.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中生物反應器收獲方式為分批培養收獲。
14.由權利要求1 13任意一項制備的豬藍耳病病毒。
15.一種豬藍耳病滅活疫苗的大規模生產方法，其特征在于，包括如下步驟由權利要 求1 13任意一項方法制備豬藍耳病病毒，收獲的病毒液加入滅活劑，滅活后加入佐劑、乳 化劑，制得豬藍耳病滅活疫苗。
16.由權利要求15所述的方法制備的豬藍耳病病毒滅活疫苗。
17.—種豬藍耳病活疫苗的大規模生產方法，其特征在于，包括如下步驟由權利要求 1 13任意一項方法制備豬藍耳病病毒，收獲的病毒液加入凍干保護劑進行凍干，制得豬藍耳病活疫苗。
18.由權利要求17所述的方法制備的豬藍耳病活疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種大規模生產豬藍耳病病毒的方法，利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統生產豬藍耳病病毒，將制備病毒用宿主細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐，并將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；在適當培養環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的10～20倍；換用細胞維持培養液，將藍耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；在適當培養環境下培養病毒；連續培養2～3日后，收獲病毒液；經檢驗合格后，將收獲的病毒液于-20℃凍融兩次，滅活純化制備藍耳病滅活疫苗或加入凍干保護劑進行凍干制備藍耳病活疫苗。該方法生產規模大、單批次產量高、生產成本相對較低。
文檔編號C12N7/00GK101979514SQ20101029495
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年3月30日
發明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司